Comment l'Alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie dentaire ?

L'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, restaure l'organisation de l'actine et améliore le dysfonctionnement des tubules proximaux in vitro et dans un modèle murin du syndrome de Lowe et de la maladie de Dent

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ Whatsapp : 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Béatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valéria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6et Jennifer L. Galop^2,6

MOTS-CLÉS : cytosquelette ; endocytose; lipides; tubule proximal ; syndrome de Fanconi rénal

Les mutations de perte de fonction dans le gène OCRL, qui code pour le phosphatidylinositol [PI] 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] 5-phosphatase OCRL, provoquent une endocytose défectueuse et un dysfonctionnement des tubules proximaux dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent2. Le défaut est dû à des niveaux accrus de PI(4,5)P2 et à une polymérisation aberrante de l'actine, bloquant le trafic endosomal. Le PI 3-phosphate [PI(3)P] a été récemment identifié comme un coactivateur avec le PI(4,5)P2 dans la voie de l'actine. Ici, nous avons testé l'hypothèse selon laquellephosphoinositide 3-kinase(PI3K) peuvent sauver le défaut endocytaire conféré par la perte d'OCRL, en rééquilibrant les signaux des phosphoinositides vers la machinerie de l'actine. La large gamme PI3K(phosphoinositide 3-kinase)inhibiteur copanlisib et classe IA p110a PI3K(phosphoinositide 3-kinase) inhibiteur alpelisibréduction de la polymérisation aberrante de l'actine dans les cellules rénales humaines déficientes en OCRL in vitro. Les niveaux de PI 3,4, 5- trisphosphate, PI (4,5) P2 et PI (3) P ont tous été réduits avec le traitement à l'alpelisib, et l'inactivation de l'ARNsi de la sous-unité catalytique PI3K p110a a phénocopié le phénotype de l'actine. Dans un modèle de souris OcrlY/- humanisé, l'alpelisib a réduit la coloration de l'actine endosomale tout en restaurant l'architecture des fibres de stress et les niveaux de mégaline au niveau de la membrane plasmique des cellules tubulaires proximales, reflétés par une meilleure absorption endocytaire des protéines de faible poids moléculaire in vivo. Ainsi, nos résultats confirment le lien entre les lipides phosphoinositides, la polymérisation de l'actine et le trafic endocytaire dans le tubule proximal et représentent une preuve de concept pour la réutilisation de l'alpelisib dansSyndrome de Lowe/maladie de Dent2.

Déclaration de traduction

Syndrome de Lowe et maladie de Dent2, causée par des mutations du lipide phosphoinositide 5-phosphatase OCRL, se manifestant par un dysfonctionnement des tubules proximaux et une protéinurie de bas poids moléculaire avec seulement des soins de soutien disponibles. Nos constatations révèlent que laphosphoinositide 3-kinase inhibiteur alpelisib, qui est actuellement approuvé pour le traitement du cancer, atténue l'équilibre aberrant des phosphoinositides et le phénotype d'actine associés à la perte d'OCRL, entraînant une amélioration substantielle de la machinerie endocytaire et de la capacité d'absorption dans les systèmes cellulaires et un modèle de souris humanisé pour le syndrome de Lowe/la maladie de Dent 2. Compte tenu de son profil d'innocuité apparent, l'alpelisib est un candidat prometteur pour la réorientation des médicaments dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent.

Les cellules épithéliales tapissant les tubules proximaux (PT) du rein possèdent une voie endolysosomale efficace médiée par les récepteurs qui récupère et traite les substances essentielles qui sont filtrées à travers le glomérule. Les troubles congénitaux affectant les endolysosomes provoquent un dysfonctionnement du PT (syndrome de Fanconi rénal) avec perte urinaire de solutés et de protéines de bas poids moléculaire (LMW), souvent compliquée par des complications métaboliques et de croissance et le développement d'une maladie rénale chronique.¹La mutation inactivatrice de l'OCRL a été associée à la maladie de Dent 2 (MIM #300555), un trouble caractérisé par un dysfonctionnement du PT, des calculs rénaux et une insuffisance rénale progressive, ainsi qu'au syndrome oculo-cérébrorénal de Lowe (MIM #309000), qui se manifeste, en plus au dysfonctionnement du PT et à l'insuffisance rénale, aux manifestations systémiques telles que les cataractes congénitales, les troubles cognitifs et l'hypotonie.^2-4Les traitements actuels pour la maladie de Dent 2 et le syndrome de Lowe ne sont que de soutien.

Figure 1|PI3K(phosphoinositide 3-kinase)les inhibiteurs soulagent l'assemblage aberrant de l'actine au niveau des endosomes dans un modèle cellulaire de rein humain déficient en OCRL (HK2). ( a ) Étapes de conversion des lipides phosphoinositides pertinentes pour cette étude indiquant les conversions entre PI (4,5) P2, PI (3,4,5) P2 et PI (3) P avec les enzymes les plus pertinentes en gras, les plus pertinentes conversions en traits pleins, et d'autres en traits pointillés. Le PI(4,5)P2 est élevé dans le syndrome de Lowe en raison du manque d'activité 5-phosphatase de l'OCRL et provient de la phosphorylation du PI par les phosphatidylinositol 4-kinases (PI4K) et PI(4) P5-kinase (PIP5K). PI(4,5)P2 est phosphorylé par les PI3K de classe I pour produire PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 peut être déphosphorylé en PI(4,5)P2 par PTEN ou en PI(3,4)P2 par SH-2-contenant l'inositol 50 polyphosphates (SHIP) 1 et 2, synaptojanin 1 et 2, et aussi OCRL, bien que ce soit (suite)

Figure 1|(suite) considérée comme mineure. PI (3,4) P2 est déphosphorylé en PI (3) P par l'inositol polyphosphate -4- phosphatase de type IA (INPP4A) et B. PI (3) P est également fabriqué au niveau des endosomes via la phosphorylation de PI par la classe III PI3K(phosphoinositide 3-kinase), protéine de tri vacuolaire Vps34. ( b ) Western blots illustrant la perte d'expression d'OCRL dans la lignée cellulaire knock-out (KO) HK2 OCRL CRISPR par rapport aux cellules témoins HK2 de type sauvage (WT) avec la tubuline comme contrôle de chargement. ( c - e ) Micrographies confocales Airyscan représentatives et quantification du chevauchement précoce de l'antigène endosome 1 (EEA1) / actine (exprimé en pourcentage du nombre total de vésicules EEA1þ détectées) pour les cellules HK2 WT ou OCRL KO traitées avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) ( d ) ou l'inhibiteur indiqué et fixé à l'aide du fixateur de formaldéhyde à 4 %. Dans tous les cas, les images illustrent une seule tranche z d'une pile confocale traitée par Airyscan de cellules immunomarquées pour EEA1 (jaune), phalloïdine (actine, magenta) et 40,6-diamidino{ {14}}phénylindole (DAPI) (cyan). Barres=5 mm. Dans les quantifications, les lignes indiquent la moyenne ± SEM et chaque point de données est une cellule individuelle. Dans toutes les expériences, les traitements ont été appliqués 16 heures avant la fixation. Dans toutes les quantifications, la signification statistique a été évaluée par une analyse de variance de Kruskal-Wallis (KW) avec le test de comparaisons multiples de Dunn. ( c ) Cellules WT ou KO traitées avec du DMSO ou 1 00 nM de copanlisib, démontrant le sauvetage du chevauchement actine-endosomal. Test KW : ***P < 0.0{{50}}1,="" comparaisons="" multiples ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" copanlisib="" les="" deux="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (non="" significatif="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" et="" 63="" cellules="" pour="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" et="" ko="" copanlisib,="" respectivement.="" (="" d="" )="" cellules="" wt="" ou="" ko="" traitées="" avec="" du="" dmso="" ou="" 10="" mm="" d'alpelisib,="" démontrant="" le="" sauvetage="" du="" chevauchement="" actine-endosomique.="" test="" kw="" :="" ***p="">< 0,001,="" comparaisons="" multiples ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" les="" deux="" ***="" p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" versus="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 et 41 cellules pour WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO et KO alpelisib, respectivement. ( e ) Cellules WT ou KO traitées avec du DMSO, 10 mM de GSK2636771 ou 10 mM d'idélalisib, démontrant qu'aucun des deux composés n'est capable de réduire de manière significative le chevauchement actine-endosomal. Test KW : ***P < 0,001,="" comparaisons="" multiples ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" versus="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 et 145 cellules pour WT DMSO, WT GSK2636771, WT idélalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 et KO idélalisib, respectivement. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.kidney-international.org

Comment l'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie de Dent ?

