Chapitre 2 : Le facteur de type Krϋppel 15 supprime la prolifération des cellules mésangiales glomérulaires rénales via l'amélioration de la conjugaison P53 SUMO1

Pour plus d'informations. Contacteztina.xiang@wecistanche.com

3. RÉSULTATS

3.1|Dépistage des gènes de liaison KLF15-par ChIP-Seq dans les MC glomérulaires rénaux primaires

Pour identifier les gènes partenaires de liaison directe de KLF15, nous avons effectué une analyse ChlP-Seq et avons finalement criblé 2478 gènes. L'analyse GO de ces gènes via l'outil du site Web www.uniprot.org (Figure 1A, B) a révélé des termes de fonction moléculaire associés à 1941 gènes, des termes de composants cellulaires liés à 1662 gènes et des termes de processus biologiques liés à 1766 gènes. Puisque notre objectif était de découvrir comment KLF15 affecte les MC, nous nous sommes concentrés sur les gènes liés aux processus cellulaires. Parmi les 1315 gènes liés aux processus cellulaires, 74 gènes participent aux processus du cycle cellulaire ; plus précisément, ces gènes ont participé au cycle cellulaire mitotique, à la transition de phase du cycle cellulaire et à d'autres processus (Figure 1C, D). De plus, nous avons analysé les gènes impliqués dans la croissance et constaté qu'ils étaient liés à la croissance développementale, à la croissance cellulaire et à d'autres types de croissance (Figure 1E).

3.2|Criblage de gènes régulés de manière différentielle dans KLF15-surexprimant les MC glomérulaires rénaux à l'aide de SILAC et LC/MS

L'analyse SILAC et LC/MS des HRMC surexprimant KLF15 par rapport aux cellules parentales a conduit à l'identification de 1357 protéines. Nous avons utilisé le DAVID et l'IPA pour acquérir les domaines GO et les voies enrichies des protéines quantifiées identifiées par SILAC. Fait intéressant, de nombreux termes liés à la fonction biologique des protéines figuraient parmi les 30 principaux termes GO significativement enrichis, notamment la régulation du processus métabolique des acides aminés cellulaires, le complexe du protéasome, la liaison aux protéines et les termes de transcription et de traduction, qui sont tous étroitement liés à ubiquitination (figure 2A). La figure 2B montre les 30 principaux termes de voie enrichis de manière significative. Plusieurs termes de processus biologiques, y compris les termes de protéasome et de maladies neurodégénératives, étaient également liés à l'ubiquitination.

Cliquez pour en savoir pluscistancheà vendre avec détails

3.3|Analyse bioinformatique des gènes de liaison au KLF15-potentiellement associés à la prolifération des MC glomérulaires rénaux

Pour explorer les gènes de liaison KLF15-qui sont potentiellement associés àglomérulaire rénalProlifération de MC, nous avons effectué une analyse bioinformatique des données ChIP-Seq et des données SILAC-LC/MS. Cinquante-deux gènes ont été criblés (tableau 2 et figure 2C), et cinq de ces gènes, dont SUMO1, le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF), le facteur d'initiation eucaryote (EIF), le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF) et la réticulolocalbine (RCN ), étaient étroitement liés àproliferation cellulaire. Étant donné que les analyses GO et des voies des protéines exprimées de manière différentielle suggéraient que les gènes criblés étaient principalement liés au processus d'ubiquitination, nous avons conclu que SUMO1, un membre de la famille des protéines de type ubiquitine (UBL), participe à une modification post-traductionnelle similaire à ubiquitination comme gène cible de KLF15.

Des quantités croissantes de preuves ont indiqué que l'HG est l'un des principaux facteurs induisant le développement de la néphropathie diabétique, et qu'il favorise la prolifération des MC et l'augmentation de la synthèse de la matrice in vitro. Une étude précédente a montré que le PDGF-BB est essentiel à la prolifération des MC précédant le développement. de la glomérulosclérose dans la glomérulonéphrite expérimentale.26 Après avoir confirmé que les MC étaient stimulées par HG ou PDGF-BB in vitro, nous avons détecté des changements dans l'expression de KLF15 et SUMO1 à la fois au niveau de l'ARN et de la protéine

niveaux et a constaté que ces molécules avaient des tendances similaires (Figure 2D-l). Enfin, nous avons déterminé que SUMO1 était le gène cible de KLF15.

