Pourquoi Cistanche a-t-il un effet sur l'apoptose des cellules PC12 ?

Effets de Cistanche sur l'apoptose des cellules PC12

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Tian Jiyu¹, Chen Jianzong¹, Chen Xiaoli², Yang Hao³

¹Département de médecine traditionnelle chinoise,²Département de pharmacie, hôpital Xijing,³PLA Institute of Neurobiology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Chine

Résumé

OBJECTIF:Pour étudier les effets deCistancheinduite par le 1- méthyl-4-phénylpyridinium (MPP plus )Apoptose des cellules PC12.

MÉTHODES : Cellules PC12ont été exposés à 200 μmol/ L de MPP plus seul ou de MPP plus combiné avec différentes concentrations deCistanchede Nouvelle-Zélande Sérum de lapin blanc. Les effets deCistanchesurapoptose des cellules PC12ont été détectés par cytométrie en flux, microscopie électronique et microscopie à fluorescence.

RÉSULTATS:Les sérums prélevés sur des lapins nourris avec une dose équivalente deCistancheou sur une dose équivalente double deCistancheavait des effets protecteurs évidents surCellules PC12et letaux d'apoptose des cellules PC12incubés avec ces deux sérums étaient de 2,8 pour cent et 10,2 pour cent, respectivement, ce qui était évidemment inférieur à ceux deCellules PC12avec MPP plus traitement uniquement(18 . 6 % , P<0>

CONCLUSION:Cistanchepeut protégerCellules PC12deapoptoseinduite par MPP plus .

Mots clés:CistancheDeserticola, 1-méthyl-4-phénylpyridinium,Cellules PC12, apoptose

Introduction

La pathogenèse de la maladie de Parkinson (maladie de Parkinson, MP) est l'endommagement et la perte des neurones dopaminergiques de la substantia nigra, etapoptosepeut être une raison importante. Nous utilisons la cytométrie en flux (FACS), la microscopie électronique à transmission et la coloration par fluorescence de l'analyse de la forme nucléaire et d'autres méthodes pour détecter la médecine chinoiseCistanchesérum médicamenteux et neurotoxine 1-méthyl-4-phénylpyridinium (1-méthyl-4-phénylpyridinium, M PP plus ) cellules PC12 traitées, pour explorer l'effet de Cistanche sur les neurones Le mécanisme de protection de action.

Les effets deCistanchesur l'apoptose des cellules PC12

1. Matériels et méthodes

1.1 Matériaux

Cellules PC12ont été achetés auprès de la Japan Life Science Foundation ; Le milieu de culture RP-MI1640, le sérum de veau et le collagène de queue de rat ont été achetés auprès de Gibco ; MPP plus, Annexin V-FITC, PI, PBS, flacons de culture cellulaire et plaques de culture ont été achetés auprès de Sigma; médecine chinoiseCistanchea été acheté à Xi'an Decoction Piece Factory; Le lapin blanc à grandes oreilles de Nouvelle-Zélande (mâle, poids corporel 2,5 ~ 3 kg) a été fourni par le centre animalier de l'école ; Hoechst33342 a été acheté auprès de la société Biyuntian ; Le paraformaldéhyde était pur au pays; LD4- Centrifugeuse de type 2 (Beijing Medical Centrifuge Factory) Instruments Microscope à fluorescence (société Laika), microscope inversé (société Olympus), microscope électronique à transmission JEM-2000EX (Japon), incubateur à température constante à CO2 (ici -cus HERAcell, Allemagne), cytomètre en flux Coulter EPICS (Beck-man Coulter, USA).