La protéinurie LMW est une caractéristique constante observée dans le syndrome de Lowe / la maladie de Dent 2, révélant que l'OCRL affecte l'endocytose médiée par les récepteurs.⁵OCRL code pour la phosphatidylinositol (PI) 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] 5- phosphatase OCRL,⁶qui contrôle l'identité lipidique dans la voie endolysosomale en dégradant PI(4,5)P2 (Figure 1a). Une dégradation déficiente de PI(4,5)P2 par OCRL est impliquée dans l'incapacité à décoller les vésicules recouvertes de clathrine dans les fibroblastes, accompagnée de la formation de structures "comètes" d'actine filamenteuse polymérisée à partir des organites aberrants précoces de type endosome qui en résultent.^7-9Dans d'autres types de cellules, notamment les cellules PT du rein, le déficit en OCRL entraîne des structures de «panier» d'actine F entourant des organites endolysosomales aberrantes.¹⁰L'excès de F-actine bloque le trafic membranaire par la voie endocytaire et endolysosomale, et il est suggéré de diminuer le recyclage de la mégaline du récepteur multiligand vers la membrane apicale, aggravant le défaut dans la voie endolysosomale.¹¹En accord avec un rôle primordial de la F-actine aberrante, l'absorption endocytaire défectueuse causée par les mutations OCRL est atténuée en ciblant la machinerie de l'actine avec latrunculine B, ou en appauvrissant les protéines régulatrices de l'actine ainsi que par de petits ARN interférents (ARNsi) - médiée par l'épuisement de PI(4)P 5-kinase pour ajuster la synthèse de PI(4,5)P2^7,10(Figure 1a).

La polymérisation de l'actine est de plus en plus comprise comme résultant non seulement de PI(4,5)P2 mais aussi d'autres lipides phosphoinositides. Par exemple, PI(3,4,5)P3 active la GTPase Rac de type Rho, et PI(3)P agit conjointement avec PI(4,5)P2 pour stimuler la polymérisation de l'actine en aval d'une autre GTPase de type Rho, Cdc42.^12-14L'interconversion de ces phosphoinositides est couplée au mouvement des lipides à travers la voie endocytaire et endosomale. PI(4,5)P2 est phosphorylé par la phosphatidylinositol- 30 -kinase de classe I (PI3K) en PI(3,4,5)P3 au niveau de la membrane plasmique et devient progressivement déphosphorylé en PI(3,4)P2 et PI (3)P ou PI(4,5)P2.^14,15Le PI(3)P est enrichi au niveau des endosomes, où il est essentiel à leur fonction et principalement fabriqué par phosphorylation directe du PI par la classe III PI3K(phosphoinositide 3-kinase), Vps34¹⁶(Figure 1a). Dans une lignée cellulaire épithéliale pigmentée rétinienne (RPE) déficiente en OCRL, les comètes d'actine générées sont réduites par un traitement avec PI3K (phosphoinositide 3-kinase)wortmannin et Vps34-IN1, en accord avec des études biochimiques montrant une corégulation de l'actine via la coïncidence de PI(3)P et PI(4,5)P2.¹⁴

Le sauvetage de l'endocytose observé lors du ciblage de la machinerie de l'actine dans les cellules de patients OCRL et knock-out (KO),^7,10ainsi qu'une régulation amont de l'actine par PI3K(phosphoinositide 3-kinase)activité¹⁴et la nature hautement interconnectée de la conversion PI, offre une possibilité intrigante que la classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase)les inhibiteurs peuvent être utiles dans le syndrome de Lowe. Ces inhibiteurs, développés pour le traitement du cancer, sont approuvés pour une utilisation clinique¹⁷et sont donc potentiellement propices à la réutilisation des médicaments. Bien que des composés tels que le copanlisib¹⁸ont une large spécificité et des effets secondaires, un succès récent a été démontré pour des inhibiteurs plus spécifiques. Idélalisib,¹⁹qui cible PI3K(phosphoinositide 3-kinase)la sous-unité p110d, est approuvée pour le lymphome lymphocytaire chronique, et l'alpelisib, qui cible p110a, est approuvé pour une utilisation dans le cancer du sein.^20,21De plus, l'alpelisib a montré un bénéfice clinique chez les enfants atteints du syndrome PROS/CLOVES,²²un syndrome de prolifération rare résultant de l'activation de PIK3A.

Ici, nous avons testé l'hypothèse que la classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase)les inhibiteurs peuvent sauver le défaut endocytaire dû à la perte d'OCRL, en utilisant des modèles cellulaires et murins établis.^10,11,23Nous montrons que l'inhibition de PI3K(phosphoinositide 3-kinase)l'activité via le copanlisib ou l'alpelisib, ou la déplétion médiée par l'ARNsi de la sous-unité catalytique cible de l'alpelisib p110a réduit la polymérisation excessive de l'actine dans les cellules rénales humaines (HK2) déficientes en OCRL. En nous concentrant sur l'alpelisib en tant que composé le plus spécifique pour une utilisation clinique, nous montrons qu'il réduit la polymérisation de l'actine et améliore l'absorption par la voie endolysosomale dans les cellules PT d'Ocrl humanisé^Y/-souris in vitro. De plus, le traitement à l'alpelisib in vivo atténue la protéinurie, réduit le dysfonctionnement du PT et sauve les niveaux cellulaires de mégaline chez l'Ocrl humanisé.^Y/-souris. Ces résultats soutiennent l'alpelisib en tant que candidat pour la réutilisation de médicaments dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent 2.

Figure 2|Les effets de l'Alpelisib sur l'actine sont dose-sensibles et récapitulés par l'ARNsi de PI3K(phosphoinositide 3-kinase)p110a. (a) Micrographies confocales Airyscan représentatives (fixées à l'aide du fixateur de formaldéhyde à 4 % et immunomarquées pour l'antigène d'endosome précoce 1 [EEA1], jaune ; actine [phalloïdine], magenta ; et 4{{40}},{{ 5}}diamidino-2-phénylindole [DAPI], cyan ; barres=5 mm) et quantification de cellules rénales humaines (HK2) de type sauvage (WT) ou knock-out (KO) traitées avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) ou les doses indiquées d'alpelisib pendant 16 heures, démontrant un sauvetage dose-sensible du chevauchement actine-endosome. Dans tous les cas, les lignes indiquent la moyenne ± SEM et les points indiquent les cellules individuelles. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 et 67 cellules pour le contrôle WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , et KO 2,5, 5, 10, 15, 25 et 50 mM alpelisib, respectivement. Signification statistique évaluée par le test de Kruskal-Wallis (KW) avec le test de comparaisons multiples de Dunn : global ***P < 0,001,="" comparaisons="" multiples="" ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" et="" 50="" mm="" alpelisib="" tous="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" versus="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" et="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (non significatif [ns]). ( b ) Western blot pour p110a et le contrôle de chargement a-tubuline de cellules WT ou KO traitées avec un ARNsi brouille (Scram.) Ou p110a. (c) Micrographies confocales Airyscan représentatives (fixées à l'aide du fixateur de formaldéhyde à 4 % et immunomarquées pour EEA1, jaune ; actine [phalloïdine], magenta ; et DAPI, cyan ; barres =5 mm) et quantification des cellules WT ou KO traitées avec brouillage (S) ou p110a siARN, démontrant la réduction du chevauchement de l'actine EEA 1- sur l'épuisement de p110a. Test KW avec test de comparaisons multiples de Dunn : ***P < 0,001,="" comparaisons="" multiples="" ;="" brouillage="" wt="" contre="" brouillage="" ko,="" brouillage="" ko="" contre="" siarn="" p110a="" ko="" les="" deux="" ***="" p=""><0,001. n="79," 108,="" 93="" et="" ​​131="" cellules,="" respectivement.="" hk2,="" rein="" humain;="" pi3k,="" phosphatidylinositol-30="" -kinase ;="" siarn,="" petit="" arn="" interférant.="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

