Les avantages de l'actéoside - traiter le glioblastome

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TAE WOONG HWANG;DONG HUN KIM; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA‑JIN KIM

1. Introduction

Glioblastomeest le type le plus courant de tumeur cérébrale primaire maligne et la tumeur cérébrale primaire la plus invasive et la plus dévastatrice (1,2), avec un taux de survie médian d'environ 18 mois avec une thérapie multimodale agressive. Les décisions de traitement actuelles sont limitées et comprennent la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie en association avec l'agent alkylant témozolomide (TMZ) (3,4). Malgré la disponibilité de thérapies agressives, les patients atteints deglioblastomegénéralement de mauvais pronostic (5). Le TMZ est le principal agent chimiothérapeutique utilisé dans le traitement clinique des affections malignes.glioblastome(6‑8); en tant qu'agent alkylant de la série, il est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique (9‑11). Au cours de la progression du glioblastome malin et de l'invasion étendue dans tout le cerveau, l'augmentation constante de la résistance aux médicaments contre le TMZ diminue son efficacité thérapeutique (12,13). En conséquence, de nouveaux médicaments thérapeutiques pour contrerglioblastomesont recherchés de toute urgence.

Des études antérieures ont rapporté que les cellules de gliome subissent une mort cellulaire par autophagie, ou mort cellulaire programmée de type II, en réponse au TMZ (14,15). L'autophagie peut être inhibée par la 3‑méthyladénine (3‑MA) par la conversion de la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3)‑I en LC3‑II, réduisant ainsiglioblastomemort cellulaire (16,17); cependant, le rôle de l'autophagie dépend du contexte cellulaire. À l'exception d'un rôle cytotoxique lors de l'action du TMZ, l'induction de l'autophagie par le stress cellulaire est un processus cytoprotecteur qui élimine les agrégats cytoplasmiques, les organites et les macromolécules induits par le stress dans les cellules de mammifères via le système lysosomal. À leur tour, les cellules impliquées dans le maintien de l'homéostasie reçoivent de l'énergie par le biais de ces processus cataboliques (18,19). Les rôles complexes de l'autophagie suggèrent qu'un activateur de l'autophagie peut avoir des effets anticancéreux en combinaison avec le traitement TMZ en induisantglioblastomel'autophagie cellulaire sans exercer d'effets délétères ni apporter de bénéfices aux tissus normaux. Il convient de noter que le TMZ a présenté des effets thérapeutiques synergiques en association avec la vitamine D, notamment une viabilité cellulaire supprimée et une autophagie améliorée chezglioblastomecellules. De plus, il a été démontré que la combinaison de TMZ et de vitamine D exerce des effets anticancéreux in vivo, notamment une réduction de la taille de la tumeur et un taux de survie prolongé. Ces études suggèrent que le traitement combiné peut avoir des effets anticancéreux synergiques via des mécanismes autophagiques dans les médicaments à base de TMZ.glioblastomethérapie (15).

Actéosideest un glycoside phényléthanoïde largement distribué dans plusieurs plantes médicinales traditionnelles chinoises tonifiantes (20,21). Un certain nombre d'actions pharmacologiques, notamment des actions antioxydantes, anticancéreuses, anti‑inflammatoires, antinéphritiques et antimétastatiques, ont été associées àactéoside(22‑24). Des études antérieures ont démontré queactéosidea des effets protecteurs contre les lésions hépatiques induites par le tétrachlorure de carbone et la D-galactosamine. Les mécanismes sous-jacents aux effets protecteurs de l'actéoside sont probablement liés à sa capacité à inhiber la bioactivation médiée par le P450 et les effets de piégeage des radicaux libres induits par l'exposition au tétrachlorure de carbone (25,26).

Par conséquent, les preuves suggèrent que les deuxactéosideet TMZ induisent des effets anticancéreux par la mort cellulaire. Cependant, leur association et leurs effets anticancéreux dans le cadre deglioblastomerestent à élucider. Par conséquent, l'objectif de la présente étude était de vérifier les effets anticancéreux synergiques deactéosidecombiné avec TMZ dansglioblastomethérapie. Un test de viabilité cellulaire a été réalisé pour analyser les effets anticancéreux du traitement combiné en C6glioblastomecellules (un ratglioblastomelignée cellulaire), et les résultats ont été comparés à ceux obtenus après un traitement au TMZ seul. Examiner plus avant le mécanisme de la mort cellulaire causée par le cotraitement avecactéosideet TMZ, l'apoptose et les gènes liés à l'autophagie dans les cellules C6 ont été examinés.

