Clonage de gènes, identification fonctionnelle, analyse structurelle et d'expression de la saccharose synthase de Cistanche Tubulosa Ⅱ

Résultats et analyse

1 Extraction et clonage des gènes de la saccharose synthase chez Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>partie aérienne.

Par conséquent, les valeurs du niveau d'expression FPKM des deux gènes candidats de saccharose synthase obtenues lors du criblage initial dans les données du transcriptome de différentes parties de Cistanche tubulosa ont été normalisées par Z-Score et une analyse différentielle a été réalisée (Figure 1A). Les résultats ont montré que le gène CtSus avait le niveau d'expression le plus élevé dans l'haustorium et que le niveau d'expression dans la partie souterraine était supérieur à celui dans la partie aérienne, ce qui était cohérent avec le schéma d'accumulation de composés glycosides dans différentes parties de Cistanche tubulosa, tandis que le niveau d'expression du gène CtSus1 dans l'haustorium était faible. Par conséquent, sur la base des résultats ci-dessus, le gène CtSus a été sélectionné pour une amplification de séquence ultérieure, une expression exogène et une identification fonctionnelle. En utilisant l’ADNc de Cistanche tubulosa comme matrice, un produit à bande unique a été obtenu à environ 2 500 pb après amplification PCR (Figure 1B). Le produit de PCR a été récupéré du gel et ligaturé au vecteur de clonage, et la région codante complète du gène cible a été obtenue par séquençage. La longueur de la séquence CtSus était de 2418 pb.

Figure 1 Exploration génique et clonage de CtSus de C. tubulosa et analyse bioinformatique de sa protéine codée. A : Niveaux d’expression des gènes CtSus et CtSus1 dans différentes parties de C. tubulosanormalisés sous forme de scores Z en fonction de leurs valeurs FPKM ; B : amplification génique de CtSus ; M : marqueur ADN ; C : domaine conservateur de la protéine CtSus prédit par SMART ; D : alignement de séquences multiples de CtSus et de saccharose synthases identifiées à partir d'autres plantes, notamment Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum et Albuca bracteata. Le domaine de synthèse du saccharose et le domaine de transfert de sucre sont représentés respectivement par des cases rouges et bleues ; E : Analyse phylogénétique des CtSus et des saccharoses synthases d'autres plantes ; F : Analyse SDS-PAGE de l'expression hétérologue de CtSus à l'aide du vecteur pCold™ I dans E. coli. Piste 1 : marqueur protéique ; Piste 2 : Fraction surnageante ; Piste 3 : Fraction précipitée. La flèche rouge montre la protéine CtSus. G : PCR sur colonie d'un seul clone contenant les deux plasmides recombinants. M : marqueur ADN ; 1 : animal-28a-UGT71BD1 ; 2 : pCold™ I-CtSus

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2 Analyse bioinformatique du gène CtSus et de sa protéine codée

2.1 Analyse des propriétés physicochimiques de CtSus et prédiction de la structure du domaine transmembranaire

Les propriétés physicochimiques de la protéine codée par CtSus ont été analysées à l'aide du logiciel en ligne ProtParam. La protéine contient 805 acides aminés, avec une formule moléculaire de C4189H6548N1104O1187S28 et une masse moléculaire relative de 92266,44 ; le point isoélectrique théorique est 6.00 ; le coefficient d'instabilité II est de 35,45, ce qui est une protéine stable ; l'hydrophilie moyenne globale (GRAVY) est de -0,187, ce qui est une protéine hydrophile. MHMM 2.0 a été utilisé pour prédire le domaine transmembranaire de la saccharose synthase CtSus, et les résultats ont montré que la protéine codée par ce gène n'a pas de domaine transmembranaire.

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2.2 Prédiction de la structure conservatrice de CtSus et de l'alignement des séquences

Le logiciel en ligne SMART a été utilisé pour prédire les domaines conservateurs de la protéine CtSus (Figure 1C). La protéine contient deux domaines conservateurs. L'extrémité N-terminale (acides aminés 8 à 553) est le domaine du saccharose synthase, qui peut catalyser la réaction réversible de l'UDP et du saccharose pour générer de l'UDP-glucose et du D-fructose ; l'extrémité C-terminale (acides aminés 557 à 739) appartient au domaine glycosyltransférase (Figure 1D). Le logiciel DNAMAN a été utilisé pour aligner la séquence de la protéine CtSus avec la séquence d'acides aminés du saccharose synthase dans la base de données NCBI (Tableau 2). Les résultats ont montré que la séquence d’acides aminés CtSus présentait une grande similitude avec les séquences de saccharose synthase d’autres plantes. La similarité la plus élevée entre CtSus et la séquence de saccharose synthase du sésame (Sesamum indicum) était de 94,78 %, et la similarité avec les séquences de saccharose synthase d'autres plantes était également supérieure à 65 %, ce qui indique que la saccharose synthase des plantes a un degré élevé de séquence. conservation.