Figure 3|Les niveaux de phosphatidylinositol (PI) 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] sont élevés avec OCRL knock-out (KO) et PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , et PI(3)P sont supprimés par le traitement à l'alpelisib. Dans toutes les expériences, les traitements indiqués ont été appliqués 16 heures avant la fixation. Dans les quantifications, les lignes indiquent la moyenne ± SEM, et chaque point de données résulte d'une cellule individuelle. Dans toutes les quantifications, la signification statistique a été évaluée par une analyse de variance de Kruskal-Wallis (KW) avec le test de comparaisons multiples de Dunn. Barres=20mm dans toutes les images. ( a ) Micrographies à champ large représentatives de cellules rénales humaines de type sauvage (WT) ou KO (HK2) traitées avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) ou 10 mM d'alpelisib, puis fixées avec le fifix de la membrane plasmique et immunomarquées pour PI (3,4,5 )P3 (rouge) et 40,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (cyan), avec quantification de l'intensité moyenne de marquage cellulaire PI(3,4,5)P3, montrant l'efficacité de l'alpelisib traitement sur la synthèse de PI(3,4,5)P3. N=96, 128 et 109 cellules pour WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO et KO alpelisib, respectivement. kW (suite)

Figure 3|(suite) test : global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples ;="" wt="" dmso="" contre="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" contre="" wt="" alpelisib="" et="" ko="" dmso="" contre="" ko="" alpelisib="" tous="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (="" b="" )="" micrographies="" confocales="" représentatives="" de="" cellules="" wt="" ou="" ko="" hk2="" traitées="" avec="" du="" dmso,="" 1="" 0="" mm-="" ou="" 50-="" mm="" alpelisib="" pendant="" 16="" heures,="" puis="" fixées="" avec="" le="" fixateur="" de="" golgi="" et="" étiquetées="" à="" l'aide="" du="" m="" ch="" {{10}}sonde="" xfyve="" pi(3)p="" (magenta)="" et="" dapi="" (cyan),="" avec="" quantification="" du="" nombre="" de="" points="" ponctuels="" pi(3)p-positifs="" détectés="" dans="" les="" cellules="" traitées="" avec="" une="" gamme="" de="" concentrations="" d'alpelisib="" ,="" comme="" indiqué,="" montrant="" que="" les="" points="" ponctuels="" positifs="" au="" pi(3)p="" sont="" réduits="" en="" fonction="" de="" la="" dose.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" et="" 215="" cellules="" pour="" le="" contrôle="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" et="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" et="" 50="" mm="" d'alpelisib,="" respectivement.="" test="" kw="" :="" global="" ***p="">< 0,001,="" comparaisons="" multiples="" ;="" wt="" dmso="" contre="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" contre="" wt="" 10="" et="" alpelisib="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" contre="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" tous="" ***="" p="">< 0,001 ;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" et="" 5="" mm="" alpelisib="" les="" deux="" p=""> 0,9999 (non significatif [ns]) ; KO DMSO versus KO 10 mM alpelisib **P=0.0049 ; KO DMSO versus KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. ( c ) Micrographies à champ large représentatives de cellules WT ou KO HK2 traitées avec du DMSO ou 10 mM d'alpelisib, puis fixées avec le fixateur de membrane plasmique et immunomarquées pour PI (4,5) P2 (jaune) et DAPI (cyan), avec quantification de l'intensité moyenne de marquage du PI(4,5)P2 cellulaire, montrant une augmentation du PI(4,5)P2 de la membrane plasmique dans les cellules KO, qui est réduite par le traitement à l'alpelisib, en particulier dans les cellules KO. N=126, 112, 85 et 116 cellules pour WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO et KO alpelisib, respectivement. Test KW : global ***P < 0,001,="" comparaisons="" multiples="" ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" et="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" les="" deux="" ***p="">< 0,001 ;="" wt="" dmso="" contre="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (="" d="" )="" micrographies="" à="" champ="" large="" représentatives="" de="" cellules="" wt="" ou="" ko="" hk2="" traitées="" avec="" du="" dmso="" ou="" 10="" mm="" d'alpelisib,="" puis="" fixées="" avec="" le="" fifix="" de="" formaldéhyde="" à="" 4%="" et="" immunomarquées="" pour="" pi="" (4,5)="" p2="" (jaune)="" et="" dapi="" (cyan),="" avec="" quantification="" du="" nombre="" de="" points="" lacrymaux="" pi(4,5)p2-positifs,="" montrant="" une="" augmentation="" des="" points="" lacrymaux="" pi(4,5)p2="" dans="" les="" cellules="" ko,="" qui="" est="" réduite="" par="" le="" traitement="" à="" l'alpelisib,="" en="" particulier="" dans="" les="" cellules="" ko.="" n="75," 65,="" 52="" et="" 69="" cellules="" pour="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" et="" ko="" alpelisib,="" respectivement.="" test="" kw="" :="" global="" ***p="">< 0,001,="" comparaisons="" multiples="" ;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso="" et="" ko="" dmso="" versus="" ko="" alpelisib="" les="" deux="" ***p="">< 0,001 ;="" wt="" dmso="" versus="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, unités arbitraires. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.kidney-international.org.

Comment l'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie de Dent ?

1. RÉSULTATS

1.1 Les inhibiteurs PI3K de classe I réduisent l'agrégation d'actine dans les cellules OCRL-KO HK2

Nous avons utilisé l'édition du gène CRISPR-Cas9 pour désactiver (KO) OCRL dans la lignée cellulaire HK2 afin de permettre le test de la classe I PI3K (phosphoinositide 3-kinase)inhibiteurs sur l'agrégation caractéristique de l'actine au niveau des compartiments endolysosomiques.^7,9,10,14Western blot a vérifié une réduction de 98.0± 0.7 % de l'expression d'OCRL dans les lysats des cellules KO HK2 (Figure 1b). L'OCRL KO a récapitulé le phénotype du panier d'actine dans les cellules HK2, comme l'indique un chevauchement accru entre l'actine F et l'antigène endosome précoce 1 (EEA1), quantifié sur les piles z de microscopie confocale Airyscan (Figure 1c – e). Ce chevauchement accru observé dans les cellules OCRL KO a été inversé par un traitement au copanlisib (C), un PI3K(phosphoinositide 3-kinase)inhibiteur qui cible p110a et d et dans une moindre mesure les isoformes p110b et g (Figure 1c). Par western blot d'extraits de cellules entières HK2, nous avons constaté que le PI3K(phosphoinositide 3-kinase)Les sous-unités régulatrices de p110 a, b et d étaient toutes bien exprimées dans les cellules de type sauvage (WT) et KO, avec seulement des traces de l'isoforme p110g présente (Figure supplémentaire S1A).

Nous avons distingué le PI3K(phosphoinositide 3-kinase)spécificité de l'inhibition de la F-actine en utilisant l'alpelisib (A), un inhibiteur sélectif de p110a, et GSK2636771 (G) et l'idelalisib (I), des inhibiteurs sélectifs de p110b et p110d, respectivement (Figure supplémentaire S1A). Bien que le traitement à l'alpelisib ait entraîné une réduction similaire de la polymérisation de l'actine endosomale par rapport au copanlisib (Figure 1d), le GSK2636771 et l'idélalisib ont eu un faible effet sur l'accumulation d'actine (Figure 1e). La classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase)les inhibiteurs n'avaient pas de toxicité accrue sur OCRL KO par rapport aux cellules non modifiées, sur la base du test MTT (Figure supplémentaire S1B).

1.2 L'alpelisib et le knockdown de p110a sauvent le phénotype de l'actine dans les cellules HK2

Pour nos études qui ont suivi, nous nous sommes concentrés sur l'alpelisib car c'est le PI3K le plus sélectif et le moins toxique (phosphoinositide 3-kinase)développé jusqu'à présent et est actuellement utilisé pour traiter une suractivation en mosaïque de PI3K classe Ia chez les enfants atteints du syndrome PROS/CLOVES.²²L'alpelisib a réduit les paniers d'actine dans les cellules OCRL KO HK2 en fonction de la dose (Figure 2a). Les effets ont été observés à une dose de 10 mM dès 4 heures après le traitement, sans toxicité apparente (Figure supplémentaire S2). Pour tester si PI3K(phosphoinositide 3-kinase)l'inhibition par l'alpelisib était la source de la diminution de la coloration de l'actine, nous avons spécifiquement réduit sa cible, la sous-unité p110a, à l'aide d'ARNsi (Figure 2b). Comparé au traitement avec un siRNA témoin (séquence brouillée), le siRNA contre p110a a produit une déplétion de 78,3 ± 4,8 % et 68,9 ± 7,7 % de la protéine p110a dans les cellules WT et OCRL KO HK2, respectivement, reflétée par une réduction significative des paniers d'actine ( Figure 2c).