Actéoside anti-tumoral

2. Matériels et méthodes

Culture de cellules:

Le rat C6glioblastomela lignée cellulaire a été achetée auprès de l'American Type Culture Collection (Rockville, MD, États-Unis). Les cellules ont été cultivées dans des conditions stériles à 37 °C dans un environnement humide avec 5 % de CO2 dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % d'antibiotiques et d'antimycotiques (tous Welgene, Daegu , Corée).

Matériel végétal:

Abeliophyllum distichum Nakai [voucher no. Park1001(ANH)] a été collecté dans le parc à thème Misun‑hyang, Seongbul‑Mountain Recreation Forest, Corée.

Induction de callosités :

Pour induire la formation de cals (27), des explants de feuilles de 1 cm2 ont été isolés des plantes fraîches. L'expiant a été cultivé sur milieu de Murachige et Skoog (saccharose à 4 %, gélose 0,9 % additionnée de 1 mg/l d'acide naphtalène acétique et de 1 mg/l d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique, pH 5,7) à 25˚C. Le cal a été induit 20 jours plus tard. Une quantité suffisante deactéosidea été obtenu par sous-culture pour séparer et purifieractéosidedu cal (Fig. 1). Différents lots de produits purifiésactéosideont été utilisés dans chaque expérience. Chaque expérience a été réalisée trois fois en utilisant un lot différent.

Isolement et purification :

Les fractions d'acétate d'éthyle ont été concentrées sous vide et utilisées comme échantillon pour la purification de l'actéoside.Actéosidea été isolé et purifié par le système d'isolement chromatographique accéléré (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Suède) à l'aide des cartouches SNAP KPHOSPHO‑SIL et SNAP Ultra (Biotage). Laactéosidepurifié à partir du cal a été analysé quantitativement à l'aide de l'actéoside standard par analyse HPLC-PDA. Enfin, l'actéoside d'une pureté supérieure ou égale à 95 % a été obtenu à partir du cal et utilisé comme échantillon pour la chimiothérapie à base de témozolomide.glioblastome.

Dosage du bromure de 3‑(4,5‑diméthylthiazol‑2‑l)‑,5‑diphényltétrazolium (MTT) :

Pour identifier la concentration inhibitrice semi-maximale de TMZ (valeur IC50) contre les cellules C6, 1x104 cellules dans des suspensions unicellulaires ont été ensemencées dans des puits individuels de plaques à 96 puits et incubées pendant 24 h à 37 ° C avant le traitement TMZ à la température indiquée. concentrations (1, 5, 10 et 20 mM) à 37 °C pendant 24 h. Suite à la détermination de la valeur TMZ IC50 à 5 mm, les cellules ont été traitées pendant 24 h avec 5 mM TMZ, 50 µMactéoside, ou une combinaison des deux (5 mM TMZ et 50 µMactéoside). Une solution de MTT (5 mg/ml) a été ajoutée à chaque puits (10 µl) et cultivée à 37 °C pendant 2 h. Ensuite, le milieu a été retiré et du DMSO a été ajouté à un volume de 200 µl chacun et mis à réagir à température ambiante pendant 30 min. L'absorbance à 595 nm a été mesurée pour déterminer la viabilité cellulaire.

Test de cicatrisation :

Une suspension de cellules C6 dans 1 ml a été cultivée dans une plaque à 12 puits et cultivée jusqu'à confluence. Les cellules ont été traitées avec TMZ,actéoside, ou TMZ plusactéosidepuis gratté avec une pointe de pipette stérile de 10-µl pour créer une plaie artificielle. À 0 et 24 h après la blessure, des images numériques du processus de cicatrisation ont été capturées à l'aide d'un microscope inversé. La migration cellulaire a été quantifiée en mesurant la taille de la cicatrice à 0 et 24 h à l'aide du logiciel d'analyse d'images ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 (NIH, Bethesda, Maryland, USA). Chaque expérience a été réalisée trois fois et les mesures ont été réalisées en triple.

