Effet des extraits de Cistanche Tubulosa sur la fonction reproductrice mâle chez les rats diabétiques induits par la streptozotocine – nicotinamide-Ⅰ

1. Introduction

Le diabète sucré (DM) est une affection caractérisée par une augmentationniveaux de glucosedans le sang en raison de l’incapacité du pancréas à produire suffisamment d’insuline ou de l’incapacité du corps à l’utiliser efficacement. Selon l'OMS, le nombre de personnes atteintes de diabète est passé de 108 millions en 1980 à 422 millions en 2014 [1]. Il existe quatre catégories principales : le prédiabète (un stade précédant le diabète), le type 1 (où le pancréas ne produit pas d'insuline), le type 2 (le corps ne parvient pas à utiliser l'insuline) et le diabète gestationnel (qui survient pendant la grossesse). Le stress oxydatif est dû au déséquilibre entre la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et d’antioxydants [2], conduisant finalement à l’état diabétique. Les complications du diabète comprennent l'insuffisance rénale, les lésions nerveuses, la cécité, les accidents vasculaires cérébraux, les crises cardiaques, la mort fœtale et l'infertilité. [1]. Des études montrent que les noyaux des spermatozoïdes, l'acide désoxyribonucléique (ADN) et les mitochondries ont été significativement endommagés chez les patients diabétiques de sexe masculin [3]. Le stress oxydatif lors du transport des spermatozoïdes modifiera le processus du système reproducteur masculin [4,5].

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Le processus de spermatogenèse est contrôlé par l’axe hypothalamus-hypophyso-gonadique (HPG). L'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) produite par l'hypothalamus stimule la production d'hormone lutéinisante (LH) et d'hormone folliculo-stimulante (FSH). Les cellules de Leydig se trouvent à côté du tube séminifère etproduire de la testostéronesous le contrôle de LH. La FSH déclenche la production de protéine de liaison à l'antigène (ABP) qui aide à transmettre l'hormone mâle. Ainsi, l’infertilité et d’autres problèmes surviennent principalement en raison des perturbations qui se produisent dans l’axe HPG. L'administration de l'association streptozotocine-nicotinamide induit le diabète chez les rats expérimentaux. La streptozotocine est un composé chimique toxique pour les cellules productrices d'insuline du pancréas et la nicotinamide est une vitamine hydrosoluble qui protège les cellules contre des dommages complets [6].

Cistanche tubulosa est une espèce végétale du désert également connue sous le nom de « Rou Cong-Rong » [7]. C'est une plante parasite non chlorophyllique qui pousse principalement sur la racine de l'arbre Calotropis procera et est largement distribuée dans les terres arides du Gansu, du Qinghai, du Xinjiang, de la Mongolie, de l'Iran et de l'Inde. Le nom commun de Cistanche tubulosa est « Jacinthe du désert ». Il est largement accepté dans la médecine traditionnelle chinoise et on lui a donné le nom de « Ginseng du Désert ». Il est largement utilisé dans le domaine médical pour traiter la leucorrhée morbide, les métrorragies abondantes, les maladies rénales chroniques, la constipation, l'impuissance et l'infertilité. Constituants chimiques deLes cistanche tubulosa sont constituées de glycosides phényléthanoïdes non volatils(PHG), iridoïdes, lignanes, huiles volatiles, alditols, oligosaccharides et polysaccharides [8]. Des études montrent queéchinacosidede cette plante protège le fibroblaste endommagé en régulant les niveaux de ROS [9]. Ce composé produit des activités antioxydantes, vasorelaxantes et anti-inflammatoires ainsi que la neuroprotection et la prévention de l'ostéoporose [10,11].

