L’extrait de Cistanche Deserticola augmente la formation osseuse dans les ostéoblastes - Partie I

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Te-Mao Li^unet a

Abstrait
Objectifs Nous avons étudié l’effet deCistanchedeserticolaMaman. (CD) surosformationpar des ostéoblastes cultivés. Méthodes Le dosage de la formation de nodules minéralisés a été utilisé pour examiner les effets in vitro de la MC(Cistanchedeserticola)surosformation. La phosphatase alcaline (ALP), les protéines morphogénétiques osseuses (BMP)-2 et l’expression de l’ARNm de l’ostéopontine (OPN) ont été analysées par réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase. Le mécanisme d’action de la DC(Cistanchedeserticola)l’extrait a été étudié à l’aide du transfert Western. L’effet anti-ostéoporotique in vivo de la MC(Cistanchedeserticola)l’extrait a été évalué chez des souris ovariectomisées.
Principales constatations

CD(Cistanchedeserticola)l’extrait n’a eu aucun effet sur la prolifération, la migration ou la cicatrisation des ostéoblastes cultivés, mais a augmenté l’ALP, le BMP-2 et l’ARNm OPN et la minéralisation osseuse. Les inhibiteurs de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) ou du facteur nucléaire (NF)-kB ont réduit la MC(Cistanchedeserticola)induit par l’extraitformation osseuseet l’expression ALP, BMP-2 et OPN. Cependant, CD(Cistanchedeserticola)extrait n’a pas affecté l’ostéoclastogenèse. En outre, CD(Cistanchedeserticola)a empêché la perte osseuse induite par l’ovariectomie in vivo.
Conclusions

CD(Cistanchedeserticola)peut être un romanformation osseuseagent pour le traitement de l’ostéoporose.

Mots-clésformation osseuse;Cistanchedeserticola; Herbe chinoise; Ostéoblastes

Cistanche deserticolaest bon pourformation osseuse

Introduction

L’os est un tissu complexe composé de plusieurs types de cellules qui subissent un processus continu de renouvellement et de réparation appelé « remodelage osseux ». Deux principaux types de cellules responsables du remodelage osseux sont les ostéoclastes, qui résorbent les os, et les ostéoblastes, qui forment de nouveaux os. Le remodelage osseux est régulé par plusieurs hormones systémiques (par exemple, l’hormone parathyroïdienne, la 1, 25-dihydroxy vitamine D3, les hormones sexuelles et la calcitonine) et des facteurs locaux (par exemple, l’oxyde nitrique, les prostaglandines, les facteurs de croissance et les cytokines). [1] L’ostéoporose se produit lorsque la résorption et la formation osseuse ne sont pas coordonnées et que la dégradation osseuse excessive dépasse la construction osseuse. [2] Les traitements actuels de l’ostéoporose comprennent les bisphosphonates, la calcitonine et les œstrogènes, qui sont des inhibiteurs de la résorption osseuse qui maintiennent la masse osseuse en inhibant l’activité des ostéoclastes. [3] Cependant, l’effet de ces médicaments sur l’augmentation ou la récupération de la masse osseuse est relativement faible, certainement pas plus de 2% par an. [3] Il existe donc un besoin d’agents de construction osseuse, tels que le tériparatide, qui stimulent de nouveauxosformationet corriger le changement de microarchitecture trabéculaire caractéristique de l’ostéoporose établie. [4,5] Parce que nouveauosformationest principalement une fonction de l’ostéoblaste, les agents qui agissent soit en augmentant la prolifération des cellules de la lignée ostéoblastique, soit en induisant la différenciation des ostéoblastes peuvent améliorer la formation osseuse. [5,6]
Bien que les mécanismes de l’ostéoporose restent incertains, ils sont probablement liés à la diminution de la disponibilité ou aux effets des facteurs de croissance osseuse, tels que les protéines morphogénétiques osseuses (BMP). [7] Les BMP, qui sont structurellement liés à la superfamille du facteur de croissance transformant b, ont été identifiés à l’origine par leur capacité à induire des ectopiques.os formationchez les rongeurs. [8] Les BMP jouent un rôle important dansosformationet la différenciation des cellules osseuses en stimulant l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) ainsi que la synthèse du protéoglycane, du collagène et de l’ostéopontine (OPN). [9] Une étude récente a révélé un lien entre l’ostéoporose et des polymorphismes spécifiques dans les gènes BMP-2, ALP et OPN, suggérant qu’ils sont associés au développement de l’ostéoporose. [10]