Immunoblot :

Les cellules C6 ont été traitées avec TMZ,actéoside, ou TMZ plusactéosidependant 24h. Les cellules ont été lysées sur de la glace par le tampon de lyse RIPA (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 1 % de Nonidet P-40, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (Roche, Bâle, Suisse) pendant 30 min. Après centrifugation à 18 341 xg pendant 15 min à 4 °C, le surnageant a été obtenu. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide de Bradford Protein Assays (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Des quantités égales de protéines totales (30 µg) ont été chargées dans des puits uniques et fractionnées par électrophorèse via un SDS-PAGE à 10-15 %. Les protéines ont été électrotransférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (EMD Millipore, Bedford, MA, USA). Après incubation dans une solution de blocage contenant 5 % de lait écrémé dans une solution saline tampon Tween/Tris pendant 30 min à température ambiante. Les transferts ont été sondés avec des anticorps primaires dilués 1:1,000 (cat. n° 9662, caspase 3 ; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, États-Unis), B0‑cell lymphoma 2 (sc‑ 7382, Bcl‑2), Bcl‑2‑associated X protein (cat. n° 2772, Bax), phosphorylated (p‑)p53 (sc‑101762), total‑p53 (sc‑6243), ‑actin (cat. no. 2772, Bax). n° 4970 ; tous ; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, États-Unis), LC‑3 (L8918, Sigma ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne), Rab7 (n° cat. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (n° cat. 114), p‑p38 (n° cat. 9211), total‑p38 (n° cat. 9212), p‑c‑Jun N‑terminal kinase (n° cat. 9251, p ‑JNK), total‑JNK (réf. 9252), p‑extracellular signal‑regulated kinase (réf. 9101, p‑ERK), total‑ERK (réf. 9102 ; tous Cell Signaling Technology, Inc .) pendant une nuit à 4˚C. Cela a été suivi d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1:2,000 ; LF‑SA8001A, Goat Anti‑Mouse IgG‑HRP) ou LF‑SA8002A (Goat Anti‑Rabbit IgG‑HRP), AB Frontier, Séoul, Corée.) pendant 2 h à température ambiante. Les protéines ont ensuite été visualisées par exposition à Chemi-Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, cA, USA).

Coloration par immunofluorescence :

La protéine membranaire associée au lysosomal 1 (LAMP1) et LC3 sont des marqueurs de la lysosomale et de l'autophagie. Les cellules (1x105 cellules/puits) ont été préparées sur des lamelles en verre stérilisées (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) en triple exemplaire. Suite au traitement par TMZ,actéoside, ou TMZ plusactéosidependant 24 h, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, bloquées avec du sérum de poulet normal à 5 % (S‑3000 ; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Californie, États-Unis), 0,1 % de Triton X -100 puis incubé 1 h pour la perméabilisation et pour bloquer les interactions protéine-protéine non spécifiques. Les cellules ont ensuite été incubées avec l'anti‑LAMP1 (1:200 ; sc‑19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) et l'anti‑LC3 (1:400 ; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) pendant une nuit à 4 °C. C Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS et incubées pendant 2 h supplémentaires dans l'obscurité avec un mélange d'anticorps secondaires Alexa Fluor 488 et 594 (1:200 ; Alexa Fluor 488 (A‑11008) et 594 (A‑11007), Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) et lavé à nouveau avec du PBS. Les noyaux ont été colorés à l'aide de 4,6-diamidino-2-phénylindole (Sigma ; Merck KGaA), puis lavés deux fois avec du PBS. Les lames ont ensuite été montées et les images ont été capturées sous un microscope confocal laser LSM‑700.

Figure 1. Structure chimique de l'actéoside.

Cytométrie en flux.

Les cellules ont été analysées pour Mitotracker Green et MitoSOX par cytométrie en flux à l'aide d'un cytomètre en flux FACSCanto II, comme indiqué par le fabricant (BD Biosciences). Après deux lavages avec du PBS, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante et perméabilisées avec du Triton X‑100 à 0,25 % dans du PBS pendant 20 min. Les cellules ont été colorées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C (1: 200) puis avec des anticorps secondaires pendant 1 h sur de la glace. Après deux lavages avec du PBS, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % et dosées immédiatement. Les données de cytométrie en flux ont été collectées à l'aide de 10,000 cellules et ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Analyses statistiques:

Toutes les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism 5.0 et sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. Les données ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle avec le test post hoc de comparaisons multiples de Tukey pour la comparaison des valeurs moyennes entre plusieurs groupes. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside : Anti-apoptose

3. Résultats

3.1 Cotraitement avec TMZ et actéoside supprimeglioblastomeprolifération et migration cellulaires.

Traitement combiné avec TMZ etactéosideinhibe la viabilité des cellules C6. Le TMZ a réduit la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante (Fig. 2A), alors que l'actéoside seul n'a eu aucun effet significatif à aucun niveau de traitement (Fig. 2B). Après incubation dans un milieu de culture contenant du TMZ avec ou sans actéoside pendant 24 h, un test MTT a été réalisé pour comparer les cytotoxicités des différents niveaux de traitement. Le TMZ a supprimé de manière significative la viabilité cellulaire, tandis que l'actéoside n'a pas supprimé de manière significative la croissance cellulaire. Le traitement combiné avec TMZ et actéoside a nettement réduit la viabilité cellulaire (Fig. 2C). Le traitement par TMZ ou actéoside appliqué seul a réduit la capacité de cicatrisation (Fig. 3A). La distance de la plaie (pourcentage) a été mesurée à l'aide des résultats présentés sur la figure 3A avec le logiciel ImageJ. La distance de la plaie a augmenté de manière significative après le traitement combiné (Fig. 3B), par rapport à l'un ou l'autre des traitements individuels. Ces résultats indiquent que le cotraitement avec le TMZ et l'actéoside était un inhibiteur efficace deglioblastomeprolifération et migration cellulaires.

3.2 L'actéoside et le TMZ affectent l'apoptose de manière synergique dans les cellules C6.

Les résultats de l'analyse Western blot ont révélé que les niveaux de caspase‑3 clivée, de Bax et de p53 phosphorylée étaient plus élevés et que les niveaux de Bcl‑2 étaient plus faibles après un traitement combiné avec TMZ etactéosideque suite à un traitement avec TMZ seul (Fig. 4A).ActéosideLa fonction mitochondriale médiée par la TMZ et la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui sont des médiateurs clés de la signalisation apoptotique, ont ensuite été observées dans les cellules C6 traitées au TMZ. Pour vérifier la masse mitochondriale, une analyse de tri cellulaire activée par fluorescence a été effectuée à l'aide de MitoTracker Green. Cotraitement avec TMZ etactéosidea entraîné une masse mitochondriale plus élevée que le traitement avec TMZ seul (Fig. 4B). La génération de ROS était significativement plus élevée après un co-traitement avec TMZ et actéoside qu'avec un traitement avec TMZ seul (Fig. 4C). Ces résultats suggèrent que la génération de ROS et la fonction mitochondriale sont importantes dans l'apoptose induite par le traitement avec TMZ plus actéoside. Le cotraitement avec le TMZ et l'actéoside induit l'autophagie dans les cellules C6. Il a été rapporté que le TMZ induisait l'autophagie (28,29) ; par conséquent, la présente étude a examiné dans quelle mesure l'autophagie était induite par le traitement TMZ plus actéoside. Les cellules C6 ont été traitées avec du TMZ avec ou sans actéoside ; après 24 h, et les cellules ont été colorées pour l'immunofluorescence afin de détecter LAMP1 et LC3 comme marqueurs de l'autophagie. Des niveaux d'expression plus élevés de LAMP1 et LC3 ont été observés après le traitement combiné (Fig. 5A). L'expression des protéines liées à l'autophagie a également été examinée et il a été constaté que TMZ induisait la conversion de LC3-I en LC3-II, qui est une signature de la génération d'autophagosomes. Un taux de conversion plus élevé de LC3‑I en LC3‑II a été observé après un cotraitement avec TMZ et actéoside qu'avec un traitement avec TMZ seul. Les niveaux d'expression de Rab7 et p62 indiquaient une induction d'autophagie dans les cellules traitées au TMZ (Fig. 5B). Ces résultats suggèrent que le cotraitement avec le TMZ et l'actéoside a amélioré le processus autophagique chezglioblastomecellules.