1.3 Niveaux réduits de PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 et PI(3)P dans les cellules HK2 traitées à l'alpelisib

Pour examiner comment les lipides phosphoinositides sont affectés par le traitement OCRL KO et alpelisib, nous avons coloré les cellules HK2 avec des anticorps ou des domaines protéiques contre PI(3,4,5)P3, PI(3)P et PI(4,5)P2, en utilisant conditions de fixation optimisées pour la membrane plasmique ou la coloration intracellulaire.^24,25PI(3,4,5)P3 a une localisation diffuse sur la membrane plasmique, et le traitement à l'alpelisib (10 mM) a induit une forte diminution de la coloration de PI(3,4,5)P3 dans les cellules KO WT et OCRL, comme attendu de son mécanisme d'action et de sa spécificité pour la classe IA PI3K(phosphoinositide 3-kinase)p110a (Figure 3a). On s'attend à ce que PI(3,4,5)P3 soit déphosphorylé progressivement au fur et à mesure que les membranes sont endocytosées et transportées dans les endosomes.^14,26,27En fixant les cellules de manière à préserver le PI(3)P intracellulaire,²⁵nous avons constaté que les points ponctués de PI (3) P étaient également réduits par le traitement à l'alpelisib (d'une manière dose-dépendante apparente à partir de concentrations aussi faibles que 10 mm pour le traitement de 16- heures) dans les cellules KO WT et OCRL (Figure 3b et Figure supplémentaire S2C). Comme prévu, le KO d'OCRL dans les cellules HK2 a induit une augmentation marquée des niveaux de PI(4,5)P2 à la fois au niveau de la membrane plasmique (Figure 3c) et intracellulaire (Figure 3d), par rapport aux cellules WT.^10,28Le traitement à l'alpelisib a considérablement réduit l'élévation du PI (4,5) P2 généré par OCRL KO dans les deux compartiments, alors qu'il n'a eu aucun effet sur les cellules WT (Figures 3c et d). L'alpelisib inhiberait la PI 4-kinase b avec une concentration inhibitrice de 50 % de 0,5 mM,¹⁹qui est une source possible de la réduction de PI(4,5)P2. Collectivement, nos données suggèrent que l'alpelisib inhibe l'assemblage de l'actine sur les endosomes OCRL KO via un effet bispécifique sur les niveaux de PI(4,5)P2 et PI(3)P.

Figure 4|L'alpelisib atténue les défauts d'actine d'Oral chez les Ocrl humanisés en culture^Y/-souris PTC (m PTC). ( a ) Micrographies confocales représentatives d'intensité maximale en projection Z de OcrlY / þ ou Ocrl^Y/-m PTC traités avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) ou 10 mM d'alpelisib pendant 16 heures, puis fixés avec le fixateur de formaldéhyde à 4 % et immunomarqués pour l'actine (phalloïdine) (blanc) et le 40,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu), avec quantification du degré de présence des fibres de stress dans chaque condition, montrant que les fibres de stress sont perdues dans Ocrl^Y/-m Les PTC sont sauvés par un traitement à l'alpelisib. Les lignes indiquent les moyennes ± SEM et les points de données indiquent chaque région d'imagerie : N =5 régions d'imagerie par condition (chacune contenant environ 15 à 20 cellules). L'importance a été évaluée par une analyse de la variance de manière 1- ordinaire (ANOVA) avec le test de comparaison multiple de Holm-Sidak, **P=0.001, comparaisons multiples ; Ocrl Y/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO **

P=0.002, Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrLY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (non significatif [ns]). Barres=20mm. ( b ) Rendus de surface 3D représentatifs à fort grossissement de PTC Ocrl m traités avec du DMSO ou 10 mM d'alpelisib pendant 16 heures, puis fixés avec le fixateur de formaldéhyde à 4% et immunomarqués pour l'antigène d'endosome précoce 1 (EEA1) (violet), l'actine ( phalloïdine, jaune) et DAPI (bleu), et quantification illustrant le sauvetage du chevauchement actine-endosomal par l'alpelisib. Vues à faible grossissement indiquant des aperçus de (suite)

Figure 4|(suite) ces régions sont présentées dans la figure supplémentaire S4B et les films supplémentaires S1 à S3. Les lignes indiquent la moyenne ± SEM. N=42, 47 et 45 champs sélectionnés au hasard pour OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO et Ocrl^Y/-þ conditions d'alpelisib, respectivement, dans chaque cas regroupées à partir de 4 reins de souris par condition. La signification a été testée par Kruskal-Wallis (KW) ANOVA avec le test de comparaisons multiples de Dunn : global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001 ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Barres=1 mm. (c) Micrographies confocales représentatives de OcrlY/þ ou Ocrl^Y/-m PTC traités avec du DMSO ou de l'alpelisib 10-mM, puis fixés avec le fixateur de Golgi et marqués à l'aide de la sonde m Ch-2xFYVE PI(3)P (magenta) et DAPI (cyan), avec quantification de le nombre de points lacrymaux positifs au PI(3)P détectés dans les cellules. N=188, 177, 246 et 206 cellules de OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO et Ocrl^Y/-þ alpelisib, respectivement ; les cellules ont été regroupées à partir de 3 reins oraux par groupe. Test KW : global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrLY/þ DMSO versus OcrLY/þ alpelisib et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib, tous ***P < 0.001.="" barres="20" mm.="" (d)="" micrographies="" confocales="" représentatives="" de="" ocrly/þ="" ou="">^Y/-m PTC traités avec du DMSO ou 10 mM d'alpelisib pendant 16 heures, puis fixés avec le fixateur de formaldéhyde à 4 % et immunomarqués pour le phosphatidylinositol (PI) 4,5-bisphosphate [PI(4,5) P2] (jaune) et DAPI (cyan), avec quantification du nombre de points ponctuels PI(4,5)P2-positifs, montrant une augmentation des points ponctuels PI(4,5)P2 dans Ocrl^Y/-cellules, qui est réduite par le traitement à l'alpelisib. N=477, 444, 423 et 494 de OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO et Ocrl^Y/-þ alpelisib, respectivement ; les cellules ont été regroupées à partir de 3 reins oraux par groupe. Test KW : global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrLY/þ DMSO versus OcrLY/þ alpelisib et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib, tous ***P < 0.001.="" barres="20" mm.="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

1.4 L'alpelisib réduit les phosphoinositides intracellulaires et atténue les défauts du cytosquelette dans l'Ocrl^Y/-m PTC

Nous avons ensuite testé si l'alpelisib avait les mêmes effets dans les cellules primaires des cellules PT dérivées du modèle de souris humanisé Ocrldefificient (Ocrl^Y/-), qui récapitule la polymérisation anormale de l'actine et le défaut endocytaire observés dans les cellules dérivées du patient.^10,11Les PTC de souris (m PTC) s'exprimaient de manière similaire à la classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase) sous-unités régulatrices aux cellules HK2 dans WT et Ocrl^Y/-souris et présentaient un profil de toxicité similaire vis-à-vis de l'alpelisib lorsqu'il était évalué par des tests MTT (Figure supplémentaire S3). L'imagerie par microscopie confocale a révélé une perturbation frappante de l'architecture normale des fibres de stress F-actine dans m PTC d'Ocrl^Y/-par rapport aux souris OcrlY / þ, probablement en raison de la relocalisation des protéines régulatrices de l'actine de leurs emplacements cellulaires normaux vers les endosomes, car de grands assemblages d'actine entourent ces organites et seraient à l'origine du défaut de trafic.^10,29Traitement d'Ocrl^Y/- m PTC avec alpelisib (10 mM) ont restauré l'architecture de la fibre de contrainte (Figure 4a).

Comment l'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie de Dent ?

Comme principal problème dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent2 est la réduction du trafic endosomal et la dégradation conséquente de la mégaline, nous avons cherché à distinguer l'actine endosomique des fibres de stress. Nous avons collecté des piles z confocales à balayage laser dans toutes les cellules, reconstruit le motif de coloration dans les rendus de surface 3D et utilisé la forme/les paramètres de taille pour identifier les structures d'actine ponctuées et le degré de chevauchement avec les structures endosomales (Figure supplémentaire S4 et Films S1 –S3). Cette analyse a révélé que le traitement à l'alpelisib diminuait la polymérisation aberrante de la F-actine au niveau des endosomes colorés avec EEA1, distincts de l'architecture des fibres de stress (Figure 4b). Les m PTC dérivés de Ocrl^Y/-les souris ont montré des changements significatifs dans la coloration intracellulaire pour PI (3) P (diminué) et PI (4,5) P2 (augmenté), par rapport aux m PTC de souris WT OcrlY / þ (Figure 4c et d). Traitement des m PTC de l'Ocrl^Y/- les souris avec alpelisib ont entraîné une réduction significative de la coloration intracellulaire PI (3) P et PI (4,5) P2 (Figure 4c et d).