CistanchedeserticolaMaman. (Orobanchaceae; abrégé en CD)(Cistanchedeserticola)est une herbe indigène en Chine et est largement utilisé en médecine traditionnelle comme agent thérapeutique en raison de ses propriétés sédatives, analgésiques et immunostimulantes. [11] Des études pharmacologiques modernes ont montré que la MC(Cistanchedeserticola)les extraits peuvent stimuler l’immunité[12], piéger les radicaux libres[13] et augmenter l’activité de la superoxyde dismutase. [14] Les agents anti-inflammatoires et antioxydants ont le potentiel de traiter l’ostéoporose en augmentantos formationet/ou la suppression de la résorption osseuse. [15,16] Cependant, l’effet de la DC(Cistanchedeserticola)sur la fonction des cellules osseuses n’a pas encore été déterminée. Ici, nous rapportons ce CD(Cistanchedeserticola)l’extrait n’a pas affecté la prolifération, la migration ou l’activité de cicatrisation des ostéoblastes cultivés, mais a augmenté l’expression de l’ALP, du BMP-2 et de l’OPN et la minéralisation osseuse. En outre, nous montrons que les voies de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) et du facteur nucléaire (NF)-kB peuvent être impliquées dans l’augmentation de l’expression génique et de la minéralisation osseuse médiée par la CD. En revanche, le CD(Cistanchedeserticola)n’a pas supprimé l’ostéoclastogenèse in vitro. Notamment, le traitement des souris atteintes de la MC(Cistanchedeserticola)extrait a empêché la perte osseuse induite par l’ovariectomie in vivo. Nos données suggèrent donc que CD(Cistanchedeserticola)peut être utilisé pour stimulerosformationpour le traitement de l’ostéoporose.

Cistanche deserticolarenforcer l’immunité

Matériaux et méthodes

Extrait et matériaux de Cistanche deserticola

CD(Cistanchedeserticola)l’extrait a été acheté à Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taïwan). Extraction et isolation de CD(Cistanchedeserticola)ont été suivis comme décrit précédemment (sur la base de données spectrales, ils ont identifié la composition chimique, y compris le bêta-sitostérol, le daucostérol, l’acide succinique, le triacontanol, l’actéoside, la bétaïne et le polysaccharide). [17] Des anticorps polyclonaux de lapin spécifiques aux kinases p-extracellulaires régulées par signal (ERK), ERK, p-p38, p38, p-c-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65 et p65 ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, États-Unis). Le kit ELISA d’ostéocalcine a été acheté auprès de Biosource Technology (Nivelles, Belgique). Les télopeptides C-terminal du kit ELISA de collagène de type I ont été obtenus auprès de Cross Laps (Herlev, Danemark). Le mutant dominant-négatif p38 a été fourni par le Dr J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, États-Unis). Le mutant dominant-négatif JNK a été fourni par le Dr M. Karin (Université de Californie, San Diego, États-Unis). Le mutant dominant-négatif ERK2 a été fourni par le Dr M. Cobb (South-Western Medical Center). Tous les autres réactifs ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, Usa).

Culture cellulaire

La lignée cellulaire d’ostéoblastes murins MC3T3-E1 a été achetée auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, États-Unis). Les cellules ont été cultivées dans 95 % de l’air, 5 % de CO2 avec de l’a-MEM qui a été complété par 20 mm de HEPES et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 2 mm-glutamine, pénicilline (100 U/ml) et streptomycine (100 mg/ml).

Mesure de la formation de nodules minéralisés

La formation de nodules minéralisés a été évaluée comme décrit. [18] En bref, les ostéoblastes ont été cultivés dans un milieu contenant de la vitamine C (50 mg/ml) et du b-glycérophosphate (10 mm) pendant deux semaines, et le milieu a été changé tous les trois jours. Après incubation avec CD(Cistanchedeserticola)pendant 12 jours, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée Tris de 20 mm contenant 0,15 m de NaCl (pH 7,4), fixées dans de l’éthanol glacé à 75 % (v/v) pendant 30 min et séchées à l’air. Le dépôt de calcium a été déterminé à l’aide d’une coloration rouge-S à l’alizarine. En bref, les cellules et la matrice fixées à l’éthanol ont été colorées pendant 1 h avec 40 mm d’alizarine rouge-S (pH 4,2) et rincées abondamment à l’eau. La coloration liée a été éluée avec 10% (p / v) de chlorure de cétylpyridinium et d’alizarine rouge-S dans les échantillons a été quantifiée en mesurant l’absorbance à 550 nm et comparée à une courbe standard. Une mole d’alizarine rouge-S lie sélectivement environ deux moles de calcium.

