La métabolomique combinée à l'analyse des voies de signalisation BMP-2/Smad élucide les effets améliorateurs des flavonoïdes totaux d'Epimedii Folium - Supplément nutritionnel osseux sur l'ostéoporose postménopausique

Abstrait

L'ostéoporose postménopausique (PMOP) est déclenchée par une carence en œstrogènes. Une quantité insuffisante d’œstrogènes entraîne une résorption osseuse dépassant la formation osseuse, entraînant ainsi une diminution de la masse osseuse. Des études ont confirmé que l'extrait total de flavonoïdes deÉpimedii Folium(TFE) peut améliorer l'ostéoporose, tandis qu'un nutriment osseux constitué de sulfate de chondroïtine (CS) associé au chlorhydrate de glucosamine (GLcN) exerce des effets thérapeutiques sur les maladies liées au métabolisme osseux. L’ostéoporose étant fondamentalement caractérisée par des troubles métaboliques, la combinaison d’un extrait de TFE avec un supplément nutritionnel osseux (TG) peut exercer des effets régulateurs synergiques multi-cibles, offrant ainsi une nouvelle approche pour la prévention et le contrôle des PMOP.

Cette étude a systématiquement exploré les effets et les mécanismes d'amélioration des TG sur les PMOP à travers des expériences in vivo et in vitro combinées à la technologie métabolomique. In vivo, un modèle de rat ovariectomisé (OVX) a été établi par ovariectomie bilatérale. Les effets pharmacodynamiques de la TG sur la PMOP ont été vérifiés sur la base de la coloration histopathologique des os, de la densité minérale osseuse et d'indicateurs physiologiques. De plus, la technologie métabolomique a été utilisée pour quantifier les métabolites urinaires afin d’explorer les biomarqueurs potentiels des PMOP régulés par les TG et les réseaux métaboliques associés. In vitro, les cellules MC3T3-E1 ont été traitées avec du TFE et du TG pour déterminer des doses sûres. Par la suite, une induction ostéogénique a été réalisée et les effets et les mécanismes de la TG sur la différenciation ostéogénique ont été étudiés via une coloration à la phosphatase alcaline (ALP), une coloration à l'Alizarine Red S (ARS) et une analyse par Western blot.

Les résultats pharmacodynamiques ont montré que la TG réduisait la génération d'ostéoclastes et rétablissait de manière significative la densité minérale osseuse et les niveaux d'indicateurs physiologiques. Les résultats de la métabolomique ont indiqué que la TG atténuait la perte osseuse principalement en intervenant dans de multiples voies métaboliques, notamment le métabolisme du nicotinate et du nicotinamide, le métabolisme de l'histidine, le métabolisme de la pyrimidine, le métabolisme du tryptophane, le métabolisme de l'alanine/aspartate/glutamate, le métabolisme des purines, le métabolisme de la vitamine B6 et autres. Des expériences in vitro ont confirmé que TG favorisait la prolifération des ostéoblastes et la différenciation ostéogénique via la voie de signalisation de la protéine morphogénétique osseuse-2 (BMP-2)/des protéines liées à Sma et Mad (Smad). En résumé, TG peut améliorer efficacement le PMOP grâce à un effet synergique multi-cibles. Cette étude fournit une base expérimentale et un support théorique pour l'application clinique du TG.

Mots clés :flavonoïdes totaux deÉpimedii Folium; supplément nutritionnel osseux; l'ostéoporose postménopausique ; métabolomique; BMP-2/Voie de signalisation Smad

 

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1. Introduction

L'ostéoporose (OP) est une maladie osseuse métabolique systémique caractérisée par une diminution de la masse osseuse et de la densité minérale osseuse (DMO), une destruction de la microarchitecture osseuse et une fragilité osseuse accrue. L'ostéoporose postménopausique (PMOP) est le type le plus courant et est associée à une sécrétion réduite d'œstrogènes. La diminution des œstrogènes entraîne une résorption osseuse supérieure à la formation osseuse, entraînant une perturbation de l'homéostasie osseuse [1].

