Discussion

La population vieillissante continue de croître à un rythme sans précédent dans le monde. Le vieillissement est associé à un déclin des fonctions cellulaires, à une accumulation de dommages et à une probabilité croissante de maladies chroniques qui conduisent à l'effondrement des systèmes et à la mort éventuelle [3–7]. La prévalence des pathologies liées à l'âge en fin de vie a un impact significatif sur la qualité de vie et les coûts de santé. Ainsi, il existe un besoin urgent d'interventions ayant une activité anti-âge efficace pouvant être exploitée comme géroprotecteur pour retarder le vieillissement et prolonger la durée de vie.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.

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Le vieillissement cellulaire est contrôlé par un réseau de processus biologiques complexes interconnectés [8, 9]. Des études récentes ont montré qu'intervenir dans les processus biologiques de vieillissement peut augmenter considérablement la durée de vie en bonne santé d'organismes modèles, y compris les mammifères [10, 14]. Le vieillissement chronologique chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est le système modèle bien établi pour déterminer les interventions du vieillissement cellulaire post-mitotique humain [16-19].

Nous avons développé une nouvelle méthode quantitative rapide et bon marché appelée PICLS pour mesurer le CLS en utilisant (1) des cellules de levure incubées avec des milieux et des composés de test sur des plaques de puits claires 96- ; (2) le colorant fluorescent iodure de propidium (PI), un imperméabilisant cellulaire qui ne pénètre que dans les cellules mortes [23–25] ; et (3) un lecteur de microplaques pour la lecture quantitative de la survie cellulaire. À noter, la mesure de la densité cellulaire (et de la croissance cellulaire) à OD600nm peut être effectuée à partir de la même plaque. Pour les cellules de levure morte sur des plaques à puits 96-, nous avons trouvé une corrélation linéaire élevée entre la fluorescence PI et l'absorbance OD600nm dans une plage de densité cellulaire optimale correspondant à 0, 05–12 OD. Cette approche méthodique peut être utilisée pour quantifier la viabilité cellulaire dans des essais à haut débit.

Il existe plusieurs innovations importantes associées à PICLS : (i) PICLS est actuellement la seule méthode sans excroissance pour la quantification CLS. Une étape critique exigeante en temps et en ressources est supprimée du protocole et, par conséquent, PICLS est le premier véritable dépistage à haut débit (HTS) pour les agents chimiques et les conditions de culture pour la mesure CLS. (ii) L'idée méthodique derrière PICLS peut être généralement formulée comme une méthode basée sur une plaque où (a) la fraction de cellules mortes/survivantes et (b) la quantité totale de cellules est directement déterminée simultanément à partir de la même plaque avec une intensité optique appareil de mesure (le lecteur de plaques couramment disponible). Dans ce travail, nous avons utilisé des plaques de puits 96- mais des plaques de puits 384- semblent également applicables (avec éventuellement une sensibilité réduite en raison de la plus petite quantité de culture). Tout agent colorant qui distingue les cellules mortes et survivantes et qui a une fluorescence ou une absorption dans un canal qui n'interfère pas avec la mesure générale de la densité cellulaire (par exemple, via l'absorption à OD600nm) peut être utilisé. Nous avons appliqué de l'iodure de propidium qui marque sélectivement les cellules mortes, mais ce n'est pas critique pour PICLS.

