Analyse de la composition et activités immunologiques des oligosaccharides isolés de Cistanche Deserticola

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Résumé.Un oligosaccharide (CDOS) a été obtenu à partir deCistanche désertiquepar extraction alcaline (pH{{0}}), précipitation à l'éthanol et fractionné en deux fractions purifiées (c'est-à-dire, CDOS-1 et CDOS-2) par Sephadex G-100 et chromatographie de filtration sur colonne Sephadex G-25. La composition en monosaccharides du CDOS a été dosée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Il a été constaté que le CDOS-1 n'était composé que de saccharose et que le CDOS-2 était principalement composé de saccharose, de rhamnose et de mannitol, avec un rapport molaire de 1 : 0,73 : 3,61. Des tests immunologiques ont indiqué que CDOS présentait un effet significatif sur l'indice de rate de souris, augmentant l'activité de phagocytose des macrophages et stimulant la prolifération des cellules productrices d'anticorps. On espère que le CDOS sera développé en aliment fonctionnel ou en médicament.

Mots clés:Cistanchedésertique, oligosaccharide, purification, composition, activités immunologiques.

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1. Introduction

Cistanchedeserticola YCMa. (Famille Orobanchaceae) est une petite plante parasite originaire du nord-ouest de la Chine. La plante entière séchée (sans fleurs) est connue comme tonique et s'appelle "Rou Congrong". En médecine orientale, elle est classée comme sucrée et salée au goût, de nature chaude et attributive aux voies rénales et du gros intestin, avec le fonction derevigorantlaun reinet complétant l'essence, hydratant l'intestin et relaxant les intestins [1]-[3]. L'étude pharmacologique moderne a montré qu'il pouvait stimuler la synthèse de l'ADN et retarder le processus de sénilité, augmenter l'antioxydant [4] , prévenir et traiter les maladies cardiovasculaires [3]. En outre, il pourrait également causer des effets analgésiques etanti-inflammatoire[5], améliorent l'apprentissage et la mémoire en induisant des facteurs de croissance nerveuse [6]. Certaines études ont indiqué que les extraits de C. deserticola pourraient activer la fonction phagocytaire des macrophages intra-abdominaux chez la souris [7]-[9] etaméliorer lacorps's immunité[dix]. Selon les études précédentes, cette plante contient de multiples constituants actifs qui comprennent des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes, des lignanes, des saccharides, des alcaloïdes, etc. [11] Comme le C.désertiquephényléthanoïdeglycosideset les polysaccharides sont reconnus comme les principaux composants actifs, de nombreuses études se sont concentrées sur leurs structures et leurs bioactivités au cours des dernières décennies [12]-[17]. Quant aux précieux oligosaccharides deC. deserticola, les rapports sont assez limités. Les oligosaccharides, un saccharide à chaîne courte contenant des homo- ou hétéro-sucres, sont bien connus pour leurs effets bénéfiques sur la vie humaine et sont largement utilisés depuis longtemps [18]. Les oligosaccharides fonctionnels, qui ont une fonction physiologique telle qu'une faible cariogénicité et un facteur de croissance des bifidobactéries [19], améliorent la santé des humains et des animaux. Ils ont été utilisés comme ingrédient alimentaire. Récemment, de nouvelles fonctions des oligosaccharides, qui ont la capacité de moduler le système immunitaire chez l'homme, les animaux et les poissons, ont été rapportées [20]. Dans cet article, nous rapportons la première partie des résultats du programme de recherche, le fractionnement des oligosaccharides totaux obtenus à partir de l'extrait alcalin de C. deserticola par une combinaison d'ultrafiltration et de chromatographie par perméation de gel, et l'analyse de leur composition par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). De plus, nous présentons également les activités immunologiques des oligosaccharides de C. deserticola. À notre connaissance, il existe peu de rapports publiés sur les études d'activité immunostimulatrice deC. deserticolaoligosaccharides.

2.expérimental

2.1. Matériaux

Le C. deserticola a été cultivé et collecté à Alxa League (Mongolie intérieure, Chine). Des souris Kunming (GradeII, âgées de six semaines) ont été achetées au Centre expérimental de pharmacologie de l'Université de Mongolie intérieure. Sephadex G-100, Sephadex G-25, acide trifluoroacétique (TFA), 1-phényl-3-méthyl-5- pyrazolone (PMP), D-glucose, D- galactose, D-fructose, D-xylose, D-mannose, acide D-galacturonique, acide D-glucuronique, saccharose, rhamnose, mannitol, fucose, rhamnose, ont été achetés chez Sigma (St. Louis, MO, USA). Le milieu RPMI -1640 a été acheté auprès de Gibco Invitrogen Co. (San Diego, Californie, États-Unis). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique.

2.2. Extraction d'oligosaccharides

Les corps séchés de C. deserticola ont été coupés en morceaux plus petits et ensuite broyés en poudre par un broyeur ont été extraits avec de l'éthanol anhydre (3 x 5000 ml) à 70 degrés pendant 3 h sous pression atmosphérique. Un condenseur à reflux a été fixé pour éliminer les lipides. Le résidu laissé a ensuite été extrait avec un alcali (pH=10) à 60 degrés pendant 3 fois (2h à chaque fois). Après centrifugation (2000 g pendant 15 min, à 20 degrés), le surnageant a été concentré au dixième du volume dans un évaporateur rotatif sous pression réduite à 50 degrés et filtré. Ensuite, le filtrat a été déprotéiné à l'aide du réactif Sevag [21], et décoloré avec du charbon actif.