Cistanche deserticolaest bon pourformation osseuse

Réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase

L’ARN total a été extrait des ostéoblastes à l’aide d’un kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taïwan). La transcription inverse a été réalisée à l’aide de 2 mg d’ARN total et d’un amorce oligo(dT). [19,20] La réaction en chaîne quantitative en temps réel de la polymérase (qPCR) a été réalisée à l’aide du mélange maître PCR en une étape TaqMan® (Applied Biosystems, Carlsbad, États-Unis). L’ADNc total a été ajouté (100 ng par réaction de 25 ml) avec des amorces spécifiques à la séquence et des sondes Taqman®. Tous les amorces et sondes du gène cible ont été achetés dans le commerce, y compris la b-actine comme contrôle interne (Applied Biosystems). Les tests qPCR ont été réalisés en trois exemplaires sur un système de détection de séquence StepOnePlus (Applied Biosystems). Les conditions de cycle étaient une activation de la polymérase de 10 minutes à 95 °C suivie de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et de 60 °C pendant 60 s. Le seuil a été fixé au-dessus de l’arrière-plan de contrôle sans gabarit et dans la phase linéaire de l’amplification du gène cible pour calculer le nombre de cycles auquel le transcrit a été détecté (noté CT).

Analyse western blot

Les lysats cellulaires ont été préparés comme décrit précédemment. [21,22] Les protéines ont été résolues par SDS-PAGE et transférées dans les membranes de polyfluorure de vinyle Immobilon (Millipore, Billerica, États-Unis). Les taches ont été bloquées avec 4% d’albumine sérique bovine pendant 1 h à température ambiante, puis sondées avec des anticorps anti-humains de lapin contre p-65, ou p-p65 (1: 1000) pendant 1 h à température ambiante. Après trois lavages, les blots ont été incubés avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase (1: 1000) pendant 1 h à température ambiante. Les taches ont été visualisées par chimiluminescence améliorée à l’aide d’un film X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, États-Unis).

Ostéoporose induite par l’ovariectomie

Des souris ICR femelles, âgées de quatre semaines, 22 ~ 28 g, ont été utilisées pour cette étude. Les souris ont été ovariectomisées bilatéralement sous anesthésie au trichloroacétaldéhyde (100 mg / kg) et les souris témoins ont été opérées simulées (Sham) à des fins de comparaison. La densité minérale osseuse et la teneur en minéraux osseux ont été mesurées après administration orale de diverses concentrations de MC(Cistanchedeserticola)extraire tous les deux jours pendant quatre semaines. La densité minérale osseuse totale du corps et la teneur en minéraux osseux ont été déterminées par un absorptiomètre à rayons X à double énergie (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, États-Unis) en utilisant un mode pour les petits sujets comme décrit précédemment. [18,23] Tous les protocoles étaient conformes aux directives institutionnelles et ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de l’Université médicale de Chine.

Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis). Les valeurs données sont des SEM moyens. L’analyse statistique entre deux échantillons a été effectuée à l’aide du test t de Student. Des comparaisons statistiques de plus de deux groupes ont été effectuées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance avec le test posthoc de Bonferroni. Dans tous les cas, P< 0.05="" was="" considered="">