Fig. 7 Test de l'effet des analogues du 2,5-anhydro-D-mannitol sur la durée de vie chronologique de la levure. La souche de levure prototrophe (CEN.PK113-7D) a été cultivée dans le milieu synthétique défini avec différentes concentrations de 2,5-Dmannitol anhydre (2,5-AM), D-fructose , D-mannitol, D-maltose et D-sorbitol dans des plaques 96-puits à 30 degrés. Une croissance cellulaire OD600nm a été mesurée à différents moments 24 h, 48 h et 72 h à l'aide d'un lecteur de microplaques et d'un graphique tracé par rapport à différentes concentrations de 2,5-AM, fructose, mannitol, maltose et sorbitol. B La durée de vie chronologique (CLS) de différentes concentrations de cellules incubées en 2,5-AM, fructose, mannitol, maltose et sorbitol a été déterminée à l'aide de la méthode basée sur la fluorescence à l'iodure de propidium. La survie des cellules à différents âges chronologiques a été quantifiée et le point de temps de croissance 72 h a été considéré comme le jour 1. C Le CLS des cellules âgées a été déterminé par la méthode d'excroissance dans le milieu liquide YPD. Le point de temps de croissance 72 h a été considéré comme le jour 1. À différents âges chronologiques, une culture de 3- μL a été transférée dans une seconde plaque à puits 96- contenant 200 μL de milieu YPD. L'excroissance OD600nm dans le milieu liquide YPD a été mesurée après incubation pendant 24 h à 30 degrés à l'aide d'un lecteur de microplaques. Le graphique est tracé par rapport au jour 1. D L'excroissance dans le milieu liquide YPD d'une plaque à puits 96- a été photographiée après incubation pendant 24 h à 30 degrés. E À différents âges chronologiques, des cultures 3-μL ont été déposées sur la plaque de gélose YPD. L'excroissance a été photographiée après incubation pendant 48 h à 30 degrés. Toutes les données représentent en tant que moyens±SD. ; *P<0.05, **P<0.01, and  ****P<0.0001 based on two-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons tests (B and C). n.s, non-significant 

Nous notons que les microplaques noires sont généralement recommandées pour les essais de fluorescence car ce matériau éteint partiellement l'autofluorescence. Cependant, nous avons évalué la méthode dans des microplaques transparentes et avons trouvé une efficacité similaire à celle des microplaques noires. Comme les microplaques noires sont associées à des coûts élevés, il s'agit d'un avantage significatif pour les projets de criblage à grande échelle et à haut débit.

Nous avons validé notre méthode développée avec des interventions anti-âge connues telles que l'administration de rapamycine et la restriction calorique [10–16] en reproduisant leur effet sur le CLS de la levure. Ces résultats suggèrent que notre méthode est efficace pour identifier de nouvelles interventions anti-âge. Nous avons exploité notre nouveau protocole de criblage d'agents chimiques pour identifier de nouveaux composés anti-âge (Fig. 8). Nous avons identifié le 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) prolongeant la CLS de la levure. Sur la base de nos résultats, nous suggérons l'utilisation de 2,5-AM individuellement ou en combinaison avec d'autres interventions anti-âge.

2,5-AM est un analogue du fructose, et les deux sucres peuvent entrer dans la voie glycolytique. La glycolyse est un processus métabolique dans lequel le glucose est d'abord phosphorylé par l'hexokinase pour former du glucose-6-phosphate (G6P). La phosphoglucoisomérase interconvertit le G6P en fructose-6-phosphate (F6P) qui est ensuite métabolisé en différents intermédiaires glycolytiques en aval, y compris le pyruvate qui entre dans le cycle mitochondrial du TCA. Comme le glucose, le fructose est également phosphorylé par l'hexokinase pour former le F6P. La phosphofructokinase convertit le F6P en fructose-1,6-bisphosphate (FBP), qui est ensuite métabolisé en différents intermédiaires glycolytiques en aval. Le 2,5-AM peut également être phosphorylé par l'hexokinase pour former le 2,5-AM- 6-phosphate (2,5-AM6P) [39–41]. De plus, la phosphofructokinase convertit le 2,5-AM6P en 2,5-AM- 1,6-bisphosphate (2,5-AMBP). Cependant, la 2,5-AMBP ne peut plus être métabolisée en intermédiaires glycolytiques en aval [39–41].

Étant donné que 2,5-AM est un analogue du fructose, nous avons cherché à savoir si le fructose pouvait également prolonger la durée de vie de la levure. Cependant, nous n'avons pas observé l'activité anti-âge du fructose dans l'extension de la CLS de la levure. Le mannitol et le maltose peuvent également entrer dans la glycolyse et se métaboliser en intermédiaires glycolytiques en aval. Nous avons également examiné l'effet du mannitol et du maltose sur la durée de vie de la levure. Le fructose, le mannitol et le maltose sont également incapables d'étendre la CLS de la levure.