3.4|KLF15 régule à la hausse l'expression du gène SUMO-1 en se liant à une région promotrice CACCCA-SUMO-1 de 16 bp et à un motif riche en C plus A

Nous avons utilisé la suite MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) pour caractériser les motifs de liaison KLF15- des 52 gènes criblés à partir des données KLF15 ChlP-Seq et identifié le motif de liaison KLF (Figure 3A). De plus, nous avons analysé plus de mille bases en amont du promoteur SUMO1 et avons découvert que KLF15 pouvait reconnaître et se lier à une séquence de 16 pb (nucléotides -205~-199), y compris - CACCCA-(Figure 3B).ChIP-PCR a confirmé que KLF15 est lié au promoteur SUMO1, et les résultats ont montré une expression significativement plus élevée de SUMO1 dans le groupe d'anticorps anti-KLF15 que dans le groupe témoin de fond (Figure 3C).

De plus, nous avons effectué un test de rapporteur à double luciférase pour confirmer la relation de ciblage entre SUMO1 et KLF15. Le groupe promoteur SUMO1 de type sauvage a montré une activité luciférase plus élevée que le vecteur pGL3 et les groupes mutants dans les HRMC, et l'activité a été significativement augmentée par la surexpression de KLF15. Les améliorations de l'activité de la luciférase ont été inversées par transfection avec un plasmide exprimant la région promotrice mutante (figure 3D). Pris ensemble, ces données suggèrent que SUMO1 est une cible transcriptionnelle directe de KLF15.

3.5 |Criblage de P53 comme substrat de SUMOylation de SUMO1

Les modifications SUMO sont des modifications post-traductionnelles largement exprimées chez les eucaryotes. La conjugaison réversible de ces modifications aux protéines substrats est également connue sous le nom de SUMOylation, qui joue un rôle important dans la régulation des fonctions des protéines cibles et participe en outre à divers processus biologiques, tels que le transport nucléocytoplasmique, la régulation transcriptionnelle, l'apoptose, la stabilisation des protéines, les réponses au stress et progression du cycle cellulaire.27 Pour explorer les molécules de signalisation en aval directement conjuguées par SUMO1, nous avons effectué une analyse de réseau de SUMO1 à l'aide de la base de données IPA, et les données ont montré que SUMO1 pouvait se conjuguer directement à P53, APP, JUN et AKT, entre autres protéines (Figure 4A-C). Nous avons initialement sélectionné P53 comme molécule en aval de SUMO1 car il s'agit d'une protéine bien connue qui est étroitement liée à la prolifération cellulaire. Figure 4D）. Pour déterminer si P53 est effectivement modifié par SUMOylation, nous avons transfecté de manière transitoire des HRMC avec un plasmide de surexpression SUMO1 ou un siARN SUMO1. Les résultats de l'IP et du Western blot ont révélé des tendances dans les changements d'expression de SUMO1-P53 et P53 qui étaient compatibles avec les changements dans SUMO1 (Figure 4E-J). Ces données indiquent que P53 est un substrat de SUMOylation de SUMO1.

3.6 |KLF15 inhibe la prolifération des MC en favorisant l'expression de SUMO1 et la SUMOylation de P53

