Résultats et discussion : optimisation d'un seul facteur, profilage des arômes volatils et métabolomique du Cistanche Musalais

 

 

 

2 Résultats et analyse

 

2.1 Expériences monofacteur pour Cistanche Musalais

Les résultats monofactoriels sont présentés dans la figure 2. Les solides solubles reflètent principalement le total des sucres résiduels et autres substances solubles restant après la fermentation. Plus le niveau de sucre initial est élevé, plus les solides solubles résiduels finaux sont élevés. Au même niveau initial d'ajout de sucre et de cistanche, les solides solubles à 25 degrés étaient légèrement inférieurs à ceux de 22 degrés et 28 degrés. L'activité de fermentation de la levure est plus élevée à 25 degrés, consommant plus de sucres ; cependant, en raison de la teneur de base élevée en sucre, cette consommation pourrait ne pas réduire de manière significative le total, ce qui ne produirait que de légères différences. Les barres d'erreur se chevauchaient entre les groupes d'addition de Cistanche à 3 %, 5 % et 7 %, sans différences significatives, ce qui indique que le niveau d'addition de Cistanche a un effet négligeable sur les solides solubles totaux, qui sont principalement affectés par le sucre initial.

 

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La teneur en alcool est l’indicateur le plus direct de l’efficacité de la fermentation ; l'éthanol est le principal produit de la fermentation des sucres de la levure [10]. Le groupe à 32 degrés Bx a montré une teneur en alcool significativement plus élevée que les groupes à 26 degrés Bx et à 29 degrés Bx, car un sucre initial plus élevé fournit un substrat plus fermentescible pour produire plus d'alcool. En dessous de 25 degrés, la teneur en alcool a atteint un pic dans presque toutes les combinaisons initiales d'addition de sucre et de cistanche, conformément à LI et al. [11]. Une température trop basse (22 degrés) supprime la levure, ralentissant ou terminant incomplètement la fermentation ; trop élevé (28 degrés) peut provoquer un déclin prématuré de la levure ou davantage de sous-produits, réduisant également le rendement final en éthanol. À 25 degrés, l'ajout de 7 % de Cistanche atteint la teneur en alcool la plus élevée, ce qui suggère que certains constituants du Cistanche peuvent favoriser la croissance des levures et la vigueur fermentaire.

L'acidité totale affecte la sensation en bouche et la stabilité. Les acides proviennent des matières premières et du métabolisme microbien pendant la fermentation. L’excès d’acidité provoque des notes piquantes et vinaigrées et doit être contrôlé à des niveaux inférieurs [12]. L'acidité totale à 22 degrés était significativement plus élevée qu'à 25 degrés et 28 degrés, car 22 degrés sont sous-optimaux pour les bactéries lactiques (LAB). Les basses températures inhibent fortement la croissance et le métabolisme des LAB, rendant la fermentation malolactique (FML) très lente, incomplète, voire non initiée ; par conséquent, l’acide malique reste non converti, ce qui augmente l’acidité totale mesurée. En revanche, 25 à 28 degrés constituent une plage favorable pour la FML. Les LAB sont ici très actifs et peuvent convertir rapidement et complètement l’acide malique en acide lactique [13], ce qui entraîne une acidité totale plus faible. Les effets du sucre initial et de l’ajout de Cistanche sur l’acidité totale étaient globalement moins cohérents ; cependant, la condition de 25 degrés avec 7 % d’addition donnait généralement une acidité modérée. Une acidité trop faible conduit à un palais plat ; trop élevé donne de la netteté – la modération est préférable.

Les flavonoïdes totaux et les polyphénols totaux mesurent directement les constituants fonctionnels et la capacité antioxydante, provenant principalement du Cistanche ajouté. Le niveau d'ajout de Cistanche était le plus influent : aux températures et sucres initiaux les plus élevés, le groupe 7 % avait les teneurs en flavonoïdes et polyphénols les plus élevées, suivi de 5 % et 3 %. Cela démontre qu'augmenter Cistanche est le moyen le plus efficace d'améliorer la fonctionnalité du produit. Les performances à 25 degrés étaient supérieures pour ces indices. Une température plus élevée (28 degrés) peut provoquer une dégradation/oxydation partielle des actifs sensibles à la chaleur ; une température plus basse (22 degrés) peut empêcher l’extraction complète de la matrice. Pour maximiser la valeur santé (flavonoïdes totaux et polyphénols), un ajout de 7 % de Cistanche à une fermentation douce de 25 degrés est essentiel pour protéger et extraire efficacement ces composants.