Une étude de prévalence de l'ostéoporose en Chine incluant 20 416 participants a révélé que parmi les personnes âgées de 40 ans ou plus, la prévalence de l'OP était de 5,0 % chez les hommes et de 20,6 % chez les femmes [2]. Une évaluation de la prévalence de l'OP chez les adultes américains âgés de 50 ans ou plus a révélé des taux de prévalence de 16 % chez les hommes et de 29,9 % chez les femmes [3], indiquant une prévalence plus élevée chez les femmes. Cliniquement, les médicaments utilisés pour traiter la PMOP comprennent principalement les analogues de l'hormone parathyroïdienne, les bisphosphonates, les œstrogènes, la calcitonine et les inhibiteurs de RANKL ; cependant, ces médicaments peuvent provoquer des effets indésirables tels que des palpitations, une ostéonécrose de la mâchoire et des maladies cardiovasculaires, ce qui les rend impropres à une utilisation à long terme [4]. En raison du fardeau notable des effets secondaires des médicaments conventionnels, il est devenu urgent d’identifier les options de médecine traditionnelle chinoise (MTC) avec moins d’effets indésirables et adaptées à une gestion à long terme. La MTC est utilisée depuis longtemps pour améliorer l'OP et a reçu une large attention aux niveaux national et international. Des études confirment que plusieurs herbes chinoises telles queÉpimedii FoliumetRhizome Drynaireont des effets significatifs sur l’amélioration de l’OP [5].

Flavonoïdes totaux deÉpimedii Folium(TFE) sont les principaux composants actifs, notamment l'icariine, l'épimédine A et l'épimédine B. Les effets anti-ostéoporotiques deÉpimedii Foliumont été rapportés dans de nombreuses études ; par exemple, l'icariine améliore la différenciation ostéogénique des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BMSC) [6]. L'extrait de TFE peut également améliorer la perte osseuse en augmentant le tissu adipeux brun et en réduisant le tissu adipeux blanc dans la moelle osseuse [7].

 

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Le sulfate de chondroïtine (CS) est un glycosaminoglycane sulfaté et un polysaccharide linéaire composé d'unités disaccharides répétitives contenant de l'acide uronique et de la N-acétylhexosamine [8]. Le chlorhydrate de glucosamine (GLcN) est un amino monosaccharide synthétisé à partir du glucose dans les tissus humains ; il est principalement présent dans le cartilage et le tissu conjonctif synovial et constitue un composant important du cartilage articulaire et de la matrice extracellulaire. Les deux sont couramment utilisés comme compléments alimentaires. ZHENGHX et al. [9] ont rapporté que la CS pouvait réduire les cytokines inflammatoires sériques et inhiber le stress oxydatif ; il peut également réduire l'expression des ostéoclastes en régulant OPG/RANKL, suggérant des actions anti-inflammatoires et antioxydantes et une inhibition de la différenciation des ostéoclastes. Aux États-Unis, le CS est souvent associé au GLcN dans les compléments alimentaires et est principalement utilisé pour réduire la perte de composants matriciels dans l'arthrose [10]. De plus, comme le CS peut induire une différenciation cellulaire, il a été utilisé dans la chondrogénèse et les constructions ostéogéniques (11-12).

Plusieurs études suggèrent que l'extrait de TFE, le CS et le GLcN ont certains effets thérapeutiques sur les maladies liées au métabolisme osseux. Cependant, la question de savoir si un supplément combiné d'extrait de TFE et de nutriments osseux (TG) produit des avantages synergiques dans l'amélioration de l'OP et ses mécanismes reste incertain.

 

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2. Matériels et méthodes

2.1 Animaux

Quarante rats Sprague-Dawley femelles âgés de 8 semaines (180 à 220 g) ont été achetés auprès de Changchun Yisi Experimental Animal Co., Ltd. (licence animale n° SCXK (Ji) -2020-0001). Les animaux ont été hébergés dans un laboratoire SPF à 23 ± 223 \\pm 223 ± 2 degrés et 50% d'humidité, avec libre accès à la nourriture et à l'eau, sous un cycle de lumière de 12 h / 12 h d'obscurité. Les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées par le comité expérimental pour le bien-être et l'éthique des animaux de l'Université agricole de Jilin (acceptation n° . 20240717001).

2.2 Médicaments et réactifs

Epimedii Folium coréenl'herbe brute a été achetée auprès de Senyu Chinese Medicinal Materials Co., Ltd. du comté de Tonghua (province du Jilin). L'icariine (lot n° T11A11B111118) a été acheté auprès de Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd. GLcN (lot n° M-AT-1904020) a été acheté auprès de Zhejiang Jinke Pharmaceutical Co., Ltd. CS (lot n° HS1904270) a été acheté auprès de Jiaxing Hengjie Biopharmaceutical Co., Ltd. comprimés de valérate d'estradiol, tribromoéthanol, kits ELISA pour PINP et CTX-I, kits de dosage d'hydroxyproline, de phosphore et de calcium, kit de coloration ALP, milieu -MEM, trypsine, pénicilline-streptomycine, tampon de blocage, TBST, tampon de transfert rapide, tampon d'électrophorèse, membranes PVDF, IgG anti-lapin de chèvre HRP, anticorps anti-GAPDH, marqueur protéique pré-coloré, tampon de lyse RIPA, Kit ECL, kit de préparation de gel PAGE, tampon de chargement de protéines, kit CCK-8, sérum bovin fœtal, Alizarin Red S, acide ascorbique, -glycérophosphate de sodium, dexaméthasone, PBS et anticorps primaires pour RUNX2, BMP-2, Smad1, ALP, OSX et p-Smad1/5.(Tous les numéros de lots et fournisseurs sont tels qu'indiqués dans le texte original.)