Pour établir la régulation de la SUMOylation de P53 et de la prolifération des MC par KLF15 et SUMO1, nous sommes intervenus avec l'expression de KLF15 ou SUMO1 dans les HRMC et avons traité les HRMC avec PDGF-BB. Parmi les HRMC traités par PDGF-BB, les cellules transfectées avec le plasmide de surexpression KLF15 présentaient une expression plus élevée de SUMO1-P53, P53, KLF15 et SUMO1 que les cellules transfectées avec le plasmide témoin KLF15. Les mêmes changements dans SUMO 1- P53, P53 et SUMO1 ont été trouvés dans les cellules transfectées par le plasmide de surexpression de SUMO1, tandis que l'expression de KLF15 était inchangée dans ces cellules (Figure 5A-F). PDGF-BB est l'un des facteurs de croissance les plus efficaces des MC décrits jusqu'à présent, et une réponse proliférative des HRMC au PDGF-BB a été observée. Comme le montre la figure 5G, H, le pourcentage de cellules EdU-positives a été significativement augmenté par l'administration de PDGF-BB recombinant. Les résultats de la coloration EdU ont indiqué que la surexpression de KLF15 et de SUMO1 inhibait la prolifération cellulaire induite par PDGF-BB (Figure 5G, H).

Pour mieux comprendre les rôles de KLF15 et de SUMO1 dans la prolifération des CMRH, nous avons transfecté des cellules avec uniquement de l'ARNsi SUMO1 ou les avons cotransfectées avec de l'ARNsi SUMO1 et un plasmide de surexpression de KLF15. La régulation à la baisse de SUMO1 n'a pas affecté l'expression de KLF15, mais les niveaux d'expression de SUMO 1- P53 et P53 ont évidemment diminué après la transfection d'ARNsi SUMO1 (Figure 6A-C). De plus, lorsque l'expression de SUMO1 était inhibée, les niveaux d'expression de SUMO1-P53 et P53 étaient également supprimés même dans les cellules surexprimant KLF15 (Figure 6D-F). Ensuite, la prolifération de MC a été évaluée à l'aide d'un test de coloration EdU. SUMO1 RNAi a amélioré l'effet prolifératif des PDGF-BBon HRMC, et le groupe cotransfecté avec le plasmide de surexpression KLF15 et l'ARNsi SUMO1 avait plus de cellules EdU-positives que le groupe cotransfecté avec le plasmide de surexpression et l'ARNsi de contrôle de séquence hybride (Figure 6G, H) . Nous concluons donc que KLF15 supprime la prolifération des MC en améliorant la SUMOylation de P53.

3.7|L'expression globale de SUMO1 et P53 dans les MC glomérulaires est négativement corrélée à la prolifération des MC dans la néphrite Thy-1 du rat

La néphrite à anti-Thy1 est un modèle classique de glomérulonéphrite proliférative mésangiale spontanément résolutive avec une phase proliférative et une phase de récupération. Nous avons injecté un anticorps Thy1 à des rats Wistar pour créer ce modèle. L'azote uréique sérique et la créatinine ne présentent aucun changement significatif entre les rats témoins et les rats modèles (Figure S1). Une prolifération mésangiale marquée et une accumulation d'ECM ont été observées pendant la phase proliférative (jours 5 et 7) chez les rats modèles, et le nombre de MC a diminué pendant la phase de récupération au jour 10 (figure 7A). Nous avons également détecté les changements d'expression dans le marqueur de prolifération cellulaire PCNA par IHC (Figure 7A, B). Les niveaux de PCNA ont augmenté le jour 5, ont culminé le jour 7 et ont diminué le jour 10 (Figure 7F). L'analyse Western blot a montré que l'expression protéique de P53, SUMO1 et KLF15 dans les glomérules isolés était plus faible dans les groupes modèles que dans le groupe témoin (figure 7C, D), conformément aux résultats immunohistochimiques (figure 7E, F). Ces résultats indiquent que la prolifération anormale des MC chez les rats modèles anti-Thy1 est liée à la faible expression de KLF15 et SUMO1. Interférer avec l'expression de ces molécules devrait atténuer le phénotype pathologique chez le rat.