Cette étude visait à étudier l’effet deExtrait de Cistanche tubuleusecontenant de l'ECH sur le dysfonctionnement reproducteur du rat diabétique induit par la streptozotocine – nicotinamide.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériels

ECH et CTE ont été achetés auprès de Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Les produits finaux de glycation avancée (AGE) ont été achetés auprès de Biovision (San Francisco, Californie, États-Unis). Les lignées cellulaires LC-540 et TM3 ont été achetées auprès du Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) âgés de cinq semaines ont été achetés au National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® a été acheté auprès de PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). Le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) a été obtenu auprès de Sigma (St. Louis, MO, USA). Du méthanol et de l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) ont également été achetés auprès de Sigma. Le milieu Eagle modifié de Dulbecco/F12 et la trypsine-EDTA ont été obtenus auprès de GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-bromure de diphényltétrazolium (MTT), diacétate de dichloro-dihydro-fluorescéine (DCFH-DA), le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le nitroblue tétrazolium (NBT) ont été achetés auprès de Sigma. Des kits enzymatiques de glucose ont été obtenus auprès de Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japon. Les kits ELISA d'insuline ont été achetés auprès de Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suède). Le réactif d'extraction de protéines tissulaires T-PER a été acquis auprès de Thermo Scientific (Chicago, IL, USA). Les anticorps polyclonaux anti-facteur nucléaire kappa B NF-κB anti-humain / souris / rat ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis. Les anticorps polyclonaux anti-souris/rat pour les produits finaux de glycation avancés (RAGE), les anticorps polyclonaux anti-humain/souris/rat StAR et les anticorps monoclonaux anti-humain/souris/rat cytochrome P450 17A1 ont été achetés auprès de Gene. Tex (Irvine, Californie, États-Unis). Des anticorps polyclonaux anti-humain/souris/rat CYP11A1 ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Le réactif Easy-Blue a été acheté auprès d'Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). L'agarose et le marqueur ADN de 100 pb ont été obtenus auprès de Promega, Corporation (Madison, WI, USA). Le mini kit RNeasy Lipid Tissue a été acheté chez QIAGEN, Hilden, Allemagne.

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2.2. Méthodes

2.2.1. Analyse in vitro

Culture cellulaire LC{{0}} et TM3 : Les lignées cellulaires LC-540 ont été cultivées à 37 ◦C dans un milieu Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) additionné de bicarbonate de sodium (1,5 g/L), L-glutamine (2 mM), acides aminés non essentiels (0,1 mM), pyruvate de sodium (1,0 mM) et sérum fœtal bovin (FBS) (10 %) dans un Incubateur 5% CO2 (incubateur CO2, Napco 5410, Taiwan). La lignée cellulaire TM3 a été cultivée dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de glucose (4,5 g/L), de pyruvate de sodium (0,5 mM), de L-glutamine (2,5 mM), de bicarbonate de sodium (1,2 g/L), {{ 28}}(2-hydroxyéthyl)-1-acide pipérazineéthanesulfonique (HEPES, 15 mM) et sérum de veau fœtal (FCS, 10 %) ou sérum de cheval (5 %) à 37 ◦C dans un mélange à 5 % Incubateur à CO2.

Détermination de la viabilité cellulaire deÉchinacoside (ECH): Le réactif 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- bromure de diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour le test de viabilité cellulaire. La concentration cellulaire a été ajustée à 2 × 105 cellules/mL dans une plaque à 96-puits. Ensuite, 20 µL d'ECH (dilué dans 2 % du milieu) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h à 37 ◦C dans un incubateur à 5 % de CO2. Plus tard, 100 µL de réactif MTT ont été ajoutés et incubés pendant 4 h à 37 ◦C dans l'obscurité. L'absorbance a été mesurée à 570 nm (lecteur ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suisse).

Viabilité cellulaire relative (%)=[(Échantillon à 570 nm - Absent à 570 nm)]/[(Acontrôle à 570 - Absent à 570)] × 100.

Test de réduction du Nitroblue Tetrazolium (NBT) et test du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) : le nombre de cellules a été ajusté à 1× 1{{10}}6 cellules/ mL. Ensuite, 50 mg/mL d'ECH, de resvératrol (RES) et de produits finaux de glycation avancée (AGE) (témoin) ont été ajoutés et co-cultivés pendant 18 h à 37 ◦C. Ensuite, 0,3 ml de solution de NBT (0,1 mg/mL de NBT, 5 % de FBS et 3 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dissous dans 10 ml de DMEM) ont été ajoutés et incubés à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 1 h. Après centrifugation (à 800 x g pendant 3 min), le surnageant a été retiré et 200 µL de DMSO ont été ajoutés et secoués pendant 5 min dans un oscillateur à ultrasons (Delta ultrasons Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). L'absorbance a été mesurée à 630 nm. Pour le test des radicaux DPPH, Trolox (dans 95 % d'alcool) a été pris comme étalon. Ensuite, 75 µL de solution DPPH 0,5 mM ont été mélangés à 25 µL d’échantillons et laissés réagir à température ambiante dans un endroit sombre pendant 30 min. Le mélange a été secoué et l'absorbance a été mesurée à 517 nm.