En résumé, les conditions optimales pour tous les traitements étaient : sucre initial à 32 degrés Bx, fermentation à 25 degrés et ajout de 7 % de Cistanche. Cela équilibre l’efficacité de la fermentation, la qualité du produit et la fonctionnalité. Cela diffère de ABUDUREHEMAN et al. [14]. TANG et coll. [15] ont découvert que les principaux microbes fonctionnels du Musalais traditionnel comprennent Blautia, Leuconostoc, Lactiplantibacillus, Rhodococcus et Thermoascus ; Thermoascus pilote la synthèse de métabolites clés (glycine, acétamide, monacoline K, etc.). Une fermentation ouverte riche en sucre introduit de multiples sources de carbone, active le métabolisme secondaire et le niveau de sucre affecte directement les voies de biosynthèse phénoliques (voie du shikimate enrichi en KEGG). Wen Xiaoli [16] a observé que les voies phénylpropanoïdes (shikimate) favorisent l'accumulation de précurseurs phénoliques. Un environnement riche en sucre (32 degrés Bx) favorise les levures osmotolérantes (par exemple Saccharomyces) et supprime les contaminants. Alors que le Musalais traditionnel s'appuie sur Thermoascus pour la synthèse phénolique [15], dans le Cistanche Musalais, la levure peut utiliser directement les précurseurs phénoliques du Cistanche pour produire efficacement des composés phénoliques [17]. Par conséquent, les conditions optimales sont 32 degrés Bx, 25 degrés et 7 % de Cistanche. Parmi ceux-ci, les solides solubles étaient (21,9 ± 1,1) %, l'alcool (12,6 ± 0,6) % vol, l'acidité totale (3,82 ± 0,19) g/L, les flavonoïdes totaux (0,80 ± 0,01) g/L et les polyphénols (0,60 ± 0,00) g/L.

2.2 Composés aromatiques volatils du Cistanche Musalais

Le tableau supplémentaire 1 amélioré en ligne répertorie les composants aromatiques représentatifs et les contenus relatifs du Cistanche Musalais par rapport au Musalais témoin. Au total, 38 composés aromatiques ont été identifiés : 24 esters, 6 alcools, 2 cétones, 2 aldéhydes et autres.

Les esters contribuent principalement aux arômes fruités et vineux, notamment l'acétate d'éthyle, l'acétate d'isoamyle et le phénylacétate d'isoamyle. L'acétate d'éthyle (fruité, sucré) était beaucoup plus élevé dans le groupe B (7% Cistanche) à 6,418% par rapport au groupe A (témoin) à 2,417%. L'oxalate de diéthyle (aromatique) a été détecté uniquement dans le groupe B (0,521 %). Les esters se forment à partir d'acides organiques et d'alcools via les estérases [18]. Cistanche peut fournir des substances qui favorisent l'activité estérase ou des enzymes participant aux réactions ; son ajout peut favoriser la croissance des levures produisant des esters tout en supprimant les producteurs de non-esters. Par rapport à A, B présentait sept nouveaux esters : acrylate de 2-éthylhexyle, formiate de benzoyle d'éthyle, salicylate d'éthyle, valérate d'hexyle, myristate d'éthyle, palmitoléate d'éthyle et oléate d'éthyle. Ceux-ci sont probablement apparus car des acides gras ou aromatiques spécifiques de Cistanche ont servi de substrats pour l'estérification microbienne. Certains composants actifs (par exemple, les glycosides phényléthanoïdes, PhG) peuvent être clivés en sucres et aglycones ; les aglycones sont instables et transformées de manière microbienne ou non enzymatique en acides gras qui réagissent avec les alcools pour former des esters [19]. Le phénylacétate d'isoamyle est une source clé de notes miellées et florales avec un seuil bas ; Le palmitate d'éthyle et l'octanoate d'éthyle forment des arômes composites fruités-gras [20]. Les esters et aldéhydes de faible poids moléculaire sont des produits aromatiques secondaires essentiels formés pendant la fermentation [21] et améliorent le fruité du Musalais.