2.3 Instruments

Un lecteur de microplaques (ThermoFisher, États-Unis), un microscope inversé (Motic Group), une armoire de biosécurité (ThermoFisher, États-Unis), un incubateur CO2_22 (ThermoFisher, États-Unis) et un bain métallique chauffant numérique à double canal (Changchun Kelebo Biotechnology Co., Ltd.) ont été utilisés.

2.4 Extraction du TFE

Le TFE a été extrait en utilisant la méthode rapportée par Zhang Dongxue et al. [13]. La poudre lyophilisée obtenue a été mesurée par spectrophotométrie UV-Vis à 270 nm. En utilisant l'icariine comme étalon, la teneur totale en flavonoïdes de l'extrait de TFE a été déterminée à 79,0 %.

2.5 Conception expérimentale sur les animaux

Les rats ont été randomisés en cinq groupes : normal (fictif), modèle (OVX), valérate d'estradiol (EV), extrait de TFE (T) et TG. Le groupe fictif a subi l'ablation d'une petite quantité de graisse abdominale et de tissus mous uniquement ; tous les autres groupes ont subi une ovariectomie bilatérale. Les médicaments ont été préparés sous forme de suspensions dans de la carboxyméthylcellulose sodique à 0,5% et administrés par gavage oral. Les groupes Sham et OVX ont reçu une solution saline par gavage. Le groupe T a reçu du TFE à raison de 490 mg·kg−1^{-1}−1. Le groupe EV a reçu 0,1 mg·kg−1^{-1}−1. Le groupe TG a reçu du CS 124 mg·kg−1^{-1}−1, du GLcN 155 mg·kg−1^{-1}−1 et du TFE 490 mg·kg−1^{-1}−1. Les doses ont été converties à partir des doses recommandées par les humains. Le volume de gavage était de 2 mL·kg−1^{-1}−1·d−1^{-1}−1 pendant 8 semaines consécutives. Le succès de la modélisation a été confirmé lorsque les taux sériques d’œstradiol (E2) dans le groupe OVX étaient significativement inférieurs à ceux du groupe fictif. Étant donné que CS + GLcN seuls n'ont montré qu'une légère tendance à l'amélioration de la DMO du rat, un groupe distinct contenant uniquement des nutriments osseux n'a pas été établi.

Aux semaines 3, 6 et 8, les rats ont été placés dans des cages métaboliques avec de l'eau gratuite et un jeûne de 12 heures, et des échantillons d'urine de 24 heures ont été collectés. L'urine a été centrifugée à 4 degrés, 3 500 r·min−1^{-1}−1 pendant 10 min ; les surnageants ont été stockés à -80 degrés. À la fin de la semaine 8, les animaux ont été euthanasiés et le sang a été collecté, centrifugé à 4 degrés, 4 000 r·min−1^{-1}−1 pendant 15 min pour obtenir du sérum, puis stocké à −80 degrés.

2.6 Mesure des indicateurs physiologiques

À la semaine 8, l'urine et le sang de l'aorte abdominale ont été collectés. Des kits ELISA ont été utilisés pour mesurer le marqueur sérique de formation osseuse PINP et le marqueur de résorption osseuse CTX-I. L'hydroxyproline sérique et urinaire (Hyp) a été mesurée par hydrolyse alcaline. Le calcium urinaire (U-Ca) a été mesuré par la méthode des microplaques MTB et le phosphore urinaire (UP) par la méthode au phosphomolybdate.

2.7 Densité minérale osseuse et micro-CT

Après 8 semaines, les fémurs gauches ont été récoltés, nettoyés et scannés par micro-CT. Les paramètres trabéculaires ont été analysés quantitativement, notamment la séparation trabéculaire (Tb.Sp), l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th), le nombre trabéculaire (Tb.N), la fraction volumique osseuse (BV/TV) et l'indice de modèle de structure (SMI).

2.8 Histopathologie osseuse

Les fémurs droits ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 %, décalcifiés, inclus en paraffine, sectionnés et colorés à l'HE et au TRAP. Les ostéoclastes TRAP-positifs sont apparus en rouge foncé.