1.5 L'alpelisib améliore l'absorption endocytaire dans Ocrl^Y/-m PTC

Nous avons ensuite évalué si l'effet de l'alpelisib sur les défauts cytosquelettiques et vésiculaires observés dans m PTC entraînait des modifications de la capacité d'absorption endocytaire. Pour différencier l'effet de l'alpelisib sur la liaison et/ou l'internalisation du ligand, m PTCs ont d'abord été incubés avec de la sérumalbumine bovine (BSA) marquée, pour induire la liaison de la sonde avec les récepteurs endocytaires, puis incubés avec un milieu de croissance, pour suivre l'internalisation de l'albumine (figure 5a). L'OCRL^Y/-les cellules ont montré une liaison à la membrane plasmique inférieure de l'albumine sérique bovine Alexa 488- ainsi qu'une internalisation altérée de l'albumine par rapport aux cellules OcrlY/þ. Le traitement par alpelisib a sauvé à la fois la liaison et l'absorption de l'albumine dans l'Ocrl^Y/-cellules, avec un sauvetage global de 50 % de l'absorption endocytaire (figures 5b et c). Ces données ont été étayées par la mesure de l'absorption totale d'albumine (Figures supplémentaires S5a et b). Nous avons noté que le rapport d'albumine sérique bovine Alexa 488- intériorisé/lié restait similaire entre les différentes conditions (Figure 5d), ce qui implique que la réduction de l'absorption d'albumine est principalement due à une liaison altérée plutôt qu'à un processus d'internalisation défectueux en soi.

1.6 L'alpelisib améliore le dysfonctionnement du PT et l'endocytose médiée par les récepteurs dans l'Ocrl^Y/- souris

Nous avons testé l'effet thérapeutique potentiel de l'alpelisib sur le dysfonctionnement du PT in vivo. Des souris orales ont reçu soit du véhicule, soit de l'alpelisib (50 mg/kg de poids corporel par jour) par gavage oral pendant 6 semaines (figure 6a). Ce régime a été choisi en fonction d'études in vivo antérieures démontrant l'efficacité et l'innocuité.^22,30Conformément au fait que l'administration d'alpelisib est connue pour provoquer une résistance à l'insuline et une hyperglycémie,²²le traitement par alpelisib a entraîné une augmentation significative de la glycosurie à la fois dans Ocrl Y/þ et Oral^Y/-souris, qui pourraient être considérées comme un biomarqueur pour le dosage du médicament (tableau supplémentaire S1). Après 6 semaines de traitement par alpelisib, l'Ocrl^Y/-les souris ont présenté une réduction significative de l'excrétion urinaire des protéines LMW CC16 (-34 pour cent) et de l'albumine (-38 pour cent), par rapport aux témoins traités avec le véhicule (Figure 6b et c), alors que le volume de l'urine et d'autres paramètres n'ont pas été affectés (tableau supplémentaire S1). Les souris traitées à l'alpelisib des deux génotypes ont montré une réduction similaire du taux de croissance par rapport aux souris témoins, comme décrit précédemment.²²Néanmoins, les souris vectrices et traitées ont pris du poids, ce qui indique que le médicament n'affecte pas gravement le développement postnatal (figure 6d et tableau supplémentaire S1).

Pour tester si l'effet de l'alpelisib sur la protéinurie LMW reflétait la récupération de l'endocytose médiée par les récepteurs dans les cellules PT, nous avons suivi l'absorption in vivo de la b-lactoglobuline marquée Cy5- dans un rein de souris. Ocrl traité à l'alpelisib^Y/-les souris ont montré un sauvetage significatif de l'absorption de b-lactoglobuline marquée par Cy5-, proche de l'ampleur de l'internalisation observée chez les souris OcrlY/þ traitées avec le véhicule (Figure 6e). Cela s'est reflété par un sauvetage significatif de l'expression de la mégaline du récepteur endocytaire dans les cellules PT, comme observé par immunomarquage et Western blot des lysats rénaux d'Ocrl traité à l'alpelisib.^Y/-souris; notez qu'il n'y a eu aucun changement dans l'expression du marqueur PT AQP1 (Figure 6f et g et Figure supplémentaire S5C et D). Ces données montrent que le PI3K(phosphoinositide 3-kinase)inhibiteur alpelisibinduit une amélioration substantielle de la machinerie endocytaire PT et réduit la protéinurie LMW dans un modèle de souris humanisée pour le syndrome de Lowe.

Figure 5|L'alpelisib améliore l'absorption endocytaire d'Ocrl humanisé^Y/-souris PTC (m PTC). ( a ) Schéma illustrant l'expérience de chasse aux impulsions utilisée pour examiner la liaison et l'internalisation d'Alexa 488- albumine sérique bovine (BSA) dans m PTC. Les cellules ont été exposées à Alexa 488-BSA (0.2 mg/ml) pendant 1 heure à 4 degrés pour permettre à la BSA de se lier aux récepteurs de surface cellulaire (impulsion), puis réchauffées à 37 degrés dans un milieu cellulaire pendant 20 minutes avant la fixation pour permettre l'internalisation du ligand (chasse). (b) Micrographies confocales représentatives de OcrlY/þ ou Ocrl^Y/-m PTC traités avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) ou 10 mM d'alpelisib pendant 16 heures et soumis à l'expérience Alexa 488-BSA (vert) pulse-chase, avant d'être fixés et étiquetés pendant 40,6-diamidino{ {6}}phénylindole (DAPI) (bleu). La phase d'impulsion de l'expérience est indiquée dans le panneau supérieur pour chaque condition, avec la poursuite ci-dessous. Barres=20 mm. ( c ) Quantification de la surface cellulaire Alexa 488- BSA (i) et Alexa 488- BSA (ii) internalisée, évaluées en tant qu'intensités moyennes de fluorescence FL par cellule. L'alpelisib sauve la liaison et l'internalisation de la BSA sauvées observées dans Ocrl^Y/-cellules. N=209, 228, 186 et 196 cellules pour OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO et Ocrl^Y/-conditions alpelisib, respectivement dans (i) et N=203, cellules 183, 199 et 233 pour OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-conditions d'alpelisib, respectivement en (ii), dans chaque cas regroupées à partir de 2 reins de souris par condition ; chaque point de données représente l'intensité moyenne de fluorescence FL dans une cellule individuelle. La signification a été testée par l'analyse de variance (ANOVA) de Kruskal-Wallis (KW) avec le test de comparaisons multiples de Dunn : pour (i) surface cellulaire BSA, global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples :="" ocrly/þ="" dmso="" contre="">^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001 ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (non="" significatif="" [ns]) ;="" pour="" (ii)="" bsa="" internalisé,="" global="" ***p="">< 0,001,="" comparaisons="" multiples="" :="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001 ;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (="" d="" )="" quantification="" du="" rapport="" entre="" la="" surface="" cellulaire="" alexa="" 488-="" bsa="" et="" les="" intensités="" de="" fluorescence="" internalisées="" alexa="" 488="" –="" bsa="" fl,="" ne="" montrant="" aucune="" différence="" significative="" dans="" les="" rapports="" entre="" chaque="" condition.="" chaque="" point="" représente="" la="" moyenne="" du="" rapport="" dans="" un="" champ="" contenant="" environ="" 15="" à="" 20="" cellules="" (n="13," 13,="" 10="" et="" 11="" champs="" sélectionnés="" au="" hasard="" pour="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-conditions d'alpelisib, respectivement, dans chaque cas regroupées à partir de 2 reins de souris par condition). La signification a été testée par KW ANOVA avec les tests de comparaisons multiples de Dunn : P=0.46 global (ns), comparaisons multiples : OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO et Ocrl^Y/-DMSO contre Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.kidney-international.org.