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Résultats

Cistanche deserticolaextrait augmente la minéralisation osseuse par ostéoblastes Ajout du CD(Cistanchedeserticola)pendant 24 ou 48 h n’a pas affecté la prolifération des cellules d’ostéoblaste MC3T3-E1 de souris dans un test MTT (données non montrées). Parce que la différenciation ostéoblastique est un processus complexe impliquant la prolifération et la migration cellulaires, nous avons également testé la capacité migratoire des cellules MC3T3-E1 après traitement par CD(Cistanchedeserticola)extraire. En utilisant Transwell et des tests de cicatrisation des plaies, nous avons constaté que la CD(Cistanchedeserticola)n’a pas affecté la migration des ostéoblastes (données non montrées). La formation de nodules minéralisés est l’un des marqueurs de la maturation des ostéoblastes. La coloration rouge S d’alizarine a montré que des nodules minéralisés se sont formés lorsque les ostéoblastes ont été cultivés pendant deux semaines dans un milieu contenant de la vitamine C (50 μg / ml) et du β-glycérophosphate (10 mm), de manière dépendante de la concentration par l’ajout de CD(Cistanchedeserticola)(Figure 1a). Par conséquent, CD(Cistanchedeserticola)extrait induit la formation de nodules osseux par les ostéoblastes cultivés, mais pas leur prolifération ou leur migration. Nous avons également examiné le rôle de la DC(Cistanchedeserticola)dans l’ostéoclastogenèse induite par RANKL mais n’a trouvé aucun effet (données non montrées).

L’extrait de Cistanche deserticola augmente l’expression de la phosphatase alcaline, de la protéine morphogénétique osseuse-2 et de l’ostéopontine dans les ostéoblastes cultivés

Les ostéoblastes différenciés présentent une activité ALP élevée, ce qui est en corrélation avec des niveaux élevés d’expression enzymatique. [18] Nous avons constaté que le traitement par la MC(Cistanchedeserticola)extrait pendant 72 h a significativement augmenté l’activité ALP des ostéoblastes (Figure 1b). Compte tenu du rôle crucial du BMP-2, de l’ALP et de l’OPN dans la différenciation des ostéoblastes, nous avons testé si la MC(Cistanchedeserticola)l’extrait exerce son effet sur la différenciation des ostéoblastes en régulant l’expression de BMP-2, ALP et OPN. Traitement des cellules atteintes de la MC(Cistanchedeserticola)extraits a augmenté l’expression de l’ARNm de l’ALP, du BMP-2 et de l’OPN d’une manière dépendante de la concentration (Figure 1c), démontrant que la DC(Cistanchedeserticola)extrait induit la différenciation des ostéoblastes en régulant à la hausse l’expression de l’ALP, du BMP-2 et de l’OPN.

L’extrait de Cistanche deserticola augmente la formation de nodules osseux par la voie de la protéine kinase activée par le mitogène

Il a été rapporté que MAPK joue un rôle important dansosformation[24,25] nous avons donc examiné ensuite si cette voie de signalisation est impliquée dans la MC(Cistanchedeserticola)minéralisation osseuse induite par l’extrait. Prétraitement des cellules avec l’inhibiteur ERK U0126, l’inhibiteur p38 SB203580 ou l’inhibiteur JNK SP600125 réduit CD(Cistanchedeserticola)minéralisation osseuse accrue par l’extrait (figures 2a, 3a et 4a). En outre, les inhibiteurs ont également bloqué la MC(Cistanchedeserticola)expression ALP, BMP-2 et OPN induite par l’extrait (figures 2b à 4c). Transfection de cellules avec CD réduite mutante ERK2, p38 ou JNK(Cistanchedeserticola)extrait-augmentation de l’expression de l’ARNm ALP, BMP-2 et OPN (figures 2c, 3c et 4c). Ensuite, nous avons directement examiné l’activation ERK, p38 et JNK après CD(Cistanchedeserticola)traitement de l’extrait. Incubation de cellules atteintes de MC(Cistanchedeserticola)extrait induit ERK, p38 et phosphorylation JNK (figures 2d, 3d et 4d). Par conséquent, ERK, p38 et JNK interviennent dans l’augmentationosformationinduite par la MC(Cistanchedeserticola)traitement des ostéoblastes.

L’extrait de Cistanche deserticola augmente la formation de nodules osseux par la voie du facteur nucléaire kB

Comme mentionné précédemment, l’activation NF-kB est nécessaire pourosformation. [26,27] Nous avons ensuite traité des ostéoblastes avec les inhibiteurs du FN-kB pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) et N-tosyl-L-phénylalanine chlorométhylcétone (TPCK) achetés à Calbiochem (Darmstadt, Allemagne) pour déterminer si l’activation de NF-kB est impliquée dans la MC(Cistanchedeserticola)minéralisation osseuse induite par l’extrait. La figure 5a montre que le prétraitement des ostéoblastes avec PDTC ou TPCK a inhibé la MC(Cistanchedeserticola)la formation de nodules osseux induite par l’extrait et a également réduit l’augmentation de l’expression de l’ALP, du BMP-2 et de l’OPN (figure 5b et 5c). La phosphorylation de la sous-unité NF-kB p65 est un indicateur de l’activation NF-kB; [28] conformément à cela, nous avons constaté que le CD(Cistanchedeserticola)extrait augmentation de la phosphorylation p65 dans les ostéoblastes (Figure 5d). Ces résultats ont indiqué que l’activation de NF-kB est importante pour l’expression de l’ALP, du BMP-2 et de l’OPN induite par l’extrait de LA MC et la formation de nodules osseux.