Analyse de la teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) : le nombre de cellules a été ajusté à 2 × 105 cellules/mL dans une plaque à puits 12- contenant 2 % de FBS. Ensuite, 50 µL/mL d’ECH, RES et AGE ont été ajoutés à la plaque et incubés à 37 ◦C pendant 24 h. Après 24 h, du 20,70 -dichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) a été ajouté et incubé à 37 ◦C pendant 30 min. Après centrifugation (400 x g, 5 min), le surnageant a été éliminé et les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, les cellules ont été mises en suspension dans 1 ml de PBS et les niveaux de ROS ont été déterminés à l'aide d'un cytomètre en flux (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).

Identification et analyse quantitative des protéines : Les protéines ont été extraites à l'aide d'un réactif d'extraction de protéines (T-PER). La densité cellulaire a été ajustée à 2 × 105 cellules/mL dans une plaque à puits 12- et 50 µL/mL d'ECH, RES et un récepteur pour l'antagoniste du produit final de glycation avancée (RAGE), et les AGE ont été ajoutés et incubés. à 37 ◦C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 24 h. Ensuite, 400 µL de T-PER ont été ajoutés, grattés des cellules et centrifugés à 125,000× g pendant 20 min (4 ◦C). Le surnageant a été collecté et stocké à -80 ◦C (congélateur à -80 ◦C, Nuaire, Plymouth, MN, USA) pour une analyse plus approfondie. Un kit d'acide bicinchoninique (BCA) a été utilisé pour la quantification des protéines. Ensuite, 10 µL de solution cellulaire standard et 200 µL de réactif BCA ont été ajoutés à des plaques à 8-puits et incubés à 37 ◦C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 30 min. L'absorbance a été mesurée à 562 nm. L'analyse d'identification des protéines a été réalisée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium (SDS)-polyacrylamide (SDS-PAGE). Les échantillons ont été préparés en ajoutant un lysat de protéines à un tampon de chargement de protéines et une analyse par Western blot a été réalisée pour détecter les protéines spécifiques.

2.2.2. Analyse in vivo

Conception de modèles animaux : Soixante rats Sprague-Dawley (SD) mâles âgés de {{0}} semaines ont été achetés au National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Chaque rat a été hébergé individuellement dans des cages désinfectantes en acier inoxydable sous température contrôlée (23 ± 1 ◦C) et humidité (40–60%) avec un cycle de lumière de 12 h / 12 h d'obscurité. De la nourriture et de l'eau étaient fournies à volonté. Chaque rat a été domestiqué au cours de la première semaine et a reçu le régime alimentaire 5001 pour rongeurs de laboratoire comme régime alimentaire principal. Toutes les procédures suivaient les normes du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (approbation IACUC n ° 101026) de la National Taiwan Ocean University, Taiwan. Après domestication, les rats ont été divisés en deux groupes : le groupe témoin (Con) qui a reçu le régime de laboratoire 5001 et le groupe diabétique qui a reçu un régime riche en graisses (HFD, 40 %) pendant toute l'expérience. Après avoir été nourris avec le HFD pendant 4 semaines, les rats du groupe diabétique ont reçu une injection de streptozotocine (65 mg/kg) (STZ) pour induire un diabète sucré (DM). Dans les 15 minutes suivant l'injection de STZ, du nicotinamide (230 mg/kg de poids corporel) a été injecté. Une semaine après l'injection, un test oral de tolérance au glucose (OGTT) a été réalisé pour déterminer le succès de l'induction du diabète sucré (DM). Après cela, les animaux ont été divisés en six groupes : le contrôle (nourri avec le régime de laboratoire 5001) ; Groupe DM (DM + 45 % HFD ); Groupe DMR (DM + rosiglitazone : 0,571 mg/kg de poids corporel) + 45 % HFD ; Groupe DME1 (DM + CTE : 80 mg/kg de poids corporel) + 45 % HFD ; Groupe DME2 (DM + CTE : 160 mg/kg de poids corporel) + 45 % HFD ; et groupe DME4 (DM + CTE : 320 mg/kg de poids corporel) + 45 % HFD. La rosiglitazone (RSG) a été prise comme contrôle positif. Trois doses de CTE (80, 160 et 320 mg/kg) ont été utilisées conformément aux recommandations des directives d'évaluation fonctionnelle des aliments naturels de la Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Les traitements ont été administrés jusqu'à la fin de l'expérience. Tous les rats expérimentaux ont été sacrifiés après 6 semaines. Le sang prélevé sur les rats a été centrifugé à 3 000 tr/min pendant 15 min à 4 ◦C. Le surnageant a été examiné pour l'analyse suivante :