Figure 6|L'alpelisib améliore la fonction du tubule proximal (PT) des souris OcrLY/L, restaurant l'absorption du ligand et l'expression de la mégaline. (a) Montage expérimental. Des souris orales ont été traitées pendant 6 semaines avec une dose orale quotidienne de carboxyméthylcellulose à 1 % (véhicule) ou d'alpelisib (50 mg/kg de poids corporel). Le dernier jour du traitement, les souris ont reçu une injection de b-lactoglobuline marquée Cy5- (N=6 Ocrl^Y/-, ou 8 Ocrl^Y/-souris par groupe). (b–d) Les valeurs D indiquées indiquent le changement moyen de BL à D42 pour la condition ± SEM. ( b ) la protéine de cellule Clara 16 (CC16), ( c ) le débit urinaire d'albumine (tous deux dans les 15 heures) et ( d ) la masse corporelle ont été mesurés chez des souris OcrlY / - traitées avec le véhicule ou l'alpelisib au moment indiqué. Chaque point représente 1 souris. La signification a été évaluée par le 2-test t de Student apparié ; en (b) CC16 (suite)

Figure 6|(suite) variation de la production par rapport à la référence ; þ véhicule, P=0.9802 (non significatif [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334 ; en (c) changement de production d'albumine par rapport à la ligne de base ; þ véhicule, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006 ; en (d) changement de masse corporelle par rapport à la ligne de base ; þ véhicule, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0.0083." (e)="" micrographies="" confocales="" représentatives="" montrant="" cy5-b-lactoglobuline="" marquée="" (magenta)="" 15="" minutes="" après="" l'injection="" dans="" la="" veine="" caudale="" et="" marquée="" pour="" 40,6-diamidino-2-phénylindole="" (dapi)="" (cyan),="" plus="" la="" quantification="" des="" signaux="" fluorescents="" fl="" correspondants="" des="" reins="" de="" souris="" ocrl="" (n="412," 500="" et="" 588="" tubules,="" respectivement,="" pour="" le="" véhicule="" ocrly/þþ,="">^Y/-þ véhicule, et Ocrl^Y/-þ alpelisib) pour 3 souris par groupe de traitement. L'absorption de la b-lactoglobuline est sauvée par le traitement à l'alpelisib. Barres ¼ 20 mm. Dans les quantifications, chaque point représente l'intensité de fluorescence FL normalisée par la surface des tubules ; les données tracées indiquent la moyenne ± SEM. La signification a été évaluée par le test de Kruskal-Wallis (KW) suivi du test de comparaison multiple de Dunn ; ***P < 0,001,="" comparaisons="" multiples ;="" véhicule="" ocrly/þþ="" contre="">^Y/-þ véhicule et Ocrl^Y/-þ véhicule contre Ocrl^Y/-þ alpelisib, les deux ***P < 0.001.="" (="" f="" )="" analyse="" par="" transfert="" western="" et="" densitométrie="" des="" niveaux="" de="" mégaline="" dans="" les="" lysats="" de="" rein="" entier="" de="" souris="" orales.="" l'a-tubuline="" a="" été="" utilisée="" comme="" contrôle="" de="" chargement.="" l'expression="" réduite="" de="" la="" mégaline="" dans="">^Y/-est sauvé par l'alpelisib. Dans la quantification de l'analyse densitométrie, chaque point représente 1 souris (N=4 OcrlY/þþ véhicule et Ocrl^Y/-þ véhicule et N=3 Ocrl^Y/-þ souris alpelisib); les lignes indiquent la moyenne ± SEM. La signification a été évaluée par des 2-tests t de Student non appariés : OcrlY/þþ véhicule contre Ocrl^Y/-þ véhicule ; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ véhicule contre Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. ( g ) Des micrographies confocales représentatives avec des encarts à fort grossissement et la quantification de l'intensité de la mégaline (jaune) dans les PT AQP1þ (magenta) des reins oraux ont également été marquées pour le DAPI (cyan) illustrant le sauvetage des niveaux de mégaline après le traitement à l'alpelisib. Barres=20 mm. Dans les quantifications, chaque point représente l'intensité de fluorescence FL normalisée par la surface des tubules ; les données tracées indiquent la moyenne ± SEM ; N=142, 191 et 266 tubules, respectivement, pour le véhicule OcrlY/þþ, Ocrl^Y/-þ véhicule, et Ocrl^Y/-þ alpelisib pour 3 souris par groupe de traitement. La signification a été évaluée par une analyse de la variance KW suivie du test de comparaison multiple de Dunn ; global ***P < 0.001,="" comparaisons="" multiples ;="" véhicule="" ocrly/þþ="" contre="">^Y/-þ véhicule et Ocrl^Y/-þ véhicule contre Ocrl^Y/-þ alpelisib, les deux ***P < 0.001.="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

Comment l'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie de Dent ?

2. DÉBAT

Il n'existe actuellement aucun traitement pour atténuer l'endocytose défectueuse provoquant un dysfonctionnement du PT dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent2. Nos résultats révèlent que l'alpelisib atténue le phénotype aberrant de l'actine en réduisant les niveaux de PI(4,5)P2 et PI(3)P, entraînant une amélioration substantielle de la machinerie endocytaire et de la capacité d'absorption dans les systèmes cellulaires et un modèle de souris humanisé pour Syndrome de Lowe / maladie de Dent 2. Ces résultats confirment le lien entre les lipides phosphoinositides, la polymérisation de l'actine et le trafic endocytaire, avec une pertinence immédiate pour les cellules épithéliales hautement actives impliquées dans des processus homéostatiques cruciaux (Figure 7). Compte tenu du manque de thérapies efficaces et de l'innocuité apparente de cette classe de PI3K(phosphoinositide 3-kinase)inhibiteurs, l'alpelisib est un candidat prometteur pour laSyndrome de Lowe et maladie de Dent.

La protéinurie LMW est la caractéristique la plus fréquente rencontrée chez les patients atteints deSyndrome de Lowe et maladie de Dent2 en raison de mutations inactivatrices dans OCRL.⁴Ces protéines LMW peuvent être facilement détectées et quantifiées, offrant un biomarqueur fidèle de l'endocytose défectueuse médiée par les récepteurs dans les cellules PT. acides aminés) faisant partie du "syndrome de Fanconi rénal" classique - du moins dans les troubles congénitaux de la voie endolysosomale.¹Ici, nous montrons que l'alpelisib sauve la capacité d'absorption endocytaire apicale des cellules PT in vitro et in vivo, en raison des niveaux restaurés du récepteur de la mégaline au niveau de la membrane plasmique. Cet effet se traduit par des réductions significatives de la perte urinaire des protéines LMW (CC16 et albumine) chez Ocrl^Y/-souris traitées avec l'alpelisib pendant 6 semaines. Ces effets de l'alpelisib ont été observés dans m PTC, qui conservent leur différenciation apicale et sont particulièrement bien adaptés pour étudier l'endocytose médiée par les récepteurs dans la physiologie et la maladie.⁹ En particulier, nous avons obtenu m PTCs à partir d'un modèle de souris humanisée exprimant l'INPP5B humaine dans Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-historique, ce qui nous permet d'étudier les conséquences spécifiques de la perte d'activité d'OCRL.^11,23

Le sauvetage de l'endocytose par l'alpelisib s'explique par son effet sur la machinerie de l'actine, clairement mis en évidence dans les cellules OCRL KO HK2 et m PTCs. Nos observations confirment et prolongent ainsi les études antérieures montrant le lien entre le contrôle de la balance des phosphoinositides et la F-actine dans la voie endosomale précoce chez les patients OCRL et les cellules KO.^7,10La perte fonctionnelle de l'activité OCRL altère la dégradation de PI(4,5)P2, ce qui, à son tour, entraîne une incapacité à décoller les vésicules recouvertes de clathrine, ce qui entraîne des organites endosomiques aberrants dans divers types de cellules, y compris les cellules PT.^7-10Nous avons récemment montré que l'excès d'actine F diminue le recyclage de la mégaline du récepteur multiligand vers la membrane apicale des cellules PT, provoquant une endocytose défectueuse et une protéinurie LMW.¹¹