2.9 Analyse métabolomique

L'urine (100 μL) a été diluée 10 fois avec de l'eau distillée, vortexée pendant 30 s, centrifugée à 4 degrés, 15 000 r·min−1^{-1}−1 pendant 10 min, et le surnageant a été utilisé pour l'analyse. Des volumes égaux (100 μL) d'urine de chaque rat ont été regroupés pour préparer des échantillons de contrôle qualité (CQ).

La chromatographie a été réalisée à l'aide d'une colonne ACQUITY UPLC CSH C18 (2,1 mm × 150 mm, 1,7 μm) à 40 degrés. La phase mobile A était de l'acétonitrile (0,1 % d'acide formique) et la phase mobile B était de l'eau (0,1 % d'acide formique). Le débit était de 0,20 mL·min−1^{-1}−1, le volume d'injection de 5 μL. Pente : 0 à 4 min, 95 % B ; 4 à 5 minutes, 95 % à 65 % B ; 5 à 13 minutes, 65 à 25 % de B ; 13 à 14 minutes, 25 à 0 % de B ; 14 à 18 minutes, 0 à 95 % B.

La spectrométrie de masse a été réalisée à l'aide d'un instrument Q Exactive Plus en modes ions positifs et négatifs avec une tension de pulvérisation de ± 3,2 kV, un gaz de gaine de 2,0 à 8,0 psi, une température capillaire de 350 degrés et une plage de balayage m/z de 100 à 1 000.

2.10 Statistiques multivariées et traitement des données

Les données brutes LC – MS ont été prétraitées et normalisées à l'aide du logiciel Compound Discoverer. Une PCA non supervisée a été utilisée pour évaluer les différences de regroupement et de groupe. OPLS-DA supervisé a été utilisé pour obtenir les valeurs VIP. Un test t a été appliqué aux données normalisées. Les métabolites avec VIP > 1 et P < 0,05 ont été considérés comme des biomarqueurs potentiels et identifiés plus en détail.

2.11 Identification des biomarqueurs et analyse des voies

Le temps de rétention (Rt), m/z et le poids moléculaire précis ont été obtenus à partir des chromatogrammes TIC. Les formules candidates et la composition élémentaire ont été prédites à l'aide des bases de données en ligne Compound Discoverer (HMDB, KEGG). L'enrichissement des voies a été réalisé à l'aide de MetaboAnalyst.

2.12 Culture et différenciation des ostéoblastes

Les ostéoblastes calvariaux de souris MC3T3-E1 ont été cultivés dans un incubateur CO2_22 à 37 degrés. Lorsqu'elles étaient confluentes à 80 % à 90 %, les cellules ont été étalées pour une induction ostéogénique. Le milieu complet ostéogénique était constitué de -MEM complété par 10 mmol·L−1^{-1}−1 -glycérophosphate, 50 μmol·L−1^{-1}−1 d'acide ascorbique et 100 nmol·L−1^{-1}−1 dexaméthasone.

2.13 Test de cytotoxicité

La viabilité cellulaire a été évaluée par CCK-8. Les cellules MC3T3-E1 (5 × 103^33 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et incubées pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec du TFE (2 à 12 ug·mL−1^{-1}−1), du CS (50 à 250 ug·mL−1^{-1}−1) ou du GLcN (0,2 à 1,0 mmol·L−1^{-1}−1) pendant 24 h. L'absorbance à 450 nm a été mesurée pour calculer la viabilité. Sur la base des résultats, les doses optimales ont été sélectionnées et combinées pour tester TG par rapport au contrôle.

2.14 Coloration ALP

Les cellules MC3T3-E1 (1 × 104^44 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits et divisées en blanc (pas d'induction), contrôle (induction ostéogénique), T (induction ostéogénique + TFE) et TG (induction ostéogénique + TG). Les médias étaient changés tous les deux jours. Après 7 jours, la coloration ALP a été réalisée selon les instructions du kit.

2.15 Coloration ARS

En utilisant le même regroupement et le même traitement que la coloration ALP, les cellules ont été induites pendant 14 jours. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4%, colorées avec 0,1% de rouge d'alizarine (pH 7,2) pendant 30 minutes, lavées et observées au microscope.