Figure 4 Implication des kinases N-terminales c-Jun (JNK) dansCistanchedeserticola(CD) minéralisation osseuse induite par l’extrait dans les ostéoblastes. a) Les cellules ont été plaquées dans des plaques de 24 puits et cultivées dans un milieu contenant de la vitamine C (50 mg/ml) et du b-glycérophosphate (10 mM) pendant deux semaines. Les cellules ont été traitées en concomitance avec la MC(Cistanchedeserticola)extrait (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). La formation minéralisée de nodules a été évaluée par coloration rouge-S à l’alizarine (n = 5). (b, c) Les cellules ont été prétraitées avec SP600125 pendant 30 min ou transfectées avec un mutant JNK ou 24 h suivies d’une stimulation avec extrait de CD, et l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) et l’ALP, la protéine morphogénétique osseuse (BMP)-2 et l’expression de l’ARNm de l’ostéopontine (OPN) ont été mesurées par le kit ALP et la réaction en chaîne quantitative de la polymérase en temps réel. d) Les cellules ont été traitées avec de l’extrait de CD pour des intervalles de temps indiqués, et l’expression de p-JNK a été examinée par transfert western. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)groupe traité à l’extrait.

Inhibition de la perte osseuse par l’extrait de Cistanche deserticola chez des souris ovariectomisées

Examiner l’effet de la MC(Cistanchedeserticola)extrait sur la perte osseuse, l’ostéoporose a été induite chez les souris femelles par ovariectomie. Comme prévu, les souris ovariectomisées présentaient une diminution de la densité minérale osseuse totale du corps et de la teneur en minéraux osseux (figures 6a et 6b). Traitement avec CD(Cistanchedeserticola)pendant quatre semaines, a inhibé la perte de densité minérale osseuse et de teneur en minéraux osseux d’une manière dose-dépendante (figure 6a et 6b). Les concentrations sanguines d’ALP peuvent refléter l’activité ostéoblastique. [29] Comme le montre la figure 6c, CD(Cistanchedeserticola)extrait a inhibé la diminution de l’activité ALP sérique induite par l’ovariectomie. En outre, CD(Cistanchedeserticola)extrait a également augmenté le niveau d’ostéocalcine, un marqueur deosformation, et réduit le niveau de télopeptides C-terminal de collagène de type I, un marqueur de la résorption osseuse (figure 6d et 6e). Ces résultats soutiennent donc la puissance et l’efficacité de la MC(Cistanchedeserticola)extrait dans la prévention de la perte osseuse in vivo.

Figure 6 Inhibition de l’ovariectomie induite par la diminution de la densité minérale osseuse et de la teneur en minéraux osseux parCistanchedeserticola(CD) extrait. Les souris ICR femelles ont subi une opération simulée ou ont été ovariectomisées. Les souris ovariectomisées ont été traitées avec les concentrations indiquées de MC(Cistanchedeserticola)extrait par alimentation orale. La densité minérale osseuse totale du corps (a), la teneur en minéraux osseux (b), l’activité sérique de la phosphatase alcaline (ALP) (c), l’ostéocalcine sérique (d) et les télopeptides sériques C-terminals de collagène de type I (e) ont été déterminés quatre semaines après la chirurgie. Les données sont présentées sous forme de SE moyenne, n = 8–10 souris/groupe. *P< 0.05,="" compared="" with="" sham;="" #p="">< 0.05,="" compared="" with="" ovariectomized="">

DISCUSSION

Cliquez ici pour plus d’informations sur la partie II (Discussion et conclusion) de cet article.

De : 'Cistanchedeserticolal’extrait augmenteosformationdans les ostéoblastes' parTe-Mao Li^unet coll.

---© 2012 Les auteurs. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Journal de pharmacie et de pharmacologie,64, p. 897 à 907