Nos données indiquent que le mécanisme d'action de l'alpelisib sur l'actine endosomale découle d'un effet bispécifique de l'inhibition de l'alpelisib : d'abord sur la production de PI(3,4,5)P3 et sa conversion en PI(3)P, et ensuite sur la production de PI(4,5)P2. La diminution des niveaux de PI (4,5) P2 contrecarre directement le déficit en OCRL et est en accord avec les travaux antérieurs atténuant l'excès d'actine et augmentant l'efflux endocytaire par une réduction des niveaux de phosphatidylinositol 4- phosphate 5- kinase , une enzyme qui génère PI(4,5)P2.¹⁰L'alpelisib a une concentration 0.5 mM inhibitrice de 50 % sur le PI(4,5)P2 générant la kinase PI4Kb, qui peut être responsable, ou peut résulter d'effets plus généraux sur l'équilibre des phosphoinositides résultant de la combinaison d'OCRL Traitement KO et alpelisib. Nous avons identifié cette classe IA PI3K(phosphoinositide 3-kinase)l'inhibition par l'alpelisib est pertinente pour l'inhibition de l'actine, car la déplétion de p110a médiée par l'ARNsi inhibe l'accumulation d'actine de la même manière que le traitement par l'alpelisib et le copanlisib (qui n'inhibe pas les PI4K). Dans les cellules RPE, nous avons précédemment observé que l'ARNsi d'INPP4A, qui convertit PI(3,4)P2 en PI(3)P, inhibe l'assemblage de l'actine dans les cellules OCRL KO, fournissant une voie d'inhibition de PI(3,4,5) production de P3 à une diminution du PI(3)P endosomal. Nous avons montré qu'il reste du PI(3)P, vraisemblablement le pool produit au début de l'endosome par la classe III PI3K, Vps34, car nous avons constaté que le trafic endosomal est amélioré plutôt que supprimé par le traitement à l'alpelisib. La corégulation complexe du métabolisme des PI et sa pertinence pour l'inactivation de l'OCRL ont également été mises en évidence dans une étude récente où les fonctions non catalytiques du phosphoinositide 3- phosphatase PTEN activent la dégradation du PI(4,5)P2 via PLCXD, atténuant les phénotypes cellulaires et l'absorption de ligands dans un modèle de poisson zèbre.³¹

L'atténuation du phénotype d'actine par des niveaux réduits de PI(4,5)P2 et PI(3)P par le traitement à l'alpelisib est en accord avec l'action synergique de PI(4,5)P2 et PI(3)P dans le recrutement de SNX9 pour activer la machinerie de l'actine au niveau des endosomes Ocrl,¹⁴suggérant une correspondance très efficace de la spécificité de l'alpelisib pour manipuler la régulation moléculaire de l'activation de l'actine au niveau des endosomes. À son tour, comme démontré précédemment, la réduction de l'assemblage d'actine endosomale conduit à son tour à une amélioration de l'endocytose PT dans les cellules déficientes en OCRL.¹⁰Une caractérisation plus poussée sera nécessaire pour mieux comprendre si la régulation de l'actine par le métabolisme des phosphoinositides est la véritable source de l'effet thérapeutique que nous observons avec l'alpelisib dans l'Ocrl^Y/-modèle de souris. Parce que la classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase)réguler les voies qui contrôlent la croissance, la prolifération, la survie, le métabolisme et l'autophagie des cellules,³²nous ne pouvons pas exclure que le sauvetage endocytaire soit dû aux effets sur PI(3,4,5)P3 directement et à l'effet combiné sur d'autres voies modulées par la classe I PI3K. Plus de travail est également nécessaire pour tester si PI3K(phosphoinositide 3-kinase)les inhibiteurs pourraient également atténuer les manifestations neurologiques et cliniques des patients porteurs de mutations OCRL.⁴

L'expérience récente de l'alpelisib chez les patients pédiatriques atteints du syndrome PROS/CLOVES suggère que le médicament a le potentiel d'être bien toléré. Alpelisib est pris par voie orale, cible sélectivement l'isoforme de PI3K(phosphoinositide 3-kinase)classe I, et présente un profil de toxicité mineur par rapport aux inhibiteurs pan-PI3K. Comme l'alpelisib ne bloque pas complètement PI3K(phosphoinositide 3-kinase)activité, maintenant ainsi les fonctions de la voie de signalisation, il peut être particulièrement adapté à une utilisation à long terme. Il est intéressant de noter que l'hyperglycémie résultant de l'utilisation de l'alpelisib peut être gérable par des changements alimentaires.²²Étant donné que le dysfonctionnement du PT est la première manifestation de maladie rénale observée chez les jeunes nourrissons atteints de la maladie de Dent 2 et du syndrome de Lowe, un traitement précoce d'un tel dysfonctionnement du PT, conduisant à des améliorations du profil métabolique et de la croissance, pourrait donc ralentir la progression vers une maladie rénale chronique et donc avoir un impact significatif sur la durée de vie et la qualité de vie.³³Bien que les manifestations de la maladie de la mutation OCRL soient particulièrement larges, des études récentes basées sur de grandes cohortes de patients génotypés atteints du syndrome de Lowe de la maladie de Dent 2 n'ont pas mis en évidence d'effets significatifs du type de mutation ou de la localisation de la mutation sur la survie rénale.³⁴Ensemble, nos données mettent en évidence le potentiel de réorientation de l'alpelisib pour le traitement du dysfonctionnement du PT dans le syndrome de Lowe/maladie dent 2, fournissant ainsi une base pour un déploiement rapide et rentable dans les essais cliniques humains.

3. MÉTHODES

3.1 Tous les détails peuvent être trouvés dans les méthodes supplémentaires.

Les cellules HK2 ont été traitées avec du copanlisib, de l'alpelisib, du GSK2636771 ou de l'idélalisib aux concentrations indiquées pendant 16 heures, sauf indication contraire. Les protéines ont été extraites à l'aide de méthodes standard à partir de cellules ou de tissus rénaux et le transfert Western a été effectué à l'aide d'anticorps publiés ou disponibles dans le commerce. L'inactivation de l'ARNsi a été réalisée à l'aide de 2 transfections 72 et 24 heures avant l'analyse. Nous avons utilisé OcrlY/þ correspondant à l'âge et au sexe ; Inpp5b^{- /-}; et Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- la même portée de souris hébergeant l'expression de BAC-INPP5B. Des cultures primaires de m PTC ont été générées à partir des reins prélevés sur des souris Ocrl âgées de 8 semaines et la capacité endocytaire des oral m PTC a été évaluée en mesurant l'absorption d'albumine. Les traitements à l'alpelisib étaient de 10 mM pendant 16 heures, sauf indication contraire. L'absorption d'albumine dans m PTC a été évaluée à l'aide d'un protocole "pulse-chase" pour évaluer la liaison apicale et l'absorption résultante. m Les PTC ont été colorées pendant une nuit avec l'anticorps primaire approprié et pendant 45 minutes avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore FL appropriés et/ou Alexa-488 Phalloidin. La coloration PI (3) P sur m PTC a été réalisée à l'aide de la sonde de domaine FYVE. L'analyse d'image a été effectuée avec CellProfifiler, en utilisant des pipelines personnalisés pour mesurer le chevauchement actine/EEA1 et le nombre de points lacrymaux, et avec ImageJ pour mesurer l'intensité de l'immunofluorescence et les bords détectés pour calculer le score de fibre de stress. Les données quantitatives ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne. Pour les expériences in vivo, des souris âgées de 6 semaines ont été traitées avec du véhicule ou de l'alpelisib à 50 mg/kg de poids corporel. L'urine a été recueillie tous les 14 jours et les animaux ont été sacrifiés après 42 jours de traitement, le sang et les reins étant prélevés. La capacité endocytaire PT des souris orales a été examinée en mesurant l'absorption de la b-lactoglobuline.

4. DIVULGATION

JLG a reçu un financement d'AstraZeneca pour une bourse d'études dans son laboratoire. SPJ est membre des conseils consultatifs et détient des actions de Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics et Adrestia Therapeutics, et est un partenaire scientifique pour Ahren Innovation Capital. Tous les autres auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.

5. REMERCIEMENTS

Ce travail a été soutenu par la bourse du Conseil européen de la recherche 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) à JLG, et Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z à SPJ, et nous reconnaissons le financement du Gurdon Institute par Wellcome Trust (092096) et CRUK (C6946/A14492). Nous remercions la Fondation pour la recherche sur la cystinose (Irvine, CA), le Fonds national suisse de la recherche scientifique (subvention de projet 310030_189044), le programme prioritaire de recherche clinique (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurich) de l'UZH, le Swiss

National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) pour son soutien, et le NIDDK/NIH et le Lowe Syndrome Trust/UK pour avoir soutenu le développement des souris Oral. Nous remercions Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation et UCSF, San Francisco, CA) et Maria Antonietta De Matteis (Telethon Institute of Genetics and Medicine, Université Federico II Naples, Naples, Italie) pour avoir fourni les fondateurs de la colonie de souris orales ;

et Eric Olinger (UZH, Zurich) pour des discussions fructueuses. Nous remercions Nadine Näegele et Daniela Nieri pour leur assistance technique lors de la collecte et de l'analyse des urines ; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris) pour avoir partagé avec nous le protocole détaillé de préparation d'Alpelisib pour le traitement in vivo ; et Renata Kozyraki et Pierre Verroust pour la fourniture des réactifs. Nous remercions également le Centre de microscopie et d'analyse d'images de l'Université de Zurich (Zurich, Suisse) et l'installation de physiologie intégrative des rongeurs de Zurich (ZIRP) pour avoir fourni l'équipement pour l'acquisition d'images et le soutien technique pendant les expériences in vivo.