2.16 Western Blot

Pour examiner si TG influence la différenciation ostéogénique via la signalisation BMP-2/Smad, des cellules MC3T3-E1 (5 × 105^55 cellules/puits) ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits avec le même regroupement que ci-dessus. Les cellules ont été lysées avec du RIPA plus des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Après quantification BCA, les protéines ont été dénaturées, séparées par 10 % de SDS-PAGE, transférées sur PVDF, bloquées, incubées avec des anticorps primaires (GAPDH, p-Smad1/5, Smad1, BMP-2, RUNX2, OSX, ALP), suivies par un anticorps secondaire HRP, un développement ECL, une imagerie et une quantification ImageJ.

2.17 Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± SD. SPSS a été utilisé pour l’analyse statistique. Après les tests de normalité, une ANOVA unidirectionnelle a été réalisée. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P < 0,05.

 

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3. Résultats

3.1 Indicateurs biochimiques sériques

Comme le montre le tableau 1, par rapport au groupe fictif, les niveaux d'E2 dans le groupe OVX ont diminué de manière significative, indiquant une mise en place réussie du modèle. Le PINP sérique dans le groupe OVX a diminué de manière significative, indiquant une formation osseuse réduite dans le PMOP. Par rapport à OVX, le PINP dans les groupes T et TG a augmenté de manière significative, ce qui indique que T et TG ont tous deux augmenté les marqueurs de formation osseuse, avec une meilleure récupération chez TG. Par rapport au traitement factice, le CTX-I dans l'OVX a augmenté de manière significative, indiquant une résorption osseuse améliorée après une ovariectomie. Par rapport à l'OVX, la CTX-I dans T et TG a diminué de manière significative, avec une réduction plus prononcée de TG. L'hydroxyproline sérique (S-Hyp) a augmenté de manière significative dans l'OVX par rapport à l'simulacre, indiquant une dégradation accrue du collagène ; par rapport à OVX, S-Hyp a diminué en T et en TG, avec une réduction significative de TG, suggérant une meilleure inhibition de la dégradation du collagène.

3.2 Indicateurs biochimiques urinaires

Par rapport au test fictif, UP a augmenté de manière significative dans OVX ; par rapport à OVX, UP a diminué plus nettement dans TG. L'U-Ca a augmenté de manière significative dans l'OVX par rapport au test fictif ; par rapport à OVX, U-Ca a diminué de manière significative à la fois en T et en TG, avec une diminution plus importante en TG. L'hyp urinaire (U-Hyp) a augmenté de manière significative dans l'OVX par rapport à l'simulacre ; par rapport à OVX, U-Hyp a diminué de manière significative dans chaque groupe de traitement, avec une diminution plus importante de TG que de T (Tableau 2).

3.3 Histopathologie osseuse

La coloration HE a montré que la continuité trabéculaire était bonne en simulation, avec moins d'adipocytes dans la cavité médullaire. Par rapport au test factice, OVX a montré une continuité trabéculaire plus faible et une augmentation marquée des adipocytes. Par rapport à OVX, la continuité trabéculaire récupérée dans T et TG et le nombre d'adipocytes ont diminué ; TG a montré une récupération plus évidente (Figure 1A). La coloration TRAP a montré que le nombre d'ostéoclastes était significativement augmenté dans l'OVX par rapport à l'simulacre ; par rapport à OVX, les ostéoclastes ont diminué en T et TG, avec une diminution significative de TG (Figure 1B).

3.4 Densité minérale osseuse et paramètres du micro-CT

La micro-CT a montré une masse osseuse significativement réduite dans l'OVX par rapport au test fictif. Par rapport à OVX, la récupération de la masse osseuse en TG était plus significative qu'en T, avec une nette augmentation de la densité trabéculaire (Figure 1C). L'analyse quantitative a montré que BV/TV, Tb.Th et Tb.N diminuaient significativement dans l'OVX par rapport à l'simulation. Par rapport à OVX, ces indices ont augmenté de manière significative après TG (meilleur que T). Tb.Sp et SMI ont augmenté de manière significative dans l'OVX par rapport à l'simulacre ; par rapport à OVX, TG a diminué ces indices de manière plus significative que T (Tableau 3).

3.5 PCA

Sous les modes ions positifs et négatifs, l'ACP des profils de métabolites urinaires aux semaines 3, 6 et 8 a montré une séparation nette entre les groupes fictifs, OVX et TG, indiquant des profils métaboliques distincts avant/après la modélisation et avant/après le traitement par TG (voir le matériel supplémentaire référencé dans le contexte de la publication originale).

3.6 Criblage potentiel de biomarqueurs

OPLS-DA a montré une séparation de groupe plus prononcée au fil des semaines dans les deux modes ioniques. Les tracés volcaniques et les tests de 200 permutations ont confirmé la fiabilité du modèle (R2Y et Q2 proches de 1 ; intercept Q2 < 0), suggérant l'absence de surajustement.