Comme le sorbitol, un autre sucre encore non métabolisé a été précédemment signalé comme affectant le CLS à des concentrations très élevées (18% équivalent à 1 M) [20, 45], nous avons souhaité clarifier si l'activité anti-âge de 2, {{7 }}AM peut être dû à l'augmentation de l'osmolarité du milieu de culture. Nos expériences ont montré que le sorbitol n'augmente pas la CLS de la levure aux concentrations plus faibles qui sont efficaces dans le cas de 2,5- AM. Étant donné que le sorbitol nécessite des concentrations plus élevées pour augmenter la CLS de la levure, le mécanisme anti-âge du 2,5-AM est indépendant des effets d'osmolarité. Ces résultats ont révélé que l'activité anti-âge du 2,5-AM est spécifique et non mise en parallèle par plusieurs autres analogues avec des structures chimiques similaires.

Cependant, comment 2,5-AM prolonge la durée de vie reste à étudier. Il sera intéressant d'examiner si 2,5-AM module directement les signes du vieillissement [8]. TORC1 et AMPK sont les complexes capteurs de glucose impliqués dans le processus de vieillissement [32, 43]. Cependant, la durée de vie chronologique prolongée par l'inhibition de TORC1 est réduite lorsque l'AMPK est inhibée. Les intermédiaires glucose et glycolytique régulent l'activité de TORC1 et AMPK [34, 46, 47]. 2,5-il a été démontré que l'AMBP inhibe l'activité de l'aldolase qui catalyse la conversion du FBP en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et dihydroxyacétone phosphate (DHAP) [39, 40]. Le DHAP est interconverti en G3P par la triosephosphate isomérase. Des preuves récentes suggèrent que le DHAP est l'importante molécule signal du glucose qui active TORC1 [48].

Le fux glycolytique est compromis lorsque la synthèse de G3P et de DHAP est affectée, ce qui entraîne une production moindre d'ATP. Fait intéressant, l'AMPK est activé lorsque le statut énergétique des cellules est compromis et inhibe la croissance cellulaire en inhibant le TORC1 [46, 47]. Ainsi, la relation antagoniste de l'AMPK et du TORC1 est une adaptation métabolique efficace pour assurer l'équilibre de l'homéostasie cellulaire des cellules saines. Cependant, nous n'avons pas observé d'effet de 2,5-AM sur la croissance cellulaire (Figs. 6 et 7). Ces résultats ont exclu tout effet de restriction du glucose qui compromettait la croissance cellulaire (Fig. 5), mais ont prolongé la durée de vie avec un phénotype à croissance lente [49]. Cependant, l'allongement de la durée de vie par la rapamycine ne nécessite pas une dose plus élevée qui compromet la croissance cellulaire (Fig. 4). Par conséquent, nous ne pouvons pas exclure la possibilité d'une activité anti-âge de 2,5-AM via TORC1/AMPK ou indépendamment de TORC1/AMPK.

Contrairement à l'effet inhibiteur de la 2,5-AMBP sur l'aldolase, il est rapporté qu'elle active la pyruvate kinase, la dernière enzyme de glycolyse [39–41]. La pyruvate kinase catalyse la conversion du phosphoénolpyruvate en pyruvate, l'une des sources de génération de NAD plus (nicotinamide adénine dinucléotide). Le NAD plus est un métabolite important qui régule plusieurs processus et fonctions cellulaires essentiels au maintien de cellules saines et à la prolongation de la durée de vie [50, 51]. Le pyruvate est également le principal substrat des réactions mitochondriales pour générer divers métabolites de base pour synthétiser des éléments vitaux, notamment des acides aminés, des acides nucléiques et de l'ATP, essentiellement pour la survie des cellules et un vieillissement sain [52-55]. En effet, la baisse de l'activité mitochondriale est associée au vieillissement et aux maladies liées à l'âge [53–56]. Récemment, le 2,5-AM a été proposé comme agent thérapeutique potentiel pour traiter le cancer de la leucémie myéloïde aiguë (LMA) [57].