Les alcools tels que l’isobutanol et l’alcool isoamylique sont des contributeurs majeurs à la saveur. L'éthanol, l'alcool isoamylique et l'isobutanol étaient tous plus faibles dans le groupe B que dans le groupe A. La réduction de l'éthanol a accompagné l'augmentation des esters, indiquant que le flux de carbone s'est déplacé de l'accumulation d'alcool vers la biosynthèse des esters, une direction favorable. Les alcools supérieurs proviennent principalement du catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée (valine, leucine, isoleucine) via la voie d'Ehrlich [22]. Leur réduction peut indiquer que Cistanche a supprimé la prolifération de souches apparentées ou a modulé le flux d'acides aminés. Bien que les alcools modérément élevés puissent ajouter de l'arôme/du corps, beaucoup ont des seuils bas et certains ont un goût amer ; l'isobutanol a une forte amertume [23]. Ainsi, des alcools plus faibles et plus élevés dans le Cistanche Musalais peuvent améliorer le confort de consommation.

Des aldéhydes, des cétones et d’autres composés ont également été détectés, mais avec une diversité et une abondance relative plus faibles. Le groupe B présentait de la 2,5-dihydroxyacétophénone (douce, florale), absente dans A, probablement due à la dégradation microbienne des PhG de Cistanche (par exemple, échinacoside, acteoside).

GC – MS indique que l'ajout de Cistanche a considérablement modifié le profil volatil. L'acétate d'éthyle (fruité, sucré) et le palmitate d'éthyle (fruité-gras) ont été les principaux contributeurs à l'amélioration du fruité, à 6,42 % et 3,75 % dans le Cistanche Musalais contre . 2.42 % et 1,18 % dans le traditionnel. L'isobutanol (amer) est passé de 3,98 % à 2,11 %, réduisant l'amertume et améliorant l'équilibre. De nouveaux composés aromatiques tels que la 2,5-dihydroxyacétophénone dérivent probablement de la dégradation microbienne des PhG, diversifiant ainsi l'arôme. Dans l’ensemble, l’ajout de Cistanche a orienté la fermentation vers la production d’esters aromatiques plus recherchés.

2.3 Métabolomique du Cistanche Musalais

 

2.3.1 Métabolites non volatils

UPLC-MS/MS avec une bibliothèque locale et des bases de données publiques ont identifié 11 classes de composés. Comme le montre la figure 3-a, les hétérocycliques organiques étaient les plus abondants (28,1 % du contenu identifié), suivis des acides organiques et dérivés (18,6 %), des lipides et molécules apparentées (13,8 %), des benzénoïdes (12,3 %), des composés organiques de l'oxygène (9,6 %), des composés benzyliques et polycétides (7,0 %), des alcaloïdes et dérivés (4,2 %), des composés organiques azotés (3,3 %), des nucléosides/nucléotides et analogues. (1,9 %) et autres (0,8 %).

Les hétérocycles organiques sont importants pour la saveur du vin ; parmi les composants du vin de fruit, les furanes et les pyrazines sont des agents odorants clés [24]. Les pyrazines ont des seuils bas et des odeurs fortes ; Les furanes sont des lipophiles à bas point d’ébullition et très volatils, essentiels à la formation des arômes et potentiellement bénéfiques pour la santé [25]. Les acides organiques et dérivés sont essentiels au vin ; leurs niveaux et types influencent fortement la saveur, la couleur et la stabilité [26]. Les acides organiques proviennent du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) : le glucose forme du pyruvate par voie enzymatique ; le pyruvate est converti en acétyl-CoA par la pyruvate déshydrogénase, puis en intermédiaires TCA (citrate, malate, succinate). De plus, nous avons détecté de la trigonelline (hypolipidémique et hypoglycémique) et de la crocine (activités anticancéreuses, anti-inflammatoires, antioxydantes, hépatoprotectrices/cholérétiques et antidiabétiques).

