Coagulation, récepteurs activés par la protéase et maladie rénale diabétique : leçons tirées des souris déficientes en ENOS

Oxyde nitrique synthase endothéliale(eNOS) est connu pour exacerber la progression et le pronostic demaladie rénale diabétique(DKD). L’un des mécanismes permettant d’y parvenir est que de faibles niveaux d’eNOS sont associés à une hypercoagulabilité, qui favorise les lésions rénales. Dans la cascade extrinsèque de la coagulation, le facteur tissulaire (facteur III) et les facteurs de coagulation en aval, tels que le facteur X actif (FXa), exacerbent l'inflammation par l'activation des récepteurs activés par la protéase (PAR). Récemment, il a été démontré que l’absence ou la réduction de l’expression d’eNOS chez des souris diabétiques, en tant que modèle de DKD avancée, augmente les niveaux de facteurs du tissu rénal et l’expression de PAR1 et 2 dans leurs reins. De plus, l'inhibition pharmaceutique ou la suppression génétique des facteurs de coagulation ou PARinflammation amélioréedans DKD chez des souris dépourvues d'eNOS. Dans cette revue, nous résumons la relation entre l'eNOS, la coagulation et les PAR et proposons une nouvelle option thérapeutique pour la prise en charge des patients atteints de DKD.

Mots clés:glomérulosclérose diabétique ; facteur Xa ;inflammation; facteur tissulaire

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Introduction

Le nombre de patients avecmaladie rénale diabétique(DKD) est en augmentation dans le monde entier (de Boer et al. 2011 ; Kainz et al. 2015 ; Ogurtsova et al. 2017). La DKD est l'une des principales causes de mortalité chez les patients présentant des complications diabétiques (Afkarian et al. 2013). De plus, la DKD est progressive et constitue la principale cause d'insuffisance rénale terminale nécessitant un traitement de remplacement rénal (Gregg et al. 2014 ; Liyanage et al. 2015). Au Japon, la néphropathie diabétique représente plus de 39 % des nouveaux patients dialysés (Nitta et al. 2020). Par conséquent, le développement denouvelle thérapeutiqueDes options sont nécessaires pour gérer les patients atteints de DKD.

système dans la pathogenèse de la DKD. L'hypercoagulabilité est associée à la DKD (Goldberg 2009 ; Domingueti et al. 2016). Il a été démontré qu'un taux élevé de fibrinogène dans le sang était associé à un faible taux de filtration glomérulaire estimé, à une protéinurie élevée et à des lésions histologiques graves, et qu'il était un prédicteur de la progression vers une insuffisance rénale terminale (Dalla Vestra et al. 2005 ; Pan et coll. 2018 ; Zhang et coll. 2018). Certaines études ont montré une corrélation entre le niveau de D-dimères, un produit de dégradation de la fibrine, et le dysfonctionnement rénal dans la DKD (Domingueti et al. 2018 ; Pan et al. 2018). L'hypercoagulabilité dans la DKD est probablement déterminée par plusieurs facteurs. Par exemple, le système rénine-angiotensine-aldostérone active le facteur tissulaire (TF, facteur III) et augmente les événements thrombotiques (Dielis et al. 2005). Sinon, l'hyperglycémie, la dyslipidémie, l'inflammation ou le dysfonctionnement endothélial sont impliqués dans l'état pro-thrombotique dans le cadre de la pathogenèse de la DKD (Goldberg 2009).

Un dysfonctionnement endothélial est présent dans la DKD qui évolue vers des complications microvasculaires (Goldberg 2009 ; Nakagawa et al. 2011). Une production altérée de l'oxyde nitrique synthase endothélial (eNOS) ou une activité réduite de l'eNOS (par exemple, une phosphorylation altérée de l'eNOS) est une caractéristique du dysfonctionnement endothélial dans la DKD (Nakagawa et al. 2011 ; Cheng et al. 2012). Nous avons montré qu'une perte d'expression d'eNOS était liée à l'élévation du taux de TF et à l'activité extrinsèque du système de coagulation (Li et al. 2010 ; Wang et al. 2011a), qui est étroitement associée aux événements thrombotiques chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique. maladies (Kolachalama et al. 2018).