Détermination du glucose total, des triglycérides et du cholestérol : La détermination du glucose a été réalisée à l'aide de kits enzymatiques de glucose. Ensuite, 20 µL d’échantillons de plasma sanguin ont été ajoutés aux réactifs et conservés à 37 ◦C pendant 5 min. Les triglycérides totaux et la concentration de cholestérol total ont été déterminés à l'aide de kits enzymatiques de triglycérides et de cholestérol. Ensuite, 10 µL de plasma sanguin ont été ajoutés aux réactifs et l’expérience a été menée conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance a été mesurée à 510 nm.

Glucose/triglycérides/cholestérol totaux plasmatiques (mg/dL)=(Asample − ABlank)/(Astandard − ABlank) × 200.

Aéchantillon : Absorbance des échantillons de sang, ABlank : Valeur d'absorbance des kits sans échantillon, Astandard : Valeur d'absorbance du réactif étalon, 200 : réactifs étalons à une concentration de 200 mg/dL.

Évaluation du modèle d'insuline, de leptine et d'homéostatique – Détermination de la résistance à l'insuline (HOMA-IR) :Le niveau d'insuline a été déterminé par des kits ELISA d'insuline. Ici, 25µL de plasma sanguin a été ajouté auréactifs, et l’absorbance a été mesurée à 450 nm. La teneur totale en leptine a été déterminée à l'aide d'unkit de test immunométrique enzymatique leptine.Ensuite, 100µL de plasma a été analysé et l'absorbancea été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur ELISA. L'ensemble de l'expérience a été mené selonles instructions du fabricant. La valeur HOMA-IR a été déterminée à partir du modèle d'homéostasieéquation d'évaluation=Concentration d'insuline plasmatique à jeun (mg/mL)× glycémie à jeun(mmol/L)/22,5.

Peroxydation lipidique plasmatique : Ici, {{0}},5 mL de plasma sanguin a été mélangé à 1 mL de réactif (15 %, p/v d'acide trichloroacétique dans de l'acide chlorhydrique 0,25 N (HCl ) et 0,375%, p/v d'acide thiobarbiturique dans 0,25 N HCl) et placé dans un bain-marie (Water Bath, BUCHI 461, Zürich, Suisse) à 100 ◦C pendant 15 min. Après refroidissement, 1 ml de n-butanol a été ajouté, secoué vigoureusement et centrifugé à 1 500 x g pendant 10 min. Le surnageant a été collecté et l'absorbance a été mesurée à 532 nm [12].

Concentration de malondialdéhyde (MDA) (nM/mL)=[(Un échantillon à 532 nm − Ablanc à 532 nm)/ (Un étalon à 532 nm − Ablanc à 532 nm)] × 5.

standard à 532 nm − Ablanc à 532 nm)] × 5. Détermination des taux plasmatiques de testostérone et d'hormone lutéinisante (LH) : Le kit ELISA de testostérone a été utilisé pour mesurer le taux de testostérone dans le plasma sanguin. Le kit RIA a été utilisé pour déterminer la concentration de LH. Ensuite, 50 µL de plasma ont été ajoutés et les calculs ont été basés sur la concentration de l'hormone LH-RP-3 (standard). Les étapes suivantes ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant.