En passant, nous avons nommé notre nouvelle méthode PICLS (méthode CLS basée sur PI) en pensant au jeu de mots "pickles". Alors que tous les éléments de notre nouveau protocole ont déjà été décrits indépendamment ailleurs, leur combinaison "fermentée" rend la mesure simple et bon marché, et enfin prête à haut débit.

En conclusion, nous avons développé une méthode quantitative pour mesurer la durée de vie chronologique de la levure et identifié le 2,5-AM comme un nouveau composé anti-âge. Une étude est actuellement en cours pour étudier les mécanismes de l'activité anti-âge de 2,5-AM.

Matériels et méthodes

Souche de levure, milieu et produits chimiques

Le fond génétique de la souche prototrophe CEN.PK113-7D a été utilisé dans cette étude [35, 36]. Milieu riche en standard YPD (1 % d'extrait de levure Bacto, 2 % de peptone Bacto et 2 % de glucose), gélose YPD (2,5 % de gélose Bacto) et milieu synthétique défini (SD) contenant 6,7 g/L de base azotée de levure avec du sulfate d'ammonium sans acides aminés (DIFCO) et 2 % de glucose. La solution mère de rapamycine (Enzo) a été préparée dans du diméthylsulfoxyde (Sigma). La concentration finale de DMSO n'a dépassé 1 % dans aucun essai. 2,5-Anhydro-D-mannitol (Santa Cruz), D-fructose (Sigma), D-mannitol (Sigma), D-maltose (Sigma) et D-sorbitol (Sigma) préparés frais par dissoudre directement la poudre dans le milieu et filtrer stérilisé.

Conditions de croissance des levures

La souche de levure a été récupérée à partir d'un stock de glycérol congelé sur un milieu gélosé YPD à 30 degrés. La levure a été cultivée dans un milieu SD pendant une nuit à 30 degrés avec agitation à 220 tr/min. Les cellules cultivées pendant la nuit ont été diluées à OD600nm ~ 0,2 dans du milieu SD frais pour lancer les expériences chronologiques de durée de vie.

Analyse chronologique de la durée de vie

Des expériences de durée de vie chronologique (CLS) ont été réalisées dans des plaques {{0}}puits avec un total de 20{{10}} µL de culture de levure comme décrit précédemment [58]. L'inoculum cellulaire a été transféré dans la plaque à puits 96- contenant des concentrations en série à double dilution (0 à 10 nM) de rapamycine. Pour le test de restriction calorique, des inoculums cellulaires ont été préparés dans un milieu SD contenant 2 %, 0,5 % et 0,25 % de glucose et transférés dans des plaques à puits 96-. De même, l'inoculum cellulaire a été transféré dans les plaques 96-puits contenant des concentrations en série à double dilution (0–8 mM) de 2,5-anhydro-D-mannitol, D-fructose, D-mannitol, D-maltose et D-sorbitol. Les cellules ont été incubées à 30 degrés et la croissance a été mesurée à différents moments. Le point de temps de croissance 72 h a été considéré comme le jour 1 pour le test CLS. La survie des cellules a été quantifiée à différents âges par trois approches différentes: (i) méthode basée sur la fluorescence à l'iodure de propidium, (ii) excroissance dans un milieu liquide YPD et (iii) test de repérage.