En plus du risque élevé d'événements thrombotiques, les protéases de la coagulation, telles que le facteur actif FVII (FVIIa), le facteur actif (FXa) et la thrombine, qui sont présentes dans la cascade extrinsèque de la coagulation, induisent une lésion tissulaire via un récepteur activé par la protéase ( Mécanisme dépendant du PAR) (Madhusudhan et al. 2016 ; Posma et al. 2019). Dans cette revue, nous résumons les résultats obtenus chez des souris diabétiques dépourvues d'eNOS et discutons de la relation entre la voie de coagulation-PAR, les niveaux d'eNOS etPathogénie de la DKD.

Voie des récepteurs activés par le facteur tissulaire et la protéase

Le facteur tissulaire (TF), connu sous le nom de facteur III, est une protéine transmembranaire de 47 kDa qui interagit avec le facteur VII (FVII) (Grover et Mackman 2018). Le complexe TF/FVIIa est un activateur de la cascade extrinsèque de la coagulation et catalyse l'activation du FX et du FIX. Le FXa et le cofacteur V activé (FVa) forment un complexe prothrombotique qui génère de la thrombine. Enfin, la thrombine convertit le fibrinogène en fibrine, entraînant la formation de thrombus (Grover et Mackman 2018). Le TF est exprimé à la fois dans les cellules musculaires lisses vasculaires et dans les fibroblastes adventices. Dans des conditions inflammatoires, son expression est induite dans les cellules endothéliales ou les cellules circulantes telles que les monocytes (Østerud et Bjørklid 2006).

Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont membres de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G, comprenant quatre protéines PAR (PAR1-4). Les PAR subissent un clivage par des protéases à l'extrémité N-terminale et sont activés lors de la liaison à une nouvelle extrémité N-terminale contenant un ligand attaché. Les quatre membres des PAR (PAR1-4) sont activés par des protéases de coagulation spécifiques : le complexe TF et FVIIa active PAR2, le facteur Xa active à la fois PAR1 et PAR2, et la thrombine active PAR1, PAR3 et PAR4 (Camerer et al. 2000 ; Coughlin 2005 ; Rothmeier et Ruf 2012 ; Zhao et al. 2014). La relation entre le TF, les protéases de la coagulation et les PAR est présentée sur la figure 1.

On sait que les PAR sont largement exprimés dans les cellules rénales et sont impliqués dans la physiopathologie des lésions rénales. PAR1 et PAR2 sont tous deux exprimés dans les cellules endothéliales glomérulaires, les cellules mésangiales et les cellules tubulaires rénales dérivées de l'homme ou de la souris ; PAR2, PAR3 et PAR4 sont exprimés dans les podocytes humains ; PAR1, PAR3 et PAR4 sont exprimés dans les podocytes murins (Tanaka et al. 2005 ; Vesey et al. 2005 ; Madhusudhan et al. 2012 ; Dong et al. 2015 ; Madhusudhan et al. 2016).

Bien que les effets nocifs ou protecteurs des PAR danslésion rénaleont été démontrés, les données accumulées suggèrent que les PAR exacerbent l'inflammation en stimulant la production de cytokines et de chimiokines (Rothmeier et Ruf 2012 ; Isermann 2017 ; Posma et al. 2019). Conformément à cette découverte, les agonistes de PAR1 et PAR2 favorisent l'expression de médiateurs inflammatoires, tels que la protéine chimiotactique 1 des monocytes (MCP1) et l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène-1 (PAI-1), ainsi que des molécules pro-fibrotiques dans les cellules endothéliales. , cellules mésangiales et tubulaires rénales (Vesey et al. 2005; Vesey et al. 2013; Ellinghaus et al. 2016; Waasdorp et al. 2016; Oe et al. 2019). Dans les études in vivo, l’absence de PAR1 ou la présence d’inhibiteurs de PAR1 ont réduit l’inflammation dans les modèles de glomérulonéphrite en croissant ou de lésion rénale obstructive (Cunningham et al. 2000 ; Waasdorp et al. 2019 ; Lok et al. 2020). De même, les effets thérapeutiques de l’inhibition de PAR2 dans les lésions rénales s’accompagnaient deinflammation réduitedans les reins (Hayashi et al. 2016 ; Du et al. 2017 ; Han et al. 2019 ; Watanabe et al. 2019).