3.7 Identification des biomarqueurs et analyse des voies

En utilisant VIP > 1 et P < 0,05, des biomarqueurs potentiels ont été sélectionnés. Sur la base de m/z, MS/MS, Rt et du poids moléculaire, et en faisant référence à HMDB/KEGG, 46 biomarqueurs potentiels ont été identifiés. L'enrichissement en KEGG a indiqué que les voies impliquaient principalement le métabolisme du nicotinate et du nicotinamide, le métabolisme de l'histidine, le métabolisme de la pyrimidine, le métabolisme du tryptophane, le métabolisme des acides aminés D, le métabolisme de l'alanine/aspartate/glutamate, le métabolisme des purines et le métabolisme de la vitamine B6 (Figure 2). Le regroupement hiérarchique a montré des changements dynamiques au cours des semaines 3, 6 et 8 après l'intervention de TG (voir le matériel supplémentaire référencé dans le contexte de la publication originale).

3.8 Test de cytotoxicité

Après 24 h de traitement, 6 ug·mL−1^{-1}−1 TFE ont augmenté la viabilité cellulaire ; des doses plus élevées ont inhibé la viabilité. GLcN à 0,4 mmol·L−1^{-1}−1 a significativement augmenté la viabilité. CS à 150 ug·mL−1^{-1}−1 a augmenté la viabilité (Tableau 4). Ainsi, 6 ug·mL−1^{-1}−1 TFE, 0,4 mmol·L−1^{-1}−1 GLcN et 150 ug·mL−1^{-1}−1 CS ont été sélectionnés. Le dosage combiné a montré une viabilité de contrôle de 1,00 ± 0,11 et une viabilité de TG de 1,22 ± 0,03, indiquant que la dose de TG sélectionnée était sûre et non cytotoxique.

3.9 Effets sur la différenciation ostéogénique et l'expression des protéines

L'ALP est un marqueur précoce de la différenciation ostéogénique. Sous induction ostéogénique, TG présentait une coloration ALP plus foncée que T, indiquant une meilleure promotion de l'expression de l'ALP (Figure 3A). La coloration ARS a montré que T et TG favorisaient la formation de nodules minéralisés par rapport au contrôle, avec un effet plus prononcé sur TG (Figure 3B). Le Western blot a montré une expression accrue des marqueurs ostéogéniques sous induction. Par rapport au blanc, le contrôle a indiqué une différenciation ostéogénique réussie. Après le traitement, TG a augmenté plus fortement l'expression des protéines BMP-2, p-Smad1/5, RUNX2, OSX et ALP (Figure 3C ; Tableau 5).

 

4. Discussion

L'insuffisance ovarienne postménopausique réduit les niveaux d'œstrogènes et perturbe le métabolisme osseux, améliorant la différenciation des ostéoclastes tout en diminuant la différenciation des ostéoblastes, provoquant finalement une perte osseuse [14-15]. Sur la base de recherches antérieures [13], il a été émis l'hypothèse que la combinaison du TFE avec un supplément nutritionnel osseux pourrait exercer des effets synergiques dans l'amélioration du PMOP. Par conséquent, cette étude a utilisé un modèle de rat OVX et un modèle de différenciation des ostéoblastes pour évaluer l’efficacité et le mécanisme de la TG.

Le PINP (formation osseuse) et le CTX-I (résorption osseuse) ont été améliorés par le T et le TG, le TG montrant des effets plus significatifs. L'hydroxyproline (Hyp), un composant majeur du collagène, augmente dans le sérum et l'urine en OP [16-17]. Dans cette étude, OVX a augmenté l’Hyp sérique et urinaire ; le traitement a réduit ces niveaux, les TG les réduisant de manière plus significative que les T. Une résorption osseuse accrue dans l'OVX augmente également la perte de calcium et de phosphore, augmentant ainsi le calcium et le phosphore urinaires, conformément à DESAI S et al. [18]. Le traitement a diminué l'U-Ca et l'UP, avec des réductions plus importantes des TG. La carence en œstrogènes modifie la structure trabéculaire, inhibe l'ostéogenèse des BMSC, favorise l'adipogenèse et augmente l'activité des ostéoclastes [19]. TG a amélioré la connectivité trabéculaire, réduit les adipocytes médullaires et réduit le nombre d'ostéoclastes plus efficacement que T. Micro-CT a confirmé que TG augmentait la DMO et améliorait la microarchitecture trabéculaire (BV/TV, Tb.Th, Tb.N) tout en réduisant Tb.Sp et SMI.