(i) Méthode basée sur la fluorescence à l'iodure de propidium :Les procédures détaillées pour développer l'approche basée sur la fluorescence de l'iodure de propidium (PI) sont mentionnées dans la section des résultats. Pour le test CLS, {{0}} µl de cellules de levure à différents âges ont été transférés dans une seconde plaque 96-puits. Les cellules ont été lavées et incubées dans 100 µl de PBS 1X avec PI (5 µg/ml) pendant 15 min dans l'obscurité. Des échantillons de contrôle positifs et négatifs ont été inclus pour l'analyse quantitative. Le contrôle positif (cellules bouillies à 100 degrés pendant 15 min) a été coloré au PI et traité dans la même plaque à puits 96-. Les échantillons sans cellules colorées au PI ont servi de contrôle négatif. Après incubation, les cellules ont été lavées et remises en suspension dans 100 ul de PBS. La lecture de fluorescence de l'échantillon (excitation à 535 nm, émission à 617 nm) et OD600nm ont été mesurées par le lecteur de microplaques (BioTek). L'intensité de fluorescence de chaque échantillon a été normalisée avec OD600nm. L'intensité de fluorescence normalisée de chaque échantillon a été soustraite du signal de fond de l'échantillon négatif non coloré. L'intensité de fluorescence obtenue de l'échantillon témoin positif (cellules mortes bouillies) a été considérée comme 0 % de survie cellulaire. Nous avons confirmé la mort de la cellule en lui permettant de se développer dans le milieu. La survie des cellules sur différents échantillons de points d'âge a été calculée en normalisant l'intensité de fluorescence avec un échantillon témoin positif (cellules bouillies).

où Iij(535nm∕617nm) est l'intensité de fluorescence mesurée au puits avec les coordonnées de plaque i et j avec une excitation à 535 nm et une émission à 617 nm, ID(535nm∕617nm) est l'intensité de fluorescence mesurée pour une cellule avec 100 % de morts cellules colorées avec PI, IC(535nm∕617nm) est l'intensité de fluorescence mesurée pour les cellules sans PI, et les valeurs de DO respectives sont l'absorption mesurée pour les cellules respectives à 600 nm en normalisant le nombre de cellules.

(ii) Croissance en milieu liquide YPD :La culture stationnaire de levure (3-μL) de différents points de temps d'âge a été transférée dans une seconde plaque 96-puits contenant 200μL de milieu YPD et incubée pendant 24 h à 30 degrés. L'excroissance (OD600nm) des cellules âgées a été mesurée par le lecteur de microplaques. La quantification de la survie cellulaire pour chaque âge a été déterminée par rapport au jour 1 (considéré comme 100 % de survie cellulaire) comme décrit précédemment [19, 20, 58].

(iii) Test de repérage :Une culture stationnaire de levure (3 μL) de différents points de temps d'âge a été déposée sur la plaque de gélose YPD et incubée pendant 48 heures à 30 degrés. L'excroissance des cellules âgées sur la plaque de gélose YPD a été photographiée à l'aide du système d'imagerie BioRad GelDoc.

L'analyse des données

L'analyse statistique de tous les résultats tels que la valeur moyenne, les écarts-types, la corrélation (R2), la signification et la représentation graphique a été effectuée à l'aide du logiciel GraphPad Prism v.9.3.1. Les résultats ont été statistiquement comparés à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle ordinaire et de l'ANOVA bidirectionnelle suivie d'une comparaison de multiples par le test post hoc de Dunnett ou le test post hoc de Sidak. Dans tous les tracés du graphique, les valeurs P sont représentées par *P<0.05,  **P<0.01, ***P<0.001, and ****P<0.0001 were considered significant. n.s, non-significant.

RemerciementsMA et FE de l'auteur sont les inventeurs de deux demandes de brevet (10202201534P et 10202201536U) qui incluent une partie des travaux décrits dans cet article.

Contribution de l'auteurMA a conçu le projet, réalisé les expériences et analysé les données. FE a co-conçu le projet, évalué les données et élaboré une stratégie. MA et FE ont rédigé l'article, et tous les auteurs ont révisé l'article et ont accepté sa version finale.

FinancementCe travail a été soutenu par le Bioinformatics Institute (BII), le Fonds de développement de carrière A*STAR (C210112008) et la subvention Global Healthy Longevity Catalyst Awards (MOH-000758–00).

Déclarations

Intérêts concurrentsLes auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Libre accèsCet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 Licence internationale, qui autorise l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur original. ) et la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur.

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