Polymorphismes endothéliaux de l'oxyde nitrique synthase dans la DKD

Oxyde nitrique synthase endothéliale(eNOS) est l'une des trois isoformes de NOS et contribue à la production de NO dans l'endothélium vasculaire (Walford et Loscalzo 2003). Le NO produit par eNOS dans l'endothélium vasculaire joue un rôle crucial dans la régulation de la relaxation vasculaire, l'anti-inflammation et la prévention de la formation de thrombus (Walford et Loscalzo 2003). Une expression altérée de l’eNOS est associée au développement du DKD. Des méta-analyses récemment menées sur des humains ont révélé que G894T (rs1799983), C-786T (rs2070744) et l'intron 4b/4a ​​(rs869109213) dans les gènes eNOS (NOS3) sont étroitement associés au développement du DKD (Dellamea et al. 2014 ; Zhang et al. 2015 ; Dong et al. 2018). Parmi ces variantes, le rôle du polymorphisme G894T (Glu298Asp) dans la fonction eNOS a été bien caractérisé. La production réduite de NO ou l'accumulation de nitrite a été indiquée dans les cellules CHO transfectées avec 298Asp par rapport à celles avec 298Glu (Noiri et al. 2002). Collectivement, ces résultats indiquent que la production réduite de NO due au dysfonctionnement de l'eNOS est importante pour la progression de la DKD chez l'homme.

Souris diabétiques dépourvues d'eNOS comme modèle de néphropathie diabétique humaine

L’établissement de modèles précliniques fiables ressemblant à la DKD humaine est essentiel pour l’étude de nouvelles options thérapeutiques. Sur la base des preuves montrant une association entre le polymorphisme eNOS et la DKD, un certain nombre d'études ont démontré que les modèles knock-out eNOS du diabète de type I et de type II font partie des modèles réussis imitant la DKD humaine (Brosius et al. 2009 ; Azushima et al.2018). Il a été démontré que les souris diabétiques induites par la streptozotocine et dépourvues d'eNOS développent une albuminurie sévère, une expansion mésangiale, un épaississement de la membrane basale glomérulaire et une hyalinose artériolaire, ressemblant à la DKD humaine (Nakagawa et al. 2007). De même, les souris diabétiques de type II (db/db) dépourvues d'eNOS présentaient une glomérulosclérose et une albuminurie sévères (Zhao et al. 2006).

TF élevé chez les souris diabétiques dépourvues d'eNOS

Le NO inhibe la formation de thrombus et l'agrégation plaquettaire (Walford et Loscalzo 2003). Étant donné que la formation de thrombus glomérulaire a été observée chez des souris diabétiques dépourvues d'eNOS (Nakagawa et al. 2007), une expression altérée de l'eNOS est probablement associée à l'augmentation de la coagulation dépendante du TF. L'association entre eNOS et TF dans DKD a été abordée dans nos rapports précédents (Li et al. 2010 ; Wang et al. 2011a ; Oe et al. 2016) (Fig. 2).

Une expression réduite ou absente de l'eNOS augmente l'activité rénale du TF chez les souris Akita diabétiques. Nous avons caractérisé l'expression du TF chez des souris Akita diabétiques (Ins2Akita/+), un modèle de diabète de type I, avec différents niveaux d'expression de l'eNOS (eNOS+/+, eNOS+/- , et eNOS-/-) (Wang et al. 2011a). Nous avons constaté que la gravité de la DKD était associée à une expression réduite de l'eNOS. L'excrétion urinaire d'albumine, la glomérulosclérose et la réduction du débit de filtration glomérulaire ont été exacerbées dans l'ordre suivant : eNOS+/+ ; Ins2Akita/+ < eNOS+/- ; Ins2Akita/+ < eNOS-/-; Ins2Akita/+. Il est intéressant de noter que l’expression et l’activité du TF rénal ont augmenté dans eNOS+/- ; Ins2Akita/+ et eNOS-/- ; Souris Ins2Akita/+ comparées à celles de eNOS+/+ ; Souris Ins2Akita/+. Le dépôt de fibrine glomérulaire était également remarquable dans eNOS+/- ; Ins2 Akita/+ et eNOS-/- ; Ins2 Akita/+ souris. De plus, l’expression rénale de l’ARNm de Tf était corrélée à la gravité de la maladie, à l’excrétion urinaire d’albumine etinflammatoire rénaleexpression des cytokines.