3.3 L'actéoside induit l'expression du gène de la voie MAPK dans le traitement à base de TMZ.

Des études antérieures ont démontré que TMZ régule la voie MAPK, y compris p38, JNK et ERK (30). Par conséquent, la présente étude a examiné siactéosideaffecte l'expression du gène MAPK lié à TMZ. Les cellules C6 ont été traitées avec du TMZ avec ou sansactéoside. Après 24 h, le traitement au TMZ a entraîné des niveaux d'expression plus élevés de p‑p38, p‑JNK et p‑ERK. L'expression des gènes régulés par le TMZ était significativement plus élevée après le traitement au TMZ plus l'actéoside qu'au traitement au TMZ seul (Fig. 6). Ces observations suggèrent queactéosideaffecte les mécanismes thérapeutiques basés sur TMZ via la voie MAPK.

Actéoside anti-glioblastome

Discussion

Les résultats de la présente étude établissent que le traitement combiné avec TMZ avecactéosideoffre un potentiel thérapeutique pourglioblastometraitement, et fournir la preuve que la chimiosensibilisation à une combinaison de TMZ etactéosidepeut se produire par l'amélioration de l'autophagie. Comme la mutation deglioblastomeles cellules peuvent conduire à l'inactivation de la voie apoptotique, l'induction de l'autophagie par TMZ plusactéosidele cotraitement peut représenter une méthode alternative pourglioblastomethérapie. Cependant, que l'autophagie soit le seul mécanisme deglioblastomethérapie avec TMZ plusactéosideco-traitement reste à élucider.

L'autophagie est un mécanisme cellulaire essentiel à la dégradation des protéines et des organites cytoplasmiques. L'avantage catabolique de l'autophagie induite peut être important dans des conditions stressantes ; par conséquent, l'induction de l'autophagie peut être un mécanisme adaptatif de prévention de la mort cellulaire (31‑33). Des études antérieures ont rapporté qu'une autophagie réduite est corrélée au cancer (34‑36). De plus, plusieurs protéines et voies de signalisation associées à l'autophagie sont dérégulées lors de la transformation maligne, entraînant une réduction de l'activité autophagique. Des niveaux d'expression élevés de LC3 ont également été associés à des taux de survie accrus chez les patients atteints deglioblastomeavec de mauvais scores de performance (37,38). De même, les résultats de la présente étude indiquent que la restauration de l'autophagie normale peut être une stratégie latente pourglioblastomethérapie, et peut servir de mécanisme pour la restriction de la croissance anormale des cellules tumorales.

Dans l'autophagie normale, des composants cytoplasmiques particuliers sont isolés dans les autophagosomes qui fusionnent ensuite avec un lysosome pour être dégradés et recyclés (39,40). Lorsque l'autophagie est régulée positivement, les taux de formation d'autophagosomes dépassent les taux de dégradation lysosomale ; cette condition est appelée stress autophagique. Si le stress ou l'autophagie anormale se poursuit, la mort cellulaire peut survenir par épuisement énergétique ou par modification de l'équilibre beclin-1/Bcl-2. L'apoptose peut également être déclenchée par une hyperactivité des autophagosomes, engloutissant les organites cytoplasmiques, y compris les mitochondries ou le réticulum endoplasmique (41). Il a été suggéré que l'autophagie générale peut induire la mort cellulaire lors du renouvellement normal du cytoplasme et des organites dans les cellules saines. Dans ce processus, la cellule se « cannibalise » de l'intérieur, une caractéristique clé de la mort cellulaire programmée de type II. Bien que les mécanismes par lesquelsactéosideaméliore l'effet thérapeutique de TMZ-baséglioblastomereste à élucider complètement, les effets anticancéreux présentés par le traitement combiné examiné dans la présente étude peuvent être associés à ces mécanismes autophagiques.

Actéosideest un glycoside phényléthanoïde dérivé de plantes (22,26). Des études antérieures ont rendu compte des diverses activités biologiques de l'actéoside. Les changements dans les niveaux d'expression de la caspase-3 clivée et de la LC3 dans la présente étude démontrent que le traitement avec une combinaison de TMZ etactéosideinduit l'apoptose et l'autophagie dans les cellules C6 (Figs. 4 et 5). Il a été démontré que le traitement combiné a un effet synergique surglioblastomecellules. Bien que d'autres mécanismes possibles de ces effets synergiques restent à élucider, la présente étude a identifié l'induction de l'autophagie comme un mécanisme tumoricide crucial deactéosidechimiosensibilisation au cours du TMZglioblastomethérapie.

Les actéosides traitent le glioblastome

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