4. DISCUSSION

Laglomérulessont les unités de filtration duun rein. La perturbation de la fonction glomérulaire peut être causée par une pathologie glomérulaire primaire ou peut être secondaire à des maladies systémiques. Des modifications mésangiales ont été observées à la suite d'une lésion glomérulaire, notamment une hyperprolifération de MC suivie d'une production excessive d'ECM (expansion mésangiale) et d'une production de chimioattractant pour les cellules inflammatoires. Par conséquent, la modulation des réponses MC, en particulier la prolifération anormale, est une nouvelle approche thérapeutique. KLF15 est une protéine qui joue un rôle régulateur en tant que facteur de transcription en se liant à des séquences d'ADN spécifiques. De nombreuses études ont rapporté que KLF15 est impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire. Par exemple, il a été découvert que KLF15 participe à l'inhibition des voies de signalisation liées à la prolifération des MC,15,30 mais son gène cible direct n'a pas été rapporté dans la littérature. Par conséquent, cette étude impliquait principalement un criblage conjoint des niveaux de transcription et de traduction pour identifier le gène cible direct de KLF15.

KLF15 régule différents gènes dans différentes espèces et dans différents tissus et organes. Dans le processus de régulation de la prolifération des MC, KLF15 affecte l'expression de plusieurs gènes et participe à de multiples voies.131,32 Pour explorer les gènes cibles directs de KLF15, nous avons utilisé ChIP-Seg.Klein RH et ses collègues ont utilisé ChlP-seq technologie pour étudier la régulation de KLF7 sur la différenciation des cellules épithéliales cornéennes.33 Ying M et al ont utilisé cette technique pour étudier l'effet inhibiteur de KLF9 sur la pluripotence du glioblastome.34Comparé à ChlP-chip, ChIP-Seq permet une véritable analyse du génome entier avec une résolution plus élevée, une sensibilité de détection plus élevée et une demande de taille d'échantillon plus faible.35 Nous avons utilisé ChP pour obtenir les fragments d'ADN directement liés par KLF15, et après comparaison et analyse avec GenBank, nous avons criblé 2478 gènes cibles possibles. Grâce à des analyses GO et des voies, nous avons identifié de nombreux gènes cibles impliqués dans le cycle cellulaire et les processus de prolifération.

Les expériences ChlP-Seq nécessitent une PCR pour l'amplification du signal de détection, et un certain degré de biais pendant le processus d'amplification est inévitable. De plus, ChIP-Seq n'obtient que les gènes que KLF15 peut lier et n'indique pas les changements qui se produisent dans l'expression de ces gènes lorsque l'expression de KLF15 change. Nous avons utilisé l'analyse protéomique SILAC-LC/MS pour compenser ces lacunes. Cette technique fournit des informations sur toutes les protéines dont l'expression change lors de la régulation par KLF15, y compris les protéines directement régulées par KLF15 et les protéines indirectement régulées ou modifiées post-traductionnellement. Les HRMC ont été cultivés à l'aide de SILAC et KLF15 a été surexprimé dans les cellules par transfection de plasmide. Les protéines ont été collectées pour la détection LC/MS, et 1357 protéines différentiellement exprimées ont été obtenues. Les analyses GO et des voies ont révélé que certaines des protéines exprimées de manière différentielle étaient impliquées dans l'ubiquitination. Les données génétiques et protéiques ont été recoupées. Les gènes non liés au but de la recherche et les gènes non directement régulés par KLF15 ont été supprimés ; finalement, 52 gènes ont été criblés. Parmi ceux-ci, les cinq gènes présentant les différences d'expression les plus évidentes et les plus étroitement liées à la prolifération ont été sélectionnés. Compte tenu des résultats combinés de l'analyse des voies, de l'analyse de l'expression de SUMO1 et de KLF15 dans les HRMC en prolifération, ChlP-PCR et les tests de rapporteur à double luciférase, la protéine SUMO1 a été sélectionnée comme gène cible de KLF15.