Un régime riche en graisses et le manque d’eNOS augmentent de manière synergique le TF chez les souris diabétiques

De nombreuses études ont démontré un lien entre l'obésité et la thrombose (Samad et Ruf 2013). Par exemple, la régulation positive de la voie TLR4-NF-kB dans des conditions de maladie métabolique augmente les niveaux de TF (Lv et al. 2009 ; Owens et al. 2012 ; Rogero et Calder 2018). De plus, le palmitate d'acide gras saturé induit la libération d'histone H3 via des mécanismes dépendants des voies ROS et JNK et des histones extracellulaires, qui augmentent l'expression du TF dans les monocytes (Shrestha et al. 2013). En se concentrant sur la relation entre la coagulation, l'eNOS et la dyslipidémie, notre étude précédente a démontré les effets combinés d'un déficit en eNOS et d'un régime riche en graisses sur l'expression du TF (Li et al. 2010). Dans l’étude, des souris eNOS-null ont été traitées avec une faible dose de STZ pour développer une DM et ont été nourries avec un régime riche en graisses. Le manque d’expression d’eNOS a augmenté l’excrétion urinaire d’albumine et les lésions histologiques, qui ont été encore exacerbées par un régime riche en graisses. L’expression et l’activité de TF ont augmenté dans les reins de souris en raison d’un manque d’expression d’eNOS et d’un régime riche en graisses de manière synergique. Fait intéressant, une augmentation du niveau de TF immunoréactif a été démontrée par des expériences de colocalisation avec un marqueur monocytes/macrophages glomérulaires.

Anticorps neutralisants contre l'inflammation du TF dans les reins diabétiques chez les souris eNOS-Knockout

Une augmentation de la coagulation dépendante du TF est associée à une inflammation accrue (Witkowski et al. 2016). Inhibition du système de coagulation dépendant du TF amélioréemaladies inflammatoires, comme la septicémie induite par le LPS (Pawlinski et al. 2010). Pour élucider le lien de causalité entre l'inflammation et le TF dans la DKD, nous avons examiné l'effet à court terme des anticorps neutralisants contre le TF sur l'inflammation des reins diabétiques chez des souris déficientes en eNOS (Li et al. 2010). Les résultats ont montré que l’administration d’anticorps anti-TF réduisait considérablement les niveaux d’expression rénale des gènes liés à l’inflammation et à la fibrose, tels que l’ARNm de Tnfa, Ccl2, Tgfb et Col4, dans les reins de souris, quatre jours après la neutralisation du TF.

L'inhibiteur de la coagulation FXa améliore les lésions rénales chez les souris diabétiques dépourvues d'eNOS

La coagulation FXa, située en aval de TF/VIIa, contribue également à l'inflammation par la voie PAR-dépendante. Son rôle dans la DKD a été démontré dans plusieurs modèles animaux. Sumi et coll. (2011) ont démontré que le fondaparinux, un inhibiteur du FXa, réduisait les taux de protéines urinaires, l'hypertrophie glomérulaire et les dépôts de fibrine chez les souris db/db. L'effet thérapeutique de l'inhibition du FXa chez les souris DKD dépourvues d'eNOS a été démontré par notre groupe (Oe et al. 2016). L'edoxaban (50 mg/kg/jour), un inhibiteur oral du FXa, a été administré à l'eNOS-/- ; Ins2Akita/+ pendant trois mois, et les résultats ont montré une amélioration des lésions histologiques, telles que la prolifération de la matrice mésangiale. Les niveaux d'expression des gènes inflammatoires dans les reins ont été réduits par l'edoxaban (Tableau 1). FXa active à la fois PAR1 et PAR2. Pour élucider le mécanisme des lésions rénales médiées par le FXa, nous avons démontré que les effets anti-inflammatoires des inhibiteurs du FXa sont similaires à ceux observés chez les souris PAR2-/- et PAR2-/- avec des inhibiteurs du FXa. . Ces résultats suggèrent que le FXa a probablement provoqué une inflammation via un mécanisme dépendant de PAR2- dans la DKD. En revanche, l'édoxaban n'a pas amélioré les lésions glomérulaires dans l'eNOS+/+ ; Ins2Akita/+, ce qui suggère que l'effet thérapeutique de l'inhibition du FXa était associé à une hypercoagulabilité dépendante de l'eNOS chez les souris diabétiques de type I.