L’OP étant une maladie métabolique, la métabolomique a été utilisée pour explorer les réseaux métaboliques régulés par les TG. Les voies régulées de TG impliquaient principalement le métabolisme des acides aminés, des nucléotides et des vitamines. Le tryptophane est associé à la DMO et des niveaux réduits peuvent marquer une OP [20]. Dans cette étude, le tryptophane a été régulé négativement dans l'OVX et restauré de manière significative après 8 semaines de traitement par TG, ce qui suggère que la TG pourrait atténuer la perte osseuse en modulant le métabolisme du tryptophane. La créatinine, liée au métabolisme arginine/créatine, a été associée à l'OP [21-22]. Ici, la créatinine était la plus élevée dans l'OVX à la semaine 8 et la TG la réduisait de manière significative, ce qui suggère que la régulation du métabolisme de l'arginine pourrait contribuer à l'amélioration du PMOP. Le métabolisme du glutathion participe au PMOP (23). Le L-glutamate peut être généré à partir du métabolisme du glutathion (GSH). Le GSH a des fonctions antioxydantes et soutient le remodelage osseux [24]. Dans le PMOP, le stress oxydatif augmente, la capacité antioxydante diminue et l'activité des ostéoclastes dépasse l'activité des ostéoblastes, altérant la formation osseuse (15). Dans cette étude, le L-glutamate était plus élevé dans l'OVX à la semaine 8 et la TG diminuait le L-glutamate, ce qui suggère que la TG pourrait réduire la conversion du GSH en L-glutamate et ainsi soutenir les niveaux de GSH et contrecarrer les anomalies métaboliques liées à la carence en œstrogènes.

Les troubles du métabolisme des purines dans l'OP peuvent entraîner une accumulation d'acide urique [25-27]. La métabolomique a montré que TG réduisait les taux d'acide urique aux semaines 3, 6 et 8 par rapport à OVX, suggérant une suppression de la synthèse des purines et de l'accumulation d'acide urique. LIUDF et al. [28] ont rapporté que les interventions peuvent augmenter l'adénosine pour soulager les troubles du métabolisme des purines. Dans cette étude, la TG a augmenté de manière significative l'adénosine après 8 semaines, suggérant une contribution à la différenciation ostéogénique et à la récupération osseuse.

Les vitamines (D, complexe B, K) jouent un rôle important dans le métabolisme osseux [29-31]. La niacine et la nicotinamide sont des formes de vitamine B3 [32]. La niacine contribue à la synthèse des coenzymes NAD/NADP, avec des effets anti-inflammatoires et antioxydants [33]. La nicotinamide peut également favoriser la production de NAD ; Le NAD soutient la fonction mitochondriale, réduit les dommages causés par les ROS et aide à maintenir l'homéostasie osseuse. En OP, une réduction du NAD peut entraver la différenciation et la minéralisation ostéogéniques [34]. Dans cette étude, la niacine et la nicotinamide étaient plus élevées dans l'OVX aux semaines 3, 6 et 8 (plus élevées à la semaine 8). Les auteurs ont déduit que la synthèse du NAD pouvait être altérée en cas de maladie, conduisant à une accumulation de niacine/nicotinamide et à un faible NAD, tandis que TG abaissait les niveaux de niacine/nicotinamide, reflétant peut-être la consommation pour la synthèse du NAD. La pyridoxamine (PM) fait partie de la vitamine B6 [35]. La vitamine B6 soutient la différenciation chondrogénique [36], et une carence en B6 peut affaiblir la réticulation du collagène et la solidité des os [37]. Le métabolisme de la vitamine B6 a été associé à la progression de la PMOP (38). Dans cette étude, les PM étaient plus faibles dans l'OVX à la semaine 8, tandis que les TG augmentaient les PM, suggérant un rôle possible dans le soutien du collagène et de la solidité des os.

Lors du remodelage osseux, les ostéoblastes assurent la formation osseuse. Les colorations ALP et ARS reflètent respectivement une ostéogenèse précoce et une minéralisation tardive, et augmentent généralement sous induction ostéogénique (39-40). Ici, le TG a amélioré l'activité de l'ALP et les nodules minéralisés plus efficacement que le TFE seul. Les BMP sont membres de la superfamille TGF et jouent un rôle clé dans la différenciation ostéogénique. BMP-2 se lie aux récepteurs, active Smad1/5/8 (avec Smad4) et favorise les facteurs de transcription tels que RUNX2 et OSX en aval, favorisant finalement la synthèse des protéines ostéogéniques, le dépôt de matrice extracellulaire et la minéralisation (41). Des recherches antérieures ont rapporté que le TFE favorise l'ostéogenèse des BMSC via la voie BMP-2/RUNX2/OSX (42). Cette étude s'est concentrée sur la signalisation BMP-2/Smad et a révélé que l'expression de TG augmentait significativement de BMP-2, p-Smad1/5, RUNX2, OSX et ALP par rapport au TFE seul, soutenant un effet pro-ostéogénique plus fort médié par BMP-2/Smad.

