Abstrait:Un total de 20 souches de Lactobacillus isolées à partir de dattes fermentées ont été testées pour leur potentiel probiotique en comparant leur stabilité au pH, leur résistance à un pH bas et leur capacité à tolérer les sels biliaires. Sur 20 souches, 3 souches nommées Lactobacillus pentosus KAU001, Lactiplantibacillus pentosus KAU002 et Lactiplantibacillus plantarum KAU003 avaient une tolérance élevée aux acides et aux sels biliaires et la capacité d'adhérer à la paroi intestinale. De plus, les trois isolats ont été testés pour leurs propriétés anti-oxydantes, anti-inhibition de la glucosidase, hypocholestérolémiantes et anti-inflammatoires. Parmi eux, les souches KAU001 et KAU002 ont inhibé la -glucosidase, abaissé le taux de cholestérol, inhibé la production d'oxyde nitrique et ont montré une capacité antioxydante supérieure qui était significativement meilleure que la souche KAU003. Les deux souches ont également inhibé de manière significative la libération de médiateurs inflammatoires tels que TNF-, IL-6 et IL-10 induite par le LPS sur les macrophages RAW 264.7 (p < 0,001). Les résultats ont indiqué que KAU001 et KAU002 ont le potentiel probiotique le plus élevé, modulant potentiellement la santé métabolique et réduisant les cytokines pro-inflammatoires en réponse aux réactions allergiques.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et peut piéger les espèces réactives de l'oxygène et empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.

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Mots clés:Ajowa ; Médine ; probiotiques; inflammation; nourriture

1. Introduction

Les probiotiques sont des compléments alimentaires qui contiennent des souches microbiennes vivantes capables de coloniser le tractus gastro-intestinal (de façon permanente ou transitoire) pour améliorer la santé humaine [1,2]. Les probiotiques sont bénéfiques lorsque la flore native du tractus gastro-intestinal est perturbée ; les probiotiques supplémentés de manière exogène pourraient coloniser temporairement le tractus et stabiliser l'équilibre de la microflore qui restaure finalement la fonction physiologique vitale [1–5]. Le terme « probiotiques » est généralement limité aux espèces appartenant au genre des bactéries lactiques (LAB), telles que Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sakei et Lactobacillus plantarum, en tant que probiotiques importants en raison de leur souche. propriétés spécifiques bénéfiques pour la santé [6–15]. La recherche actuelle sur les probiotiques indique que les espèces bactériennes doivent répondre à des exigences spécifiques, notamment la résistance aux concentrations élevées d'acide et de bile, l'adhésion et l'établissement dans les épithéliums intestinaux, la production de composés antimicrobiens et la modulation des réponses immunitaires [1,9,10,14,16 ,17].

Connus pour leur capacité à sécréter diverses substances antimicrobiennes dont les bactériocines, les probiotiques facilitent la réponse immunitaire par la sécrétion d'IgA pour lutter contre les pathogènes potentiels, réduire les réactions allergiques, activer la barrière muqueuse du côlon, augmenter la stabilité de la microflore commensale et diminuer la l'adhérence des agents pathogènes, ainsi que favoriser la récupération [4,5,18-20]. Les bactériocines produites par L. gasseri sont les plus connues dont la séricine-A gazeuse produite par L. gasseri LA39 est isolée des fèces infantiles [21]. Il est rapporté que Verdenelli et al., ont isolé L. rhamnosus IMC 501 de la matière fécale d'un Italien âgé, ont montré une forte adhérence au tractus gastro-intestinal et ont découragé la croissance d'agents pathogènes, en particulier Candida albicans [22]. Un autre probiotique isolé du koumiss, L. casei Zhang, s'est également avéré avoir une résistance élevée aux acides et aux sels biliaires, une persistance gastro-intestinale, une activité antimicrobienne, ainsi que des propriétés de réduction du cholestérol [23]. En raison de la valeur commerciale considérable et des avantages pour la santé apportés par les probiotiques, l'isolement et la caractérisation continus de nouvelles souches sont devenus une tendance émergente, car ces bactéries bénéfiques sont actuellement les agents biothérapeutiques à multiples facettes les plus puissants [1,9,10,14,18,24 –31].