Détermination de la concentration du facteur de nécrose tumorale (TNF) et de l'interleukine-6 (IL-6) : l'anticorps capturé a été dilué 250 fois dans un tampon de revêtement, ajouté à un 96- plaque à puits (100 µL/puits) et conservée à 4 ◦C pendant la nuit. Le surnageant a été aspiré et lavé cinq fois avec un tampon de lavage (1 fois PBS, 0,05 % Tween 20). Après incubation (1 h) avec 200 µg de diluant de test, les cellules ont été lavées 5 fois avec du tampon de lavage et 100 µL de solution étalon de TNF ou des échantillons de test ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h. Après lavage, 100 µL d'anticorps détectés par l'IL -6- ont été ajoutés et incubés pendant 1 h à température ambiante. Le surnageant a été aspiré et lavé 5 fois. Ensuite, 480 µL d’enzyme avidine-peroxydase de raifort (HRP) ont été ajoutés et incubés pendant 30 min à température ambiante. Le surnageant a été aspiré et lavé cinq fois avec un tampon de lavage. Ensuite, 100 µL de solution de substrat ont été ajoutés et incubés pendant 15 min à température ambiante. Plus tard, 50 µL de solution d’arrêt (acide phosphorique 1 M) ont été ajoutés à chaque puits et l’absorbance a été mesurée à 450 nm.

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Analyse des paramètres du sperme et des testicules

Collecte d'échantillons de sperme : La collecte d'échantillons de sperme a été réalisée selon la méthode décrite précédemment dans [13]. Les spermatozoïdes ont été collectés sur le surnageant et utilisés pour une analyse plus approfondie.

Le nombre de spermatozoïdes, la motilité des spermatozoïdes et les spermatozoïdes anormaux : Le nombre de spermatozoïdes a été calculé à l'aide de l'hémocytomètre et d'une solution de bleu trypan. Ensuite, 100 µL de liquide spermatique ont été mélangés avec une solution de bleu trypan et le nombre de spermatozoïdes, la motilité et les spermatozoïdes anormaux ont été calculés à l'aide d'un hémocytomètre et d'un microscope (14).

Réduction du NBT au bleu nitro tétrazolium et peroxydation lipidique des spermatozoïdes et des testicules : La peroxydation lipidique et la réduction du NBT ont été analysées selon la même procédure d'analyse plasmatique.

Détermination de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase : L'activité de la superoxyde dismutase (SOD) a été analysée à l'aide du kit RANSEL. Ici, {{0}}.05 mL d'homogénats testiculaires ont été ajoutés à 1,7 mL de solution réactionnelle (0,05 mM de xanthine, 0,025 mM 2-({ {9}}iodophényl)- 3-(4-nitrophénol)-5-chlorure de phényltétrazolium (INT)). Après mélange, 0,25 ml de xanthine oxydase (80 U/L) ont été ajoutés et mis à réagir à température ambiante pendant 30 s. L'absorbance a été mesurée à 505 nm. La concentration en protéines de l'homogénat testiculaire a été déterminée par le kit de test de protéines Bio-Rad DC et son activité spécifique (U/mg de protéine) a été calculée. L'activité catalase (CAT) a été déterminée selon une méthode précédemment rapportée [15].

Coloration H&E (hématoxyline et éosine)

Le testicule a été trempé dans 10 % de formol pendant 24 h et conservé à 4 ◦C. Les tissus étaient de taille micro et attachés à la lame. Après fixation (95 % de méthanol + 5 % d'acide acétique), les lames ont été immergées dans de l'hématoxyline pendant 3 min, lavées à l'eau courante pendant 5 min, puis trempées dans de l'alcool à 50 %, 70 % et 90 % pendant une minute. Après cela, les lames ont été colorées à l’éosine pendant 10 s et trempées dans de l’alcool à 100 % pendant une minute jusqu’à ce qu’elles disparaissent. Enfin, la lame a été trempée dans du xylène pendant une minute. Plus tard, la lame a été séchée à l'air et scellée. Le tube coloré a été placé dans un microscope à contraste de phase inversé (Inverted Phase Difference Microscope, Olympus CK-2, Tokyo, Japon) pour observer la morphologie.