Comment l'alpelisib, inhibiteur de la phosphoinositide 3-kinase, est-il utilisé pour le syndrome de Lowe/maladie de Dent ?

6. MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE

Fichier supplémentaire (PDF)

Méthodes et références supplémentaires.

Tableau S1. Paramètres de poids corporel, d'urine et de sang au fil du temps chez des souris orales traitées avec de l'alpelisib ou un véhicule.

Figure S1. Expression de l'isoforme p110 et tests de cytotoxicité dose-réponse aux médicaments dans les cellules HK2.

Illustration 2. PI3Kinhibiteur alpelisibrestaure le chevauchement actine-endosomal et réduit les niveaux de PI(3)P de manière dose-sensible 4 heures après le traitement médicamenteux dans les cellules HK2.

Figure S3. Expression de l'isoforme p110 et toxicité de l'alpelisib dans les mPTC Ocrl.

Figure S4. Flux de travail de l'analyse du chevauchement EEA1/actine dans les mPTC Ocrl.

Figure S5. L'alpelisib restaure l'absorption d'albumine dans l'Ocrl^Y/-mPTC. L'expression d'Aqp1 n'est pas affectée. Fichier supplémentaire (Films)

Film S1. Rendu 3D Imaris du chevauchement EEA1/actine dans les mPTC OcrlY/þ traités au DMSO. Rendu de surface 3D représentatif d'une pile confocale d'OcrlY/þ mPTC traités avec du DMSO pendant 16 heures, puis fixés avec le fifix de formaldéhyde à 4 % et immunomarqués pour l'EEA1 (violet), l'actine (phalloïdine ; jaune) et le DAPI (bleu), illustrant peu association actine/endosomale. Barre=5 mm.

Film S2. Rendu 3D Imaris du chevauchement EEA1/actine dans Ocrl^Y/-mPTC traités avec du DMSO. Rendu de surface 3D représentatif d'une pile confocale d'OcrlY/– mPTC traités avec du DMSO pendant 16 heures puis fixés avec le fifix de formaldéhyde à 4 % et immunomarqués pour EEA1 (violet), actine (phalloïdine ; jaune) et DAPI (bleu), illustrant ponctué actine s'associant à proximité des structures endosomales. Barre=5mm.

Film S3. Rendu 3D Imaris du chevauchement EEA1/actine dans Ocrl^Y/- mPTC traités par alpelisib. Rendu de surface 3D représentatif d'une pile confocale d'OcrlY/– mPTC traités avec 10 mM d'alpelisib pendant 16 heures, puis fixés avec le fifix de formaldéhyde à 4 % et immunomarqués pour EEA1 (violet), actine (phalloïdine ; jaune) et DAPI (bleu) , illustrant le sauvetage des structures ponctuées d'actine autour des endosomes. Barre=5 mm.

RÉFÉRENCES

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Apprendre la physiologie des troubles rénaux héréditaires. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Syndrome de Loi M. Lowe. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Syndrome de Lowe. Dans : Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., eds. GeneReviews® [Internet]. Seattle (Washington) : Université de Washington, Seattle ; 1993-2020. Disponible sur : HTTPS://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Publié le 24 juillet 2001 ; Mis à jour le 18 avril 2019. Consulté le 8 août 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. La 5-phosphatase OCRL dansSyndrome de Lowe et maladie de Dent2. Nat Rev Néphrol. 2017;13 : 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Transporteurs de chlorure et endocytose médiée par les récepteurs dans le tubule rénal proximal. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. La protéine déficiente dans le syndrome de Lowe est une phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 5- phosphatase. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, et al. Un rôle d'OCRL dans la dynamique des fosses recouvertes de clathrine et le décapage révélé par des études sur les cellules du syndrome de Lowe. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Les fonctions cellulaires et physiologiques de la protéine OCRL1 du syndrome de Lowe. Trafic. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. La fusion autophagosome-lysosome déclenche une réponse lysosomale médiée par TLR9 et contrôlée par OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, et al. OCRL contrôle le trafic via les endosomes précoces via la régulation dépendante de PtdIns4,5P(2) de l'actine endosomale. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, et al. Le déficit en OCRL altère la fonction endolysosomale dans un modèle de souris humanisée pourSyndrome de Lowe et maladie de Dent. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, et al. P-Rex1, un facteur d'échange de guanine-nucléotide régulé par PtdIns(3,4,5)P3- et Gbetagamma pour Rac. Cellule. 2002;108:809–821.

13. Gallop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Les phosphoinositides et la courbure de la membrane modifient le mode de polymérisation de l'actine via le recrutement sélectif de Toca-1 et Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Mandat A, Holst MR, et al. Contrôle de la polymérisation de l'actine via la coïncidence des phosphoinositides et de la courbure élevée de la membrane. J Cell Biol. 2017 ;216 :3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, et al. PTEN régule la signalisation PI(3,4)P2 en aval de la classe I PI3K(phosphoinositide 3-kinase). Cellule Mol. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Localisation du phosphatidylinositol 3-phosphate dans les cellules de levure et de mammifère. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, et al. Le PI3K(phosphoinositide 3-kinase)voie de la maladie humaine. Cellule. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. BAY 80-6946 est un PI3K intraveineux hautement sélectif (phosphoinositide 3-kinase)inhibiteur avec de puissantes activités p110alpha et p110delta dans les lignées cellulaires tumorales et les modèles de xénogreffes. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, et al. Caractérisation du PI3K nouveau et spécifique(phosphoinositide 3-kinase)inhibiteur alpha NVP-BYL719 et développement de la stratégie de stratification des patients pour les essais cliniques. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. Découverte de NVP-BYL719, un inhibiteur puissant et sélectif de la phosphatidylinositol-3 kinase alpha sélectionné pour évaluation clinique. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. André F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib pour le cancer du sein avancé avec mutation PIK3CA et récepteurs hormonaux positifs. N Engl J Méd. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, et al. Thérapie ciblée chez les patients atteints du syndrome de prolifération lié à PIK3CA. La nature. 2018;558 :540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, et al. Modèle de souris pour la tubulopathie rénale du syndrome de Lowe/Dent Disease 2. J Am Soc Nephrol. 2011;22 : 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, et al. Un anticorps monoclonal pour visualiser les PtdIns(3,4,5)P(3) dans les cellules. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Les techniques immunocytochimiques révèlent plusieurs pools cellulaires distincts de PtdIns4P et PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Dynamique de la conversion des phosphoinositides dans le trafic endocytaire médié par la clathrine. La nature. 2017 ;552 : 410–414.

27. Bilanges B, Pauvre Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(phosphoinositide 3-kinase)isoformes dans la signalisation cellulaire et le trafic des vésicules. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P, et al. Les fibroblastes mutés par OCRL de patients atteints de la maladie de Dent-2 présentent une variabilité phénotypique indépendante de l'INPP5B par rapport aux cellules du syndrome de Lowe. Hum Mol Genet. 2015;24 : 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Le déficit en PIP2 5-phosphatase dans le syndrome de Lowe affecte la polymérisation de l'actine. Suis J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. PI3K spécifique à la tumeur(phosphoinositide 3-kinase)inhibition via la livraison ciblée sur les nanoparticules dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN réduit les PtdIns(4,5)P2 endosomiques de manière indépendante de la phosphatase via une voie PLC. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Coordination entre la RAB GTPase et la régulation et les fonctions des phosphoinositides. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13 : 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, et al. Maladies rénales héréditaires rares : défis, opportunités et perspectives. Lancette. 2014 ;383 : 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Résultat rénal à long terme chez les enfants porteurs de mutations OCRL : analyse rétrospective d'une grande cohorte internationale. Greffe de cadran néphrol. 2018;33:85–94.

Extrait de : Rein International (2020) 98, 883–896 ; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.05.040

Copyright ª 2020, Société internationale de néphrologie. Publié par Elsevier Inc. Il s'agit d'un article en libre accès sous licence CC BY (HTTP://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institute, Université de Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Royaume-Uni. Courriel : j.gallop@gurdon.cam.ac.uk ; ou Olivier Devuyst, Institut de physiologie, Université de Zurich, Zurich, Suisse. Courriel : olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale.⁶Ces auteurs ont codirigé l'étude. Reçu le 8 août 2019 ; révisé le 1er mai 2020 ; accepté le 15 mai 2020 ; mis en ligne le 9 septembre 2020