 

2.3.2 PCA et OPLS-DA pour les métabolites non volatils

La figure 3-b montre les scores PCA pour le contrôle (A) et 7 % de Cistanche (B) sur la base de tous les métabolites identifiés. Deux composants principaux expliquent environ 57,8 % de la variance totale (PC1 42.8%, PC2 15.2%), indiquant qu'ils capturent la plupart des informations originales et représentent des caractéristiques clés parmi les traitements [27]. Échantillons regroupés en groupes ; A et B se sont séparés distinctement, indiquant des différences métabolomiques significatives dues à l’ajout de Cistanche et à une bonne stabilité du système/fiabilité des données.

La figure 3-e montre OPLS-DA discriminant davantage les groupes et criblant les métabolites différentiels. Tous les points se situaient dans l’intervalle de confiance de 95 % ; A et B étaient clairement séparés, ce qui indique des différences substantielles dans la composition et l'abondance des métabolites non volatils. Les variables et les étiquettes de classe ont été partitionnées et projetées pour la discrimination, garantissant ainsi la fiabilité [28]. La figure 3-c montre un graphique de score PLS-DA traitant les non volatiles identifiés comme variables dépendantes et les traitements comme variables indépendantes, révélant un modèle similaire à celui de l'ACP avec un regroupement de groupes plus serré. Lors des tests de permutation (200 fois), les métriques du modèle étaient R2Y=1 et Q2=0.866 ; après 200 permutations, R2 et Q2 ont coupé l'axe y positif avec des valeurs du côté gauche inférieures à celles du côté droit, indiquant la validité. Dans PLS-DA, les valeurs VIP ont été utilisées pour distinguer les contributions des métabolites entre les traitements (30). Les chargements du tracé S ont identifié des entités présentant de grandes différences intergroupes ; une plus grande distance indique une plus grande importance. OPLS-DA a efficacement discriminé les deux vins, fournissant ainsi une base solide pour la sélection des métabolites en aval.

 

2.3.3 Regroupement hiérarchique des principaux métabolites différentiels

Sur la base d'OPLS-DA avec VIP > 1 et P < 0,05, 230 composés différentiels ont été identifiés : 125 régulés positivement et 64 régulés négativement. En raison du grand nombre, les 50 premiers par abondance ont été utilisés pour le regroupement hiérarchique. La carte thermique (Figure 3-g) montre chaque ligne comme métabolite et chaque colonne comme échantillon [31] ; le rouge indique une expression plus élevée, le bleu une expression inférieure. Les trois répétitions par groupe présentaient des couleurs similaires, indiquant une bonne reproductibilité et des tendances cohérentes. La figure 3-g suggère que le jus de raisin sous action microbienne produit des acides aminés, du glucose, des acides organiques, des terpènes, etc. Tang et al. [15] ont détaillé la succession naturelle des communautés microbiennes (par exemple, Aspergillus, Gluconobacter, levures) et les changements de métabolites correspondants au cours de la fermentation du Musalais. Le groupe A s’aligne sur cet équilibre microbien inhérent. Cistanche, cependant, n'est pas inerte ; ses bioactifs (par exemple, les PhG) peuvent avoir des effets antimicrobiens [32], perturbant l'équilibre existant. Les isomères du mogroside (par exemple, les isomères du mogrol), la crocine B, l'andrographolide, etc. étaient plus élevés en B (7 %) et plus faibles en A, probablement parce que la puissante capacité antioxydante de Cistanche (riche en PhG) fournissait un environnement antioxydant qui réduisait la dégradation oxydative de ces molécules. La L(+)-ornithine, la L(+)-citrulline et la vitamine B7 (biotine) étaient plus faibles en B mais plus élevées en A, ce qui suggère que le facteur externe (Cistanche) a perturbé l'équilibre microbien d'origine, supprimé certaines souches fonctionnelles et modifié les principales directions métaboliques. Cela indique les avantages fonctionnels potentiels du Cistanche Musalais par rapport au Musalais traditionnel.