Cette étude visait à évaluer le potentiel probiotique de 20 souches de Lactobacillus isolées à partir de dattes fermentées, ainsi que leur résistance à des concentrations élevées d'acide et de bile. De plus, les isolats sélectionnés ont été étudiés pour leurs diverses propriétés fonctionnelles, telles que l'adhésion à la paroi intestinale, l'anti-oxydation, l'inhibition de l'activité de la glucosidase, la diminution du cholestérol et l'anti-inflammation.

2. Matériels et méthodes

2.1. Isolement et identification des souches de Lactobacillus

Un total de 20 souches de bactéries lactiques ont été isolées à partir de dattes Ajwa fermentées en utilisant de la gélose au BCP (lactose pourpre de bromocrésol). Les souches ont ensuite été cultivées sur de la gélose MRS (de Man, Rogosa et Sharpe) et les souches de culture pure ont été stockées dans du glycérol à 60 % (v/v) à -80 °C [32]. Avant chaque expérience, les cultures ont été activées en les cultivant deux fois dans le bouillon MRS avant utilisation. Le surnageant acellulaire a été préparé en cultivant chaque isolat LAB dans du bouillon MRS à 37 ◦C pendant 24 h, suivi d'une centrifugation (10, 000 × g pendant 10 min) et d'une stérilisation sur filtre [7,8,18]. Les souches sensibles aux antibiotiques ont été envoyées pour séquençage du gène ARNr 16S pour identification [8].

2.2. Propriétés probiotiques d'isolats sélectionnés dans un modèle de tractus gastro-intestinal

Suc gastrique de survie et sels biliaires :

La résistance des isolats LAB sélectionnés au suc gastrique artificiel et aux sels biliaires a été testée selon notre protocole décrit précédemment [18]. En bref, un inoculum avec une concentration cellulaire de 2,5 × 108 UFC/mL a été préparé et inoculé dans du suc gastrique artificiel et des sels biliaires. Pour le suc gastrique, le MRS a été complété avec de la pepsine (1000 unités/mL) à un pH final de 3. De même, de la bile artificielle a été préparée en ajoutant 5 % de pancréatine au MRS avec 1 % de fiel de bœuf et le pH final a été ajusté à 7.

2.3. Adhésion aux cellules intestinales HT-29 

Des cellules HT-29 ont été utilisées pour déterminer la capacité des isolats LAB sélectionnés à adhérer à l'intestin en utilisant la méthode décrite par Kim et al. [33]. Le nombre de cellules viables a été déterminé en utilisant la méthode de la plaque étalée sur gélose MRS [34].

2.4. Etude in vitro des propriétés fonctionnelles des souches de Lactobacillus

Détermination de l'activité antioxydante :

Les activités antioxydantes d'isolats LAB sélectionnés ont été déterminées en estimant la capacité de piégeage des radicaux à l'aide du test 2,20 -casino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique) (ABTS), le ferrique -le dosage du pouvoir antioxydant réducteur (FRAP) et le dosage du 2,2-diphényl- 1-picrylhydrazyl (DPPH). Les dosages ABTS, FRAP et DPPH ont été effectués en suivant la méthode décrite ailleurs [14, 35–37].

2.5. Inhibition de la n-glucosidase 

L'inhibition de -GLU a été réalisée selon la méthode décrite précédemment [14, 32] en utilisant -GLU de Saccharomyces cerevisiae (Sigma, St. Louis, MO, USA) avec quelques modifications [32]. En bref, 25 µL -GLU (0.17 U/mL) et 50 µL de tampon phosphate de potassium ont été mélangés avec 10 µL de l'échantillon de test. PBS et MRS ont été utilisés comme contrôles. Ensuite, 5 mM de pNPG ont été ajoutés suivis d'une incubation à 37 °C pendant 30 min. Enfin, la réaction enzymatique a été arrêtée en ajoutant 100 µL de Na2CO3 0,2 M. L'absorbance a été examinée à l'aide d'une microplaque à 405 nm. Le pourcentage d'inhibition de -GLU pour chaque souche a été calculé en suivant l'équation (1).

2.6. Détermination de l'activité de réduction du cholestérol

L'activité de réduction du cholestérol a été évaluée en utilisant la méthode modifiée décrite par Oh et al. [35]. Le cholestérol résiduel a été déterminé à l'aide du kit de dosage du cholestérol total en suivant le protocole du fabricant. Pour servir de contrôle négatif, le cholestérol du bouillon stérile non ensemencé a également été analysé.