En plus de l'ubiquitine, un nombre croissant de protéines UBL,3637 y compris SUMO,38 le gène 8(NEDD8)3940 exprimé par les cellules précurseurs neurales, le gène 15(ISG15)3940 et le gène stimulé par l'interféron stimulé par l'interféron,41 sont en cours d'identification. Ces protéines modificatrices régulent puissamment une variété de processus biologiques. L'addition covalente de SUMO aux substrats, appelée SUMOylation, est une modification post-traductionnelle impliquée dans une série de processus cellulaires, y compris le transport nucléaire-cytosolique, la régulation transcriptionnelle, l'apoptose, le contrôle de la stabilité des protéines, les réponses au stress et la progression du cycle cellulaire.27SUMO est généralement attaché aux résidus de lysine accepteur de substrats protéiques hébergeant une séquence consensus et contribue à la régulation des interactions protéine-protéine ainsi qu'à la compartimentation sous-cellulaire et à la stabilité des protéines.2 sUMO1, en tant que membre de la famille SUMOS, peut affecter la prolifération cellulaire en modifiant le substrat et la stabilisation des protéines régulatrices du cycle cellulaire.43 Par conséquent, combinés au rapport de la littérature et aux résultats complets du dépistage et de l'analyse, nous nous sommes concentrés sur la façon dont KLF15 régule l'effet de SUMO1 sur la prolifération des cellules mésangiales.

Pour identifier les substrats de SUMO1, nous avons effectué une analyse de réseau de SUMO1 à l'aide de la base de données IPA et du logiciel SUMOsp. Combinées à des recherches publiées sur P53, nos données de criblage initiales suggéraient que P53 était une molécule en aval de SUMO1 avec la séquence de SUMOylation YKxD/E. Des études antérieures ont montré que P53 était un substrat de SUMOylation,45 et que la conjugaison améliorée de P53 SUMO1 favorisait la stabilité et l'activité de P53 et induisait la sénescence.46 Dans notre étude, l'interférence avec l'expression de SUMO1 dans les HRMC a produit les mêmes tendances de changement dans SUMO1-P53 et P53, indiquant que P53 était un substrat de SUMOylation de SUMO1.

De nouvelles preuves ont indiqué que la SUMOylation et la dé-SUMOylation jouent un rôle dans de nombreuses maladies néphropathiques, telles que la dysgénésie rénale, le carcinome rénal, la maladie glomérulaire, l'apoptose des podocytes et l'hypertonie médullaire rénale, les lésions rénales aiguës et la néphrolithiase.7-51 relation entre KLF15, SUMO1, SUMOylation de P53 et la prolifération de MC, nous avons effectué une série de traitements de transfection sur des cellules ayant subi une prolifération induite par PDGF-BB. La surexpression de KLF15 a régulé positivement l'expression de SUMO1, tandis que la surexpression de SUMO1 n'a pas affecté l'expression de KLF15. La surexpression de KLF15 ou SUMO1 a augmenté la SUMOylation de P53 et antagonisé la prolifération cellulaire induite par PDGF-BB. Lorsque l'expression de SUMO1 a été inhibée, la SUMOylation de P53 a également été inhibée et KLF15 a perdu son effet antagoniste sur la prolifération cellulaire. Invivo. la prolifération des MC a progressivement augmenté avec l'aggravation de la néphrite proliférative mésangiale, tandis que l'expression de KLF15, SUMO1 et P53 a diminué de manière significative. Compte tenu des observations intégrées dans les cellules et les tissus, nous concluons de manière préliminaire que KLF15 régule la SUMOylation de P53 via SUMO1, inhibant ainsi la prolifération des MC.

5. CONCLUSIONS

Certaines études ont indiqué que KLF15 joue un rôle important dans la régulation de la prolifération des MC. Dans ce travail, nous avons exploré les mécanismes de suppression de la prolifération des MC médiés par ce facteur de transcription. Nous avons identifié SUMO1 comme la cible principale de KLF15 dans les MC via des analyses bioinformatiques impliquant ChIP-Seq et SILAC-LC/MS. De plus, à l'aide de la base de données IPA et du logiciel SUMOsp, nous avons déterminé que P53 était un substrat direct de SUMO1. Des expériences in vitro et in vivo ont confirmé que KLF15 pouvait favoriser l'expression de SUMO1 et la SUMOylation de P53 puis inhiber la prolifération des MC (Figure S2). Ces résultats contribuent à la compréhension du rôle régulateur de KLF15 dans la prolifération des MC et fournissent une base théorique pour trouver de nouveaux traitements pour les maladies rénales liées à la prolifération des MC.