 

2.3.4 Composants fonctionnels

La métabolomique non ciblée a non seulement élucidé les mécanismes de formation des arômes, mais a également identifié des composants bioactifs enrichis, fournissant une base chimique directe pour le développement de produits. La trigonelline était significativement régulée positivement dans le groupe expérimental, avec des effets hypoglycémiques, hypolipidémiques et neuroprotecteurs documentés (33). La crocine, un puissant antioxydant hydrosoluble, a également augmenté de manière significative, connue pour ses activités anti-inflammatoires, anxiolytiques et anticancéreuses potentielles. Dans le cadre du processus optimal (7 % à 25 degrés), les flavonoïdes totaux et les composés phénoliques totaux ont atteint respectivement 0,80 g/L et 0,60 g/L, améliorant considérablement la capacité antioxydante par rapport au produit traditionnel. Ces enrichissements proviennent du Cistanche (par exemple, PhG, polysaccharides) [4–5] et peuvent également refléter une biotransformation et un enrichissement microbiens pendant la fermentation.

 

2.3.5 Graphique volcanique des principaux métabolites différentiels

Le tracé du volcan visualise les changements dans l’abondance des métabolites. En utilisant VIP supérieur ou égal à 1 et P <0,05, 230 composés différentiels ont été identifiés : 125 régulés positivement et 64 régulés négativement (Figure 3-e). L'axe des x représente le changement de facteur log2 et l'axe des y est -log10 P. Les métabolites fortement régulés positivement avec un FC supérieur ou égal à 1 et P < 0,05 sont rouges ; significativement régulé négativement avec FC inférieur ou égal à 1 et P < 0,05 sont bleus ; les non significatifs sont gris. Les 20 principaux changements présentant les changements les plus prononcés sous P <0, 05 et VIP> 1 sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2. La régulation positive la plus importante était un dérivé glycoside (Log2FC=2.60; FC=6.06), un glycoside dérivé d'un glycoside phényléthanoïde, suggérant fortement une origine directe à partir de constituants caractéristiques du Cistanche. Cistanche est riche en PhG tels que l'échinacoside et l'actéoside ; pendant la fermentation, ces prototypes peuvent subir une hydrolyse, un transfert de glycosyle ou un réarrangement pour générer de tels nouveaux dérivés glycosidiques. Les métabolites différentiels comprenaient plusieurs acides aminés et dérivés, par exemple le (E) -N5-(1-aminoéthylidène) -L-ornithine (Log2FC=1.76, en haut), la trigonelloxazolidine (Log2FC=1.80, en haut) et l'ester éthylique de méthionine (Log2FC=-1,46, en bas) - conformément à Tang et al. [15], qui ont noté que la biosynthèse des acides aminés dans des environnements riches en sucre sous-tend la formation des arômes. L'ajout de cistanche peut fournir un supplément d'azote ou de précurseurs, augmentant non seulement le flux à travers les voies des acides aminés, mais orientant également vers des conversions spécifiques qui produisent des composés aromatiques distinctifs dérivés des acides aminés.

 

2.3.6 Enrichissement de la voie KEGG

L'enrichissement KEGG en métabolites différentiels clés (Figure 3-i) a mis en évidence les 20 principales voies : transporteurs ABC, biosynthèse des acides aminés, biosynthèse de l'arginine, métabolisme des purines, biosynthèse des aminoacyl-ARNt, métabolisme des acides aminés D, métabolisme du tryptophane, métabolisme de l'arginine et de la proline, voies métaboliques, biosynthèse des alcaloïdes tropane/pipéridine/pyridine, métabolisme des acides cyanoamino, biosynthèse des flavonoïdes, métabolisme de l'acide 2-oxocarboxylique, biosynthèse des glucosinolates, biosynthèse des flavones et des flavonols, métabolisme de la caféine, dégradation de la lysine, métabolisme de l'alanine/aspartate/glutamate, métabolisme de la pyrimidine et métabolisme de la vitamine B6. Couleurs : bleu pour le métabolisme ; orange pour le traitement des informations environnementales ; vert pour le traitement de l’information génétique. Parmi ceux-ci, les transporteurs ABC, la biosynthèse des acides aminés, la biosynthèse de l'arginine, le métabolisme des purines, la biosynthèse des aminoacyl-ARNt et le métabolisme des acides aminés D étaient significatifs, avec des comptes de composés enrichis de 138, 128, 23, 101 et 52, respectivement. Les transporteurs ABC assurent le transport transmembranaire central dans les membranes microbiennes, entraînés par l'hydrolyse de l'ATP pour déplacer les substrats (sucres, acides aminés, antibiotiques), affectant directement l'acquisition de nutriments et l'adaptation environnementale (34). Gluconobacter absorbe efficacement l'éthanol et entraîne la fermentation acétique via les transporteurs ABC (35). La biosynthèse des aminoacyl-ARNt est une étape clé limitante de la traduction. Le métabolisme des acides aminés joue un rôle crucial dans la fermentation des vins de fruits ; ses produits peuvent se transformer en composés aromatiques caractéristiques tels que le géraniol, ce qui en fait une voie clé pour la formation des arômes [36].