2.7. Activité anti-inflammatoire des isolats de LAB dans les cellules macrophages RAW 264.7

Une lignée cellulaire de macrophages murins, RAW 264.7, a été achetée auprès de la Korean Cell Line Bank (Séoul, Corée) et cultivée dans du FBS à 10 % avec 1 % de pénicilline et de streptomycine à 100 U/mL et 100 µg/L, respectivement, à 37 ◦ C avec 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Les cellules ont été sous-cultivées et étalées à 80-90% de confluence. Nous avons traité des cellules RAW 264.7 (1 × 106 cellules/mL) avec deux concentrations de LAB (7 ou 8 Log UFC/mL) dans du milieu DMEM sans antibiotiques pendant 12 h avant d'exposer les cellules à 100 ng/mL de LPS pendant 18 h pour évaluer leur activité anti-inflammatoire. Un milieu dépourvu d'antibiotiques a été utilisé pour dissoudre les échantillons bactériens, puis il a été ajouté directement au milieu de culture cellulaire. En utilisant la réaction de Griess, le NO a été mesuré dans les cellules induites par le LPS. Une PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour déterminer l'expression de l'ARNm de TNF-, IL-6 et IL-10 libérés.

2.8. Analyses statistiques 

Sur la base d'expériences indépendantes réalisées en triple exemplaire, toutes les données sont exprimées sous forme de moyennes plus écarts-types (SD). Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a analysé les différences statistiques entre plusieurs groupes à l'aide du test à plages multiples de Duncan. Le test t de Student unilatéral non apparié a analysé les différences statistiques entre les deux groupes. les valeurs de p <0.05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

3. Résultats

3.1. Dépistage et isolement des souches bactériennes des dattes Ajwa fermentées

Les dattes d'Ajwa ont été achetées sur un marché local à Médine, en Arabie saoudite. Les graines ont été extraites et réduites en poudre. Ensuite, la poudre de graines a été mélangée avec les dattes sans pépins et de l'eau stérile à une concentration finale de 5%, puis stockée dans des bocaux en verre. Les récipients ont été maintenus à température ambiante pendant 48 h, suivis d'une incubation à 10 ◦C pendant 10 jours pour terminer la fermentation. Un total de 20 souches de bactéries lactiques (LAB) ont été isolées à partir des dattes fermentées en utilisant de la gélose BCP selon la méthode rapportée précédemment [7,18]. Après un criblage préliminaire, les trois souches de LAB sélectionnées ont été identifiées comme Lactobacillus pentosus KAU001, Lactiplantibacillus pentoses KAU002 et Lactiplantibacillus plantarum KAU003, et les séquences ont été soumises à GenBank avec les numéros d'accès ON514175, ON514180 et ON514177, respectivement.

3.2. Propriétés probiotiques des souches de lactobacilles dans le modèle du tractus gastro-intestinal

Les probiotiques doivent être vivants dans le tractus gastro-intestinal pour exercer leurs effets bénéfiques. Par conséquent, en complément, ils doivent d'abord survivre au passage à travers les zones riches en sels biliaires et riches en acides (pH bas) du tractus gastro-intestinal avant de le coloniser. Chez l'homme et la plupart des animaux, le foie synthétise les acides biliaires à partir du cholestérol, les stocke dans la vésicule biliaire et les sécrète dans l'intestin grêle après un repas gras. Pour être qualifiée de probiotique, une nouvelle bactérie lactique doit être capable de résister à des sels biliaires élevés et à un pH bas dans l'intestin. La poudre d'Oxgall, un produit dérivé de la bile bovine, a été couramment utilisée à la place de la bile humaine pour mesurer les capacités potentielles de tolérance à la bile probiotique en raison de sa similitude avec la composition de la bile humaine. Les trois isolats de Lactobacillus ont montré une tolérance élevée à un pH acide hostile de 3.0, avec un taux de survie de 92 % et 97 % dans KAU002 et KAU003, respectivement (Figure 1). De même, à une concentration de 1 % de sels biliaires, les isolats ont présenté un taux de survie allant de 91 % à 97,4 % après une incubation de 6 h.