1.2 Méthode

Cellules PC12ont été cultivées dans un milieu de culture cellulaire RPMI1640, qui contenait 100 mL/L de sérum de veau. Le flacon de culture cellulaire et la plaque de culture ont été recouverts de 0,2 g/L de collagène de queue de rat avant utilisation. Les cellules cultivées ont été placées à 37 degrés, dans un incubateur à CO2 de 50 mL/L, changer le milieu pendant 3 jours. Lorsque les cellules de culture monocouche sont sur le point de fusionner, digérer avec 1,25 g/L de trypsine et sous-culture. Lorsque les cellules de sous-culture entrent dans la phase de croissance logarithmique, vous pouvez ajouter des médicaments. Selon le poids corporel du lapin, la dose équivalente de l'animal est convertie en fonction de la surface corporelle. La médecine traditionnelle chinoiseCistancheest préparé sous forme de poudre lyophilisée, qui est diluée avec de l'eau distillée lorsqu'elle est utilisée, et l'animal est administré deux fois par jour pendant 3 jours (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998 ; 4 :13-15), 1 h après la dernière ig, saignée carotidienne, une nuit à 4 degrés, centrifugation à 2500 tr/min pendant 25 min, séparation du sérum, inactivation à 56 degrés, 30 min et 0. Stérilisation avec une membrane filtrante de 22 μm et stockage à -20 degré . Dans les mêmes conditions, du sérum témoin de lapin blanc, 1/2, 1 et 2 fois la dose équivalente de sérum ont été préparés. L'expérience a été divisée en 5 groupes : le groupe A était un groupe de sérum de lapin blanc, le groupe B est 2 fois la dose équivalente de sérum plus le groupe MPP plus (la dose de gavage est le médicament brut cistanche 6,4 g/kg), le groupe C est l'équivalent dose de sérum plus MPP plus groupe (la dose de gavage est le médicament brut cistanche 3,2 g/kg), le groupe D est une dose demi-équivalente de sérum plus le groupe MPP plus (la dose est le médicament brut Cistanche 1,6 g/kg), groupe E est un sérum de lapin à blanc plus le groupe MPP plus. Sous-culture pendant 12 h À l'avenir, observez les cellules au microscope inversé et ajoutez le médicament avant la confluence. La teneur en sérum de chaque groupe est de 10 pour cent. Après 3 jours de culture, du MPP plus est ajouté à la concentration finale de 200 μmol/L. Placé à 37 degrés, 50 mL/L de culture de CO2 et vérifiez-le après 24 heures d'incubation.

1.2.1 Observation de la coloration par fluorescence des cellules PC12

Ajouter Hoechst33342 à la cultureCellules PC12à une concentration finale de 10 mg/L, incuber à 37 degrés pendant 30 min, mélanger 40 g/L de paraformaldéhyde et le milieu de culture à 13 : pour obtenir la concentration finale de paraformaldéhyde 10 g/L Après fixation pendant 5-10 min, jeter le surnageant, laver avec du PBS et observer au microscope à fluorescence.

1.2.2 Observation au microscope électronique à transmission

Après 24 heures de traitement médicamenteux, les cellules ont été collectées et transférées dans un tube à centrifuger, centrifugées à 1500 tr/min, 4 degrés pendant 5 min et lavées deux fois avec 10 mmol/L de PBS. Centrifuger à 1500 tr/min, 4 degrés pendant 5 min, jeter le surnageant, ajouter lentement 25 mL/L de glutaraldéhyde le long de la paroi du tube et fixer à 4 degrés pendant 2 h, décoller les amas cellulaires avec une pipette droite, laver 3 fois avec du PBS, 5 min à chaque fois, fixer pendant 1 h après l'acide osmium à 4 degrés Déshydratation à l'acétone post-gradient, trempage de résine époxy et enrobage, tranché avec LKB -2188 microtome ultra-mince, coloré avec de l'acétate d'uranyle- citrate de plomb, observé au microscope électronique à transmission et photographié.

1.2.3 Détection par cytométrie en flux

M PP plus traitement pendant 24 h, digest 106 adhérentCellules PC12avec 1,25 g/L de trypsine, laver deux fois avec du PBS, ajouter 490 μL de tampon de liaison, bien mélanger les cellules et ajouter 5 μL d'annexine V-FI TC Mélanger 10 μL de PI dissous dans la suspension cellulaire, mélanger doucement, placer le test tube à 4 degrés, incuber pendant 10 min dans l'obscurité et effectuer la détection sur un cytomètre en flux. Chaque groupe a 4 puits répliqués.