Tableau 2 : Similitudes des séquences d'acides aminés entre CtSus et les synthases de saccharose identifiées à partir d'autres plantes

2.3 Analyse phylogénétique

L'arbre phylogénétique construit par le logiciel MEGA a été utilisé pour analyser la relation phylogénétique entre la saccharose synthase CtSus de Cistanche tubulosa et les saccharose synthases d'autres plantes. Les résultats sont présentés sur la figure 1E. Les synthases de saccharose provenant de plantes présentent des branches évolutives distinctes chez les dicotylédones (régions I et II) et les monocotylédones (région III). CtSus est dans la branche dicotylédone, et les séquences étroitement liées à CtSus proviennent toutes de plantes Lamiaceae (Cistanche tubulosa est une plante Lamiaceae Orobanchaceae), tandis que l'autre branche est principalement composée de plantes Solanales, ce qui indique en outre la conservation et l'homologie élevées. des gènes de saccharose synthase d'origine végétale dans l'évolution des plantes dans le même ordre. Parmi eux, la saccharose synthase PrSus (AEN79500.1) de Phelipanche ramosa de la plante Orobanchaceae est la plus proche de CtSus.

3 Analyse de l’expression exogène et de l’activité de CtSus

3.1 Expression exogène du gène CtSus

Les plasmides pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus et pCold™ I-CtSus vérifiés par séquençage ont été transférés dans l'E. coli Transetta (DE3) compétent en expression, et les clones positifs ont été criblés. par PCR sur colonie pour la vérification du séquençage. Les souches d'expression recombinantes obtenues ont été induites par IPTG à basse température pour l'expression des protéines, et les bactéries ont été collectées par centrifugation. Le tampon de lyse a été ajouté pour briser les bactéries afin d'obtenir le surnageant et le précipité, et une SDS-PAGE a été réalisée pour la détection. Les résultats ont montré que lorsque pET-28a et pET-24b étaient utilisés comme vecteurs d'expression, CtSus n'était pas exprimé dans E. coli, tandis que lorsque pCold™ I était utilisé comme vecteur d'expression, un CtSus clair Une bande de protéine recombinante a été détectée dans la région d'environ 100 kDa, ce qui était cohérent avec sa masse moléculaire relative théoriquement prévue de 92,2 kDa (Figure 1F).

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3.2 Transformation de cellules entières

Afin de vérifier de manière préliminaire la fonction catalytique de CtSus, une souche de co-expression de CtSus et du gène de la glycosyltransférase UGT71BD1 a été construite. UGT71BD1 a été cloné et identifié à partir de Cistanche tubulosa et est une UDP-glucosyltransférase qui peut largement accepter des composés aromatiques tels que les glycosides phényléthanoïdes, différents types de flavonoïdes, le stilbène et la coumarine comme récepteurs et catalyser la réaction de glucosylation du groupe hydroxyle phénolique du substrat en utilisant l'UDP-glucose. comme donneur de sucre[18]. L'introduction de CtSus peut théoriquement fournir un donneur de glycosyle plus suffisant en UDP-glucose pour la réaction de glucosylation catalysée par UGT71BD1, favorisant ainsi l'équilibre de la réaction pour évoluer vers la formation de produits de glycosylation, augmentant ainsi le rendement en produits de glycosylation. Le plasmide pCold™ I-CtSus et le plasmide pET-28a-UGT71BD1 ont été transformés simultanément dans l'E. coli Transetta (DE3) compétent en expression. Des clones uniques contenant les deux plasmides recombinants ont été criblés par PCR sur colonie et des souches d'expression recombinantes positives ont été obtenues par vérification du séquençage (Figure 1G). La co-expression du double gène a été induite in vitro et la souche d'expression d'un gène unique pET -28 aUGT71BD1 a été utilisée comme groupe témoin. L'activité de CtSus dans la catalyse de la génération de donneur d'UDP-glucose a été préalablement vérifiée par transformation de cellules entières. Les résultats de la HPLC et de la spectrométrie de masse à haute résolution ont montré que lorsque la réaction de transformation de cellules entières était réalisée avec l'esculétine 1 et le resvératrol 2 comme substrats, la génération de produits de glycosylation évidents était détectée après 24 h de transformation, comme le montre la figure 2.

Figure 2 Biotransformation de cellules entières du substrat 1 ou 2 par une souche recombinante hébergeant UGT71BD1 ou une souche recombinante hébergeant un couplage UGT71BD1 avec CtSus, respectivement. A : Chromatogrammes HPLC de la biotransformation de cellules entières du substrat 1. La longueur d'onde de détection était de 360 ​​nm ; B : spectres HRESI-MS et MS2 du produit 1a ; C : chromatogrammes HPLC de la biotransformation en cellules entières du substrat 2 ; La longueur d'onde de détection était de 330 nm. D : spectres HRESI-MS des produits 2a et 2b