Les trois isolats ont été testés pour adhérer aux cellules d'adénocarcinome du côlon humain HT -29 comme condition préalable à la colonisation dans l'intestin humain. Les souches KAU001 et KAU002 ont montré des capacités adhésives plus élevées (supérieures à 80 %) dans les cellules du côlon humain. Des propriétés telles qu'une tolérance plus élevée au pH acide, une capacité de survie à des concentrations plus élevées de sels biliaires et un taux d'adhésion plus élevé aux cellules du côlon qualifient les isolats de souches bactériennes lactiques probiotiques potentielles.

3.3. Activités anti-inflammatoires des souches de Lactobacillus

Pour déterminer les propriétés anti-inflammatoires, un antigène commun - les lipopolysaccharides (LPS) - a été utilisé pour stimuler les cellules macrophages RAW 264.7, et ces cellules ont été inoculées avec des isolats de Lactobacillus. Les tests MTT n'ont montré aucun effet cytotoxique des souches de lactobacilles sur les cellules RAW 264.7 (données non présentées). Les isolats bactériens (KAU001 et KAU002) à deux concentrations - 107 et 108 UFC/mL - ont significativement inhibé la production d'oxyde nitrique (NO) par rapport aux cellules témoins stimulées par le LPS (Figure 2). De plus, la quantité d'expression de cytokines pro-inflammatoires de TNF-, IL-6 et IL-10 dans RAW 264.7 stimulé par LPS a été quantifiée à l'aide de la qRT-PCR. Les souches de Lactobacillus KAU001, KAU002 et KAU003 ont réduit de manière significative l'expression des cytokines pro-inflammatoires de manière dépendante de la concentration (Figure 3).

4. Discussion

Les probiotiques, principalement composés de bactéries lactiques, sont connus pour apporter des avantages spécifiques à la santé de l'hôte par la colonisation du tractus gastro-intestinal [38]. Pour exercer de tels effets biothérapeutiques, les souches probiotiques doivent survivre au passage dans le tractus gastro-intestinal et coloniser l'intestin grêle et le côlon pendant une période suffisante [18,38]. Des souches telles que KAU001 et KAU003 étaient les plus tolérantes à l'acide et à la bile, et leur adhésion aux cellules HT-29 était significativement plus élevée.

Certains isolats de LAB provenant de caecum de poulet montrent une survie limitée de 60 % à 80 % après avoir été exposés à un environnement acide avec un pH de 2 à 2,5 pendant 3 h [2,4,39-41]. En revanche, un taux de survie aussi élevé que 92,75 ~ 97,26 % a été observé dans cette étude. Le mécanisme naturel de défense humaine contre les agents pathogènes dans le tractus intestinal passe par la production d'acide chlorhydrique qui abaisse le pH de l'estomac. Par conséquent, on pense que les souches présentant une tolérance à l'acide survivent au transit par le tractus gastro-intestinal supérieur. Alors que dans l'intestin grêle et le côlon, une grande abondance de sels biliaires constitue également une barrière protectrice pour empêcher la fixation de bactéries pathogènes, la survie dans la bile est donc considérée comme un facteur crucial pour que les probiotiques colonisent l'intestin [17]. Le mécanisme des probiotiques pour contrer l'effet néfaste des sels biliaires passe par la production de l'enzyme hydrolase des sels biliaires (BSH), qui peut décomposer les sels biliaires conjugués, réduisant ainsi la toxicité [23,40]. Une autre exigence importante pour les souches probiotiques est la capacité d'adhérer aux cellules épithéliales intestinales, ce qui leur permet de coloniser l'intestin, de rivaliser avec les agents pathogènes et de conférer des avantages à l'hôte [42,43]. Parmi toutes les souches testées, KAU001, KAU002 et KAU003 ont montré une grande capacité à survivre dans le tractus gastro-intestinal et à adhérer aux cellules du côlon, les conférant comme candidats probiotiques potentiels.