 

3Conclusions

Utiliser des raisins rouges Hotan etCistanche, le processus optimal pour le Cistanche Musalais a été défini comme étant un sucre initial de 32 degrés Bx, une température de fermentation de 25 degrés et un ajout de 7 % de Cistanche, donnant de l'alcool (12,6 ± 0,6) % vol, une acidité totale (3,82 ± 0,19) g/L, des flavonoïdes totaux (0,80 ± 0,01) g/L et des polyphénols (0,60 ± 0,00). g/L. La GC-MS a identifié 38 composés aromatiques (24 esters, 6 alcools, 2 cétones, 2 aldéhydes, autres). Par rapport au Musalais traditionnel, les esters clés étaient significativement plus élevés avec le Cistanche, par exemple l'acétate d'éthyle (6,42 % contre . 2.42 %) et le palmitate d'éthyle (3,75 % contre . 1.18 %), tandis que les alcools plus élevés tels que l'isobutanol étaient inférieurs (2,11 % contre . 3.98 %). La métabolomique a identifié 230 métabolites significativement différents (VIP supérieur ou égal à 1, P < 0,05) : 125 régulés positivement (par exemple, les isomères du mogrol, la crocine B) et 64 régulés négativement (par exemple, L(+)-ornithine, L(+)-citrulline). L'enrichissement en KEGG a indiqué un regroupement primaire dans les transporteurs ABC et les voies de biosynthèse des acides aminés. Les actifs fonctionnels, notamment la trigonelline, la crocine, les flavonoïdes et les polyphénols, étaient significativement enrichis dans le Cistanche Musalais, suggérant des bienfaits potentiels pour la santé ; La biosynthèse des acides aminés joue un rôle important dans la formation de la saveur caractéristique. Pour une attribution plus approfondie des principales substances odorantes, les travaux futurs devraient inclure la chromatographie en phase gazeuse – olfactométrie (GC – O) pour déterminer l'activité / contribution de l'odeur (par exemple, facteurs FD) de substances volatiles abondantes, et une MS quantitative ciblée (par exemple, MRM) pour la quantification absolue de la trigonelline, de la crocine, etc., afin de mieux évaluer la valeur pour la santé.

Provenance des ressources spectrales/métabolites externes utilisées pour l'identification des métabolites (conformément aux bases de données citées dans les méthodes 1.3.8.3) :

Base de données sur le métabolisme humain (HMDB 5.0) : https://hmdb.ca/ - une base de données complète et disponible gratuitement avec 220 945 entrées de métabolites, y compris des données chimiques, cliniques et biochimiques ; prend en charge les recherches de texte, de séquence, de structure, MS et RMN ; lié à KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt et GenBank. Bases de données associées : DrugBank, T3DB, SMPDB, FooDB.

LIPID MAPS : https://www.lipidmaps.org/ - une ressource lipidomique gratuite et en libre accès. Le LMSD dépasse désormais les 50 000 structures lipidiques sélectionnées avec une classification détaillée, des liaisons croisées et une provenance ; fournit une analyse MS, un dessin de structure, des bases de données spectrales, des voies et des outils de nomenclature/classification.

mzCloud – Advanced Mass Spectral Database : https://www.mzcloud.org/ – prend en charge les recherches de spectre, de structure, de sous-structure, d'arborescence et m/z. Échelle actuelle : 32 330 composés, 51 002 arbres et 16 531 567 spectres (+ augmentations en 2024). Optimisé pour les navigateurs de bureau Firefox/Chrome. Copyright © 2013-2025 HighChem LLC.

 

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