Traitement statistique : les données sont représentées par x ± s, la comparaison entre plusieurs groupes est effectuée par le test de Kruskal-Wallis et la comparaison par paires est effectuée par le test de Mann-Whitney, et P<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

Effets de Cistanche sur l'apoptose des cellules PC12

2. Résultats

2.1 Observation au microscope à fluorescence des cellules PC12

Normalement cultivéCellules PC12peut émettre une fluorescence uniforme après avoir été colorée par Hoechst33342, et une fluorescence de masse granulaire densément colorée et une fluorescence blanche en pointillés peuvent être observées dans le noyau cellulaire apoptotique. Le noyau de la plupart des cellules du groupe normal est relativement uniforme. Fluorescence bleue, fluorescence condensée en forme de point faiblement visible, sa fluorescence condensée en forme de point est plus faible que les cellules de contrôle MPP plus. Les cellules normalement cultivées présentent une fluorescence bleue uniforme après coloration Hoechst et la morphologie du noyau est régulière (Fig. 1A); Après MPP plus, la chromatine nucléaire apparaît concentrée, ou fortement condensée, montrant une fluorescence de points irrégulière, ou marginalisée ; noyaux cellulaires tardifs divisés en fragments (Fig 1B). Dose équivalente et 2 fois la dose équivalente Les cellules duCistanchele sérum médicamenté plus le groupe M PP plus étaient proches de la normale (Fig 1C, D).

Fig. 1Cellules PC12teinté avec Hoechst33342(Ho)

A :Témoin :La chromatine uniformément répartie et colorée régulièrement ;B :MPP plus traité :La condensation et la margination de la chromatine sur la membrane nucléaire ;C :EquivalentCistancheplus MPP plus traité ed;D :Cistanche double équivalent plus MPP plus traité, la chromatine est normale.

2.2 Observation au microscope électronique à projection

Normalement cultivéCellules PC12ont une chromatine nucléaire uniforme, une membrane nucléaire claire et complète, des mitochondries cytoplasmiques abondantes et des organites complets (Fig 2A). Après le traitement MPP plus, les cellules PC12 ont considérablement changé, la membrane cellulaire est intacte, les microvillosités de surface ont disparu et le cytoplasme est concentré, la chromatine est condensée, cassée, fortement condensée et rassemblée sur la surface interne de la membrane nucléaire, montrant les caractéristiques deapoptose, principalement dans les cellules apoptotiques précoces et intermédiaires (Fig 2B, C). Cellules apoptotiques dans chaque groupe contenantCistancheles sérums sont évidents Diminution, la chromatine nucléaire est uniformément répartie, la membrane nucléaire est claire et complète et les organites sont intacts, à proximité de la cellule illustrée à la figure 2A.

2.3 Résultats des tests de cytométrie en flux

La phosphatidylsérine (PS) située sur la face interne de la membrane cellulaire a migré vers la face externe de la membrane cellulaire au début de laapoptose. Les taux d'apoptose de chaque groupe étaient (2,3 ± 0.11) % , (2,8 ± 0.21) % , (1{{10}}.2 ± {{ 14}}.60) pour cent , (16,0 ± 0,87) pour cent et (18,6 ± 0,67) pour cent . L'analyse du test de somme des rangs du groupe B, C, D par rapport au groupe E P<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

Figure 2Cellules PC12ultrastructure EM ×6000

A : Sans MPP plus chromatine uniformément dispersée, cytoplasme légèrement dense aux électrons, structure organite normale et membrane cellulaire intacte ; B, C : Exposés à 200 μmol/ LM PP plus. Phase apoptotique précoce, condensation périphérique de la chromatine, structure cytoplasmique presque normale (B). Phase post-otique tardive, condensation supplémentaire de la chromatine, augmentation de la densité électronique cytoplasmique, absence de structure organite normale et perturbation de l'intégrité de la membrane cellulaire (C).