KAU001 et KAU002 se sont avérés avoir un potentiel antioxydant important, en particulier KAU001. Ces résultats confirment que les deux souches de LAB sont très efficaces pour piéger les radicaux peroxyles. Les probiotiques à fort potentiel antioxydant peuvent aider à réduire les dommages oxydatifs causés par les radicaux libres, favorisant ainsi les bienfaits pour la santé tels que le ralentissement du vieillissement cellulaire, car le processus de vieillissement est fortement associé au stress oxydatif accumulé. De plus, KAU001 et KAU002 ont inhibé l'activité -glucosidase, qui est l'un des facteurs déterminants importants dans les maladies métaboliques telles que le diabète et l'obésité.

La réduction de la -glucosidase pourrait indiquer la capacité de ces souches à réduire l'absorption intestinale du sucre, réduisant ainsi potentiellement le risque de diabète. En outre, les deux souches ont également considérablement réduit le taux de cholestérol, ce qui peut aider à réduire le risque d'hypercholestérolémie et de maladies cardiovasculaires. Il a été postulé que le BSH produit par les souches LAB est responsable des propriétés anti-cholestérol par la déconjugaison des sels biliaires. Les sels biliaires déconjugués sont moins réabsorbés par les intestins et ils sont excrétés par les matières fécales. Ainsi, le remplacement de nouveaux sels biliaires du cholestérol abaissera le taux de cholestérol sérique [30].

En réponse à la stimulation du LPS dans les macrophages RAW 264.7, les cellules ont produit du NO en tant que molécule de défense toxique pour combattre les agents pathogènes, ce qui a entraîné une inflammation. Le traitement avec des souches de Lactobacillus a réduit la production de NO dans les macrophages stimulés par l'antigène, parallèlement à l'augmentation des concentrations de Lactobacillus. De manière cohérente, les niveaux d'expression de TNF-, IL-6 et IL-10 ont également diminué avec l'augmentation de la concentration de KAU001 et KAU002, justifiant les propriétés anti-inflammatoires de ces souches. Dans une réaction allergique stimulée par un antigène comme la rhinite allergique et la dermatite atopique, la gravité de la maladie peut augmenter avec le temps avec une exposition répétée, et elle peut provoquer une inflammation incontrôlée [41]. Typiquement, des médicaments anti-inflammatoires tels que des stéroïdes sont utilisés pour contrôler ces maladies ; cependant, les médicaments sont accompagnés de nombreux effets secondaires. Les probiotiques sont l'une des alternatives les plus sûres pour contrer ces problèmes d'hypersensibilité car les bactéries bénéfiques ont d'excellentes propriétés anti-inflammatoires.

5. Conclusions

En résumé, les souches de Lactobacillus isolées des dattes fermentées ont montré que les trois souches, KAU001, KAU002 et KAU003 pouvaient survivre dans le tractus gastro-intestinal et adhérer à la muqueuse intestinale. Les souches KAU001 et KAU002 étaient des probiotiques potentiels ayant un important effet bénéfique sur la santé du point de vue de la santé métabolique et des réactions d'hypersensibilité en raison de leur capacité à exercer un effet anti-oxydant, une inhibition de l'activité de la -glucosidase, une réduction du cholestérol et une action anti-cholestérol. -effet inflammatoire. Ces souches végétales devraient être envisagées pour une caractérisation et une commercialisation plus poussées dans l'industrie alimentaire et laitière

Contributions d'auteur:Conceptualisation, IAR ; méthodologie, AAM, AF et HMA ; logiciels, S.-HY et IAR ; validation, Y.-HP, IAR et Y.-YH ; analyse formelle, AAM ; enquête, AAM ; ressources, AF, HMA, S.-HY, Y.-HP et IAR ; conservation des données, AAM ; rédaction—préparation du brouillon original, AAM, IAR et Y.-YH ; rédaction—révision et édition, Y.-HP, Y.-YH et IAR; visualisation, Y.-HP ; surveillance, RIA ; administration de projets, AAM et IAR ; acquisition de financement, AAM et HMA Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement: Ce projet a été financé par le Deanship of Scientific Research (DSR), King Abdulaziz University, Djeddah, sous le numéro de subvention (DF-552-130-1441). Les auteurs remercient donc chaleureusement le soutien technique et financier de DSR.

Déclaration du comité d'examen institutionnel :N'est pas applicable.

Déclaration de consentement éclairé :N'est pas applicable.

Déclaration de disponibilité des données :Les données générées sont citées dans le manuscrit.

Les conflits d'intérêts:Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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