Analyse de l'hypothalamus

Les séquences des gènes KISS1 de souris, récepteur couplé à la protéine G (GPR) 54, suppresseur de la signalisation des cytokines 3 (SOCS-3) et sirtuine 1 (SIRT1) ont été identifiées à partir de la base de données génétiques du NCBI (National Center for Biotechnology Information). et une amorce spécifique a été conçue à l'aide de Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Les amorces utilisées dans l'expérience sont répertoriées dans le tableau 1.

Extraction de l'acide ribonucléique (ARN) de l'hypothalamus. L’extraction de l’ARN de l’hypothalamus du cerveau a été réalisée à l’aide du kit RNeasy Lipid Tissue Mini. Les ARNm obtenus ont été mesurés quantitativement par transcription inverse (RT) et réaction en chaîne par polymérase (PCR). L'ADN complémentaire obtenu par analyse RT a été stocké à -20 ◦C pour une utilisation ultérieure. L'ADN extrait a été soumis à une analyse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l'aide de la Taq polymérase. Ensuite, 5 à 10 µL du produit PCR ont été prélevés et analysés par électrophorèse sur un colloïde d’agar à 1,5 %. L'image a été prise dans un système d'imagerie UVP BioDoc-It. De l'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) à transcription inverse a été prélevé et la PCR a été réalisée à l'aide du kit IQ SYBR Green Supermix. Plus tard, il a été analysé avec le logiciel du système optique iQTM 5. Les protéines ont été extraites à l'aide d'un réactif d'extraction de protéines (T-PER). Ensuite, 20 mg d'homogénat testiculaire ont été ajoutés à 400 µL de T-PER et centrifugés (centrifugeuse à grande vitesse, Hettich CR-12, Tuttlingen, Allemagne) à 4 ◦C (125,000× g ) pendant 20 minutes. La méthode suivante était similaire à « l’analyse d’identification et de quantification des protéines » dans l’analyse in vitro.

2.3. Analyse statistique

Les résultats expérimentaux ont été exprimés sous forme de moyenne ± écart type (Moyenne ± SD) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Les différences entre les groupes ont été analysées par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Des comparaisons multiples de différents groupes ont été analysées par le test de Duncan à la valeur de p < 0,05 comme niveau significatif.

3. Résultats

3.1. Analyse in vitro

3.1.1. Comparaison des activités antioxydantes de l'ECH, du CTE et du RES

h à long termeun stress oxydatif élevé et une inflammation chronique sont les principales causes du diabètecomplications [16]. Les CTE contiennent diversglycosides phényléthanoïdes tels que l'échinacoside(ECH) et acteoside, avec un potentiel d'activité antioxydante [17]. Élimination des radicaux DPPHUn test a été effectué pour évaluer l’activité antioxydante de l’ECH. Trolox et resvératrol(3,5,4'-trihydroxystilbène, RES) ont été pris respectivement comme standard et contrôle positif. Comme indiquédans la figure1, ECH a montré une meilleure activité de piégeage des radicaux et l'activité était significativement plus élevéeque celui du contrôle positif (RES).

3.1.2. Viabilité cellulaire de l'ECH sur les cellules LC-540 et TM3 Leydig

Un test MTT a été réalisé pour évaluer la viabilité cellulaire de différentes concentrations d'ECH. Les cellules LC-540 Leydig et TM3 Leydig ont montré plus de 80 % de viabilité après avoir été traitées avec ECH (Figure 2). Par rapport aux autres concentrations, une concentration de 100-µM (dilutions de 100 µM dans 2 % de FBS) d'ECH a montré une meilleure viabilité cellulaire dans les cellules TM3 Leydig. Le résultat indique que la concentration accrue d’ECH ne contribue pas à une toxicité significative pour les cellules.