3. Débat

La neurotoxicité de M PP plus est un processus complexe d'action à plusieurs composants, y compris l'effet d'empêcher le remplacement des mitochondries et des vésicules synaptiques par la dopamine pour produire des espèces réactives de l'oxygène [1]. À l'heure actuelle, on pense que la plupart d'entre eux sont liés aux cellules mitochondrialesapoptoseet endogène L'effet neurotoxique de la dopamine conduit à l'apoptose liée [,2] Dans le processus d'observation de l'apoptose de la lignée cellulaire dopaminergique substantia nigra SN4741 par M PP plus , il y a l'activation de Caspase-1 et Caspase{ {4}} [3] .1 μmol/ L's MPP plus agit sur les cellules SH-SY5Y du neuroblastome surrénalien et peut augmenter l'expression de la protéine Bcl-2 liée à l'apoptose après quelques jours [4].Cistancheest une feuille sèche et écailleuse du genre Cistanche (Cistanche) de la familleCistanche. La tige charnue du cistanche a un bon effet curatif dans le traitement de la maladie d'Alzheimer et de la MP. Les glycosides totaux de cistanche peuvent efficacement piéger divers radicaux libres d'oxygène actif et peuvent protéger l'oxydation de l'ADN causée par OH. [5]. Sheng et al. [6] la recherche a confirmé que Cistanche L'extrait de tubulcoside B peut atténuer la cytotoxicité induite par le MPP plus, affaiblir l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène dans la cellule et avoir un effet antagoniste sur le MPP plus -induitapoptoseet le stress oxydatif. Nous avons observé queCistanchea un effet antagoniste sur le PC12 induit par le MPP plus L'effet de laapoptose, et l'effet protecteur deCellules PC12augmente avec l'augmentation de la dose.

Effets de Cistanche sur l'apoptose des cellules PC12

Référence

[1] Lotharius J, O Malley KL. Le médicament induisant le parkinsonisme 1- méthyl-4-phénylpyridinium déclenche l'oxydation intracellulaire de la dopamine. Un nouveau mécanisme de toxicité [J]. J Biol Chem, 2000 ;275 (49) :38581-38588 .

[2] Maruyama W, Naoi M. Mort cellulaire dans la maladie de Parkinson [J]. J Neurol, 2002 ;249(S Suppl 2) :6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, et al. La mort des cellules dopaminergiques induite par le MPP(plus), l'oxydant et des neurotoxiques spécifiques partagent le même mécanisme moléculaire [J]. J. Neurochem, 2001 ;76(4) : 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM, et al. La fonction de transport d'électrons mitochondrial perturbée augmente l'expression des protéines anti-apoptotique Bcl-2 et Bcl-XL dans le neuroblastome SH-SY5Y et les cellules cybrides de la maladie de Parkinson par le stress oxydatif [J]. J Neurosti Res, 2000 ;6(1) :693-700.

[5] Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Lia, et al. Élimination in vitro des radicaux libres et effets protecteurs sur les dommages à l'ADN induits par OH causés par les glycosides totaux deCistanche[J]. Journal pharmaceutique chinois, 2001 ; 36(1) : 29-32. Wang XW, Jiang XY, Wu LY, et al. L'étude des glycosides totaux de pouces éliminant les radicaux libres et protégeant l'ADN lésé in vitro [J]. Chin Pharm, 2001 ;36(1) :29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B decistanchela salsa sauve les cellules neuronales PC12 de l'ion induit par le 1-méthyl-4-phénylpyridiniumapoptoseet stress oxydatif[ J].Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

Extrait de : Journal de la quatrième université médicale militaire (J Fourth Mil Med Univ) 2004 ; 25(10)

ID de l'article : 1000-2790 (2004) 10-0955-03