En résumé, les résultats in vivo et in vitro indiquent que la TG améliore efficacement les anomalies métaboliques osseuses induites par l'OVX. Les mécanismes peuvent impliquer la régulation du métabolisme des acides aminés, des nucléotides et des vitamines et l'activation de la signalisation BMP-2/Smad pour favoriser l'ostéogenèse. Cette étude fournit un soutien théorique à la TG dans la prévention et le traitement des PMOP.

 

5. Perspective de l'industrie : Tendances des ingrédients botaniques pour la santé des os postménopausiques - De la recherche axée sur les mécanismes à la fabrication standardisée

Objectif SEO : extrait de plantes pour l'ostéoporose postménopausique, ingrédients botaniques pour la santé des os, ostéogenèse BMP-2/voie Smad, Extrait de flavonoïdes d'épimedium (icariine), développement de produits botaniques guidé par la métabolomique.

5.1 Pourquoi le contenu « Extrait d'herbes pour l'ostéoporose postménopausique » dirigé par un mécanisme est important en B2B

Pour les marques, importateurs et formulateursla santé des femmesetsanté des osportefeuilles, le marché récompense de plus en plus les concepts botaniques qui peuvent être expliqués dansune logique scientifique claire-Par exemple:

modulation métabolique multivoie (prise en charge par la métabolomique), et

voies de signalisation liées à l'ostéogenèse telles queBMP-2/Smad.

Des études comme celle traduite ci-dessus sont précieuses car elles relientcomposition (TFE + CS/GLcN) → résultats phénotypiques (DMO, réduction des ostéoclastes, indices micro-CT) → preuves moléculaires/biochimiques (BMP-2/Smad, PINP/CTX-I) → réseaux métaboliques (voies de la vitamine B, métabolisme des acides aminés et des purines).

5.2 Approvisionnement en ingrédients botaniques : la standardisation, la traçabilité et l’extraction évolutive sont les véritables différenciateurs

Dans l'approvisionnement B2B, « herbe » n'est pas une spécification unique : c'est une chaîne d'approvisionnement. Pour les entreprises de produits finis, les questions clés sont :

L'ingrédient peut-il êtrestandardisé(par exemple, composés de marqueurs, empreintes digitales) ?

Y a-t-ilsystèmes de qualitéetcontrôles de fabricationpour soutenir un approvisionnement à long terme ?

Le fournisseur peut-il fournirpaquets de documentationpour les audits réglementaires et clients ?

5.3 Où s'inscrit Cistanche (tendance + capacité de fabrication, pas une affirmation de substitution)

Aux côtés de plantes établies pour la santé des os (par exemple,Épimèdeflavonoïdes),Cistanchea attiré l'attention dans le domaine plus large de la MTC et de la botanique fonctionnelle en raison de sa longue histoire d'utilisation dans les formules toniques et de la préférence croissante de l'industrie pourextraits d'herbes simplesetactifs standardisésqui peuvent être intégrés dans des formats de suppléments modernes.

Pour les acheteurs qui évaluent des partenaires botaniques, un profil de fournisseur axé sur la fabrication devient important, couvrant :

approvisionnement verticalement intégré,

capacité d’extraction et de transformation,

et la transparence des antécédents de l'entreprise.

À propos de notre capacité de fabrication (source de référence) :le profil de l'entreprise et les antécédents de l'usine peuvent être consultés sur la page officielle « À propos de nous » du site du fournisseur. ([xjcistanche.com])

Note de conformité pour les blogs B2B :Si le positionnement de votre produit cible « l'ostéoporose postménopausique », assurez-vous que votre langage tourné vers l'extérieur restestructure/fonctionousoutien nutritionnel–orienté (en fonction de votre marché) et évitez les allégations de traitement de maladies à moins qu’elles ne soient soutenues et autorisées par la réglementation locale.

En savoir plus (pages de référence des fournisseurs) :

Présentation de l'entreprise/historique de l'usine : ([xjcistanche.com])

Hub de contenu botanique associé (recettes de MTC et narration des ingrédients) :(le lien de référence que vous avez fourni peut être inséré une fois que vous avez confirmé que le chemin de l'URL finale est correct)

 

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