Lorsque 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, formule moléculaire C9H6O4) a été utilisé comme substrat, le pic chromatographique du produit 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, formule moléculaire prédite C15H16O9) a été détectée à 5,39 min, ce qui correspond à l'absorption UV du substrat et du produit témoin. Dans le même temps, le pic du fragment de m/z 179.033 4 [M+H]+ a été détecté dans le spectre MS2 de 1a, produit par la perte d'une molécule de glucose (162 Da), indiquant que 1a était le produit du substrat 1 connecté à une molécule de glucose. Le taux de conversion a été calculé en intégrant la surface du pic. Il a été constaté que le taux de conversion des cellules entières UGT71BD1 catalysant le substrat 1 pour générer le produit glycosylé 1a était de 71,87 %, tandis que l'ajout de CtSus augmentait le taux de conversion de la réaction à 95,84 %, soit 1,3 fois celui du groupe témoin. Lorsque le substrat était le composé 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, formule moléculaire C14H12O3), le produit chromatographique atteint un pic 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, molécule moléculaire prédite formule C20H22O8) et 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, formule moléculaire prédite 26H32O13) ont été détectés à 10,32 et 6,52 min, respectivement, ce qui correspondait à l'absorption UV caractéristique du substrat et le produit de contrôle. Un pic de fragment a été détecté à 227.071 3 [MH]-, produit par la perte d'une molécule de glucose (162 Da), indiquant que 2a était le produit du substrat 2 connecté à une molécule de glucose. En comparant les données de la littérature [18] et les informations de prédiction par spectrométrie de masse, il a été déterminé que le produit 2b était le produit du substrat 2 connecté à deux molécules de glucose. Le taux de conversion a été calculé en utilisant la zone de pic intégrée. Il a été constaté que l'ajout de CtSus pouvait augmenter le taux de conversion de la réaction de glycosylation du substrat 2 de 64,01 % à 78,51 %, parmi lesquels le rendement en produit monosaccharide 2a a augmenté de 45,09 % à 63,58 % et le rendement en produit disaccharide 2b. est passé de 18,92% à 14,93%.

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3.3 CtSus

Purification de protéines recombinantes et identification de l'activité catalytique enzymatique in vitro Les résultats de l'expérience de conversion de cellules entières suggèrent que CtSus a pour activité de catalyser la production de donneur de glucose actif, UDP-glucose. Afin de vérifier davantage l'activité catalytique par catalyse enzymatique in vitro, la protéine de fusion du gène CtSus dans le système d'expression pCold™ a été séparée et purifiée par chromatographie d'affinité. Les résultats ont montré que lorsque pCold™ I était utilisé comme vecteur d'expression, la protéine recombinante était exprimée en grande quantité, mais principalement dans le précipité. Lorsque pCold™ TF a été utilisé comme vecteur d’expression, le gène CtSus a été exprimé en grande quantité dans E. coli (Figure 3A). La protéine de fusion a été purifiée par chromatographie d'affinité HisTrap FF pour une réaction enzymatique in vitro. Les résultats sont présentés sur la figure 3B. Lorsque le saccharose et l'UDP ont été utilisés comme substrats, par rapport au groupe témoin négatif, un nouveau pic de produit a été détecté à 10,32 min. Son temps de rétention et son absorption UV étaient conformes à ceux de l'UDP-glucose. Par comparaison avec l'étalon, il s'est avéré que le produit était de l'UDP-glucose. Cependant, étant donné que la protéine de fusion exprimée par le vecteur d'expression pCold™ TF contient une grande étiquette soluble dans le facteur de déclenchement (la taille de la protéine étiquette est de 48 kDa), elle aura un impact important sur l'activité catalytique de la protéine. Par conséquent, l’étiquette de la protéine de fusion a été davantage coupée par l’enzyme facteur Xa et la protéine CtSus sans étiquette exogène a été purifiée (Figure 3A). La protéine a été soumise à une catalyse enzymatique in vitro et les résultats ont montré que le rendement en UDP-glucose a augmenté de 3,53 % à 10,66 % (Figure 3B). Les résultats ci-dessus ont confirmé l'activité de CtSus dans la catalyse de la production d'UDP-glucose par catalyse enzymatique in vitro et ont également montré que la présence d'une grande étiquette d'affinité est propice à l'expression soluble de CtSus, mais elle affectera également de manière significative l'activité de CtSus dans la catalyse de la production d'UDP-glucose par catalyse enzymatique in vitro. activité catalytique in vitro de l'enzyme.

Figure 3 Expression hétérologue et identification fonctionnelle de CtSus. A : Analyse SDS-PAGE des protéines CtSus. Piste 1 : marqueur protéique ; Piste 2 : CtSus recombinant avec facteur déclencheur ; Piste 3 : Clivage de l'étiquette Trigger13factor à l'aide de la protéase Factor Xa pour donner la protéine CtSus marquée par la flèche rouge. B : Tests enzymatiques in vitro utilisant des protéines de fusion et des protéines CtSus sans facteur déclencheur pour catalyser la synthèse de l'UDP-glucose en présence de saccharose et d'UDP, respectivement, avec l'étalon de référence UDP-glucose. La protéine bouillie a été utilisée comme groupe témoin dans les mêmes conditions. La longueur d'onde de détection était de 260 nm