Autres facteurs de coagulation dans la DKD

Étant donné que la thrombine cible PAR1, qui fait progresser l'inflammation vasculaire (Chen et Dorling 2009), la thrombine exacerbe probablement la DKD. Cependant, les rôles protecteurs ou nocifs de la thrombine dans la pathogenèse de la DKD ont été démontrés ; la thrombine à faible dose (50 pM) a empêché, tandis que la thrombine à forte dose (20 nM) a aggravé l'apoptose induite par le glucose dans les podocytes (Wang et al. 2011b). Les effets des inhibiteurs de la thrombine tels que le dabigatran sur les souris diabétiques dépourvues d'eNOS devraient être élucidés à l'avenir.

Le fibrinogène est impliqué dans divers états inflammatoires. Il est intéressant de noter qu’une réduction partielle ou l’absence de fibrinogène s’est avérée bénéfique pour les modèles d’ischémie-reperfusion rénale ou de fibrose rénale obstructive (Sörensen et al. 2011 ; Craciun et al. 2014). Étant donné que les dépôts de fibrine glomérulaire sont augmentés chez les souris diabétiques dépourvues d'eNOS (Nakagawa et al. 2007; Li et al. 2010; Wang et al. 2011a), l'élucidation de son rôle dans la pathogenèse de la DKD mérite des recherches plus approfondies.

Expression de PAR1 et PAR2 chez des souris diabétiques dépourvues d'eNOS

Une expression accrue des PAR est associée à des lésions rénales. Nous et d'autres avons démontré que les niveaux d'expression de l'ARNm de Par1 et/ou Par2 étaient augmentés dans des modèles animaux présentant une néphropathie diabétique, une lésion rénale induite par l'ade neuf, une fibrose rénale obstructive et une lésion rénale induite par le cisplatine (Chung et al. 2013 ; Hayashi et al. 2016 ; Oe et al. 2016 ; Watanabe et al. 2019). De plus, les niveaux de protéine glomérulaire PAR2 ont augmenté chez les souris db/db, un modèle de diabète de type II (Sumi et al. 2011). Nous avons démontré l'association entre l'expression de PAR et le déficit en eNOS chez la souris diabétique (Oe et al. 2016). Le niveau d'expression de l'ARNm Par1 était significativement plus élevé dans eNOS−/− ; Souris Ins2Akita/+ que dans eNOS−/− ; Souris Ins2Akita/+ et non-DM. De même, l'expression de Par2 était significativement plus élevée dans eNOS−/− ; Souris Ins2Akita/+ que chez les souris non-DM. En revanche, les niveaux d’ARNm Par4 ne différaient pas entre les génotypes. Un manque d'eNOS exacerbe l'inflammation dans la DKD (Wang et al. 2011a). Étant donné que les cytokines pro-inflammatoires augmenteraient les PAR (Nystedt et al. 1996), une inflammation élevée causée par un manque d'eNOS induit probablement l'expression rénale de Pars dans la DKD. Collectivement, les résultats de nos études suggèrent que les niveaux d'expression de PAR1 et PAR2, similaires à ceux du TF, étaient augmentés dans les reins diabétiques en l'absence d'eNOS (Fig. 2).

Lésions rénales diabétiques améliorées par la suppression de PAR2 chez des souris présentant une eNOS réduite

Nous et d'autres avons abordé le rôle de PAR2 dans le DKD dans des études précédentes. La suppression de Par2 n’a pas affecté les lésions glomérulaires chez les souris Akita diabétiques de type sauvage (Ins2Akita/+) avec eNOS (Oe et al. 2016). De plus, les souris diabétiques induites par STZ et dépourvues de PAR2 ont présenté une albuminurie réduite par rapport aux souris diabétiques de type sauvage, mais une expansion mésangiale accrue (Waasdorp et al. 2017). Collectivement, ces résultats démontrent qu’il n’existe aucun effet thérapeutique, voire aucun, de l’inhibition de PAR2 sur les lésions rénales dans les modèles précoces et légers de DKD. En revanche, nous avons démontré les effets du déficit en PAR2 sur la DKD chez des souris Akita diabétiques avec une expression réduite de eNOS (eNOS+/- ; Ins2Akita/+) (Oe et al. 2016). Le manque de PAR2 a réduit de manière significative les niveaux d’excrétion urinaire d’albumine, l’expansion mésangiale et l’épaisseur du GBM. Les niveaux d’expression de gènes pro-inflammatoires et liés à la fibrose, notamment Tnfa, Tgfb et Col4, ont également été réduits dans les reins de souris. Ces résultats suggèrent que PAR2 est pathogène non pas au début, mais dans les lésions glomérulaires diabétiques relativement avancées provoquées par un déficit en eNOS (Tableau 1).

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