3.1.3. Effet de l'ECH sur la production de superoxyde induite par l'AGE par test NBT dans les cellules LC-540 et TM3 Leydig

Les AGE provoquent des dommages oxydatifs dans l'organisme en raison de l'oxydation du glucose et de la formation de radicaux libres tels que O2-, de radicaux hydroxyles et de groupes carbonyle [18]. Après avoir été stimulées avec 50 ug/mL d'AGE, les cellules LC-540 (Figure 3a) et TM3 (Figure 3b) ont été traitées avec ECH et RES (5 μM et 10 μM chacune). Les résultats ont montré que la production d'anions superoxyde a été augmentée dans le groupe témoin (AGE stimulés), mais que la production d'anions superoxyde a diminué après le groupe témoin (AGE stimulés), mais que la production d'anions superoxyde a diminué après la production de superoxyde et protégé. les cellules contre les dommages oxydatifs. Dans le cas des cellules LC-540, 10 µM ECH ont montré une activité presque similaire à celle du groupe normal. La production de superoxyde dans les deux cellules a diminué avec une augmentation de la concentration d'ECH et de RES.

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3.1.4. Effet de l'ECH sur la production de H2O2 dans les cellules de Leydig LC -540 stimulées par AGE

Le test DCFH-DA a été exécuté pour détecter la présence d’espèces oxydantes. Après être entré dans les cellules, le colorant fluorescent DCFH-DA est oxydé par le H2O2 intracellulaire et forme de la dichlorofluorescéine (DCF). Comme le montre la figure 4, il y a eu une augmentation significative de la production intracellulaire de H2O2 dans le groupe stimulé par AGE (témoin), tandis que l'ajout de 10 µM d'ECH et de RES a réduit de manière significative la production de H2O2 dans les cellules. L'administration de 10 µM d'ECH n'a entraîné qu'environ 47,1 % de la production de H2O2, ce qui est nettement inférieur à celui du groupe témoin.

3.1.5. Effet de l'ECH sur les niveaux d'expression des protéines RAGE et NF-κB dans les cellules de Leydig LC -540 stimulées par l'AGE

Une analyse par Western blot a été réalisée pour confirmer la présence de RAGE dans les cellules LC-540 Leydig. L'effet de l'ECH sur les niveaux d'expression des protéines RAGE (Figure 5a) et NF-κB (Figure 5b) dans les cellules de Leydig stimulées par les AGE ont été présentés à la Figure 5. Les résultats ont montré qu'une concentration de 50 µg/mL d'AGE induisait des RAGE et NF- plus élevés. L'expression de κB dans les cellules LC-540 Leydig et une concentration de 10 µM d'ECH et de RES ont réduit de manière significative l'expression de RAGE et de NF-κB. L'expression de NF-κB était significativement plus faible dans RES et ECH que dans les antagonistes de RAGE. Ainsi, les résultats ont confirmé que l’ECH réduisait le niveau d’inflammation en diminuant le niveau de RAGE et de NF-κB.

3.1.6. Effet de l'ECH sur la voie de synthèse de la testostérone dans les cellules de Leydig LC -540 stimulées par l'AGE.

Le processus de spermatogenèse et d’infertilité masculine dépend de la présence de testostérone. Comme le montre la figure 6, les expressions des protéines StAR (figure 6a), CYP11A1 (figure 6b), CYP17A1 (figure 6c) et HSD17 3 (figure 6d) étaient significativement diminuées dans les LC{{11 stimulées par l'AGE. }} Cellules de Leydig (groupe témoin). Les expressions des protéines StAR, CYP11A1, CYP17A1 et HSD17 3 ont été significativement augmentées lorsque l'antagoniste RAGE, RES et ECH ont été ajoutés. L'expression accrue des protéines StAR et CYP11A1 a été observée dans les groupes traités par ECH et RES. Le niveau d'expression du CYP17A1 était presque similaire dans les groupes RES et ECH. Les expressions de la protéine HSD17 3 dans les cellules de Leydig traitées à l'ECH étaient beaucoup plus élevées que celles des cellules traitées avec les antagonistes RES et RAGE. L'expression accrue des protéines StAR, CYP11A1, CYP17A1 et HSD17 3 indique la production normale de testostérone.