2.3. Isolement et purification d'oligosaccharides

Les oligosaccharides bruts lyophilisés ont été dissous dans de l'eau distillée, centrifugés, puis le surnageant a été purifié par une colonne Sephadex G-100 (1 x 50 cm), équilibrée avec de l'eau ultra pure. Après chargement avec l'échantillon, la colonne a été éluée avec de l'eau ultra pure à un débit de 5 ml/min. Différentes fractions ont été recueillies à l'aide de tubes à essai. La teneur totale en glucides de chaque tube a été mesurée à 490 nm par la méthode au phénol-H2SO4 [22]. La solution éluée à l'eau a été séparée en deux fractions CDOS-1 et CDO-2. Deux fractions ont été respectivement purifiées davantage sur une colonne Sephadex G-25 (2,7 x 85 cm) en utilisant de l'eau ultrapure (à un débit de 1 ml/min). Après avoir récupéré la fraction purifiée, celle-ci a été lyophilisée.

2.4. Analyse de la composition en monosaccharides

La composition en monosaccharides des CDO a été obtenue par analyse HPLC. Les CDO (2 mg) ont d'abord été hydrolysés avec du méthanol anhydre contenant du HCl 2 M à 8 0 degrés pendant 16 h sous une atmosphère d'azote, puis avec du TFA 2 M à 120 degrés pendant 1 h. Une fois le TFA éliminé par évaporation, les hydrolysats ont ensuite été dérivés avec du PMP selon la méthode rapportée [23] et analysés par HPLC. La séparation HPLC a été réalisée sur le système HPLC EF-2002 (société KNAUER, Allemagne). Les dérivés de PMP ont été chromatographiés en utilisant un volume de Sugar-PAK (6,5 x 300 mm, Glass of Water Company, Amérique) et l'absorbance a été mesurée à 245 nm. Le volume d'injection était de 20 µL et la phase mobile, composée de PBS (solvant A) et d'acétonitrile (solvant B), a été utilisée pour l'élution isocratique au rapport volumique de 82 % (A) à 18 % (B). La durée totale de l'analyse HPLC était de 40 min et le débit était de 0,5 mL/min.

2.5. Activités immunobiologiques

2.5.1. Fonction phagocytaire des monocytes-macrophages

Soixante souris Kunming (GradeII, âgées de six semaines) ont été achetées au Centre expérimental de pharmacologie de l'Université de Mongolie intérieure et ont été acclimatées pendant 1 semaine avant utilisation. Toutes les souris ont été réparties au hasard en quatre groupes, consistant en un groupe témoin salin, un groupe à dosage élevé de CDO, un groupe à dosage modéré et un groupe à faible dosage de CDO. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'une solution d'oligosaccharides 0.5 mL une fois par jour pendant 5 jours. Le groupe à dose élevée, modérée ou faible de CDO a reçu respectivement 10{{10}}, 50 ou 25 mg/kg/PC de CDO ; et 0,5 ml de solution saline a été injecté dans le groupe témoin. Le septième jour, une expérience de clairance des particules de carbone a été réalisée, selon Hou [24], et l'indice de la rate et l'indice du thymus ont été mesurés. En bref, 0,05 mL/10 g/pc d'encre de Chine ont été injectés à chaque souris par la veine caudale, puis 20 μL de sang ont été prélevés de la veine orbitale postérieure 3 et 7 minutes après l'injection. Les échantillons de sang ont été placés dans des tubes avec 2 ml de Na2CO3 à 0,1 % et les valeurs de DO ont été mesurées à 600 nm. L'indice de clairance (K), l'indice phagocytaire ( ) et l'indice des organes immunitaires ont été calculés comme suit(1), t2 et t1 signifient 7 minutes et 3 minutes respectivement.

2.5.2. La prolifération des cellules productrices d'anticorps

Des groupes de souris Kunming (cinq par groupe) ont été immunisés par injection intrapéritonéale de 2 x 107 SRBC dans 1,0 ml de PBS additionné de 50 ug de matériel de test (aucun dans le contrôle). Une semaine plus tard, des splénocytes (106 cellules par 2 ml par puits) de souris Kunming ont été cultivés avec ou sans matériel de test pendant 72 h dans un milieu RPMI 1640 à 10 % sous 5 % de CO2 dans l'air, en triple exemplaire pour chaque culture. Le nombre de PFC contre SRBC pour 106 splénocytes a été déterminé [25], [26].

2.6. analyses statistiques

Les données ont été exprimées en valeurs moyennes ± ET. La différence entre les groupes testés et le contrôle a été analysée par le test t de Student. P < 0.05="" a="" été="" considéré="" comme="">

3. Résultats et discussion

3.1. Isolement et purification d'oligosaccharides

Les CDO ont été isolés de l'extrait alcalin des corps séchés de C. deserticola avec un rendement de 3,07 %. Deux fractions de CDOS-1 et CDOS-2 ont été isolées de l'eau distillée éluée par la colonne Sephadex G-100, respectivement (Fig.1). Les fractions purifiées de CDOS-1 et CDOS-2 ont montré un seul pic sur la colonne Sephadex G-25, indiquant qu'aucun autre oligosaccharide n'était présent dans l'échantillon. Les résultats des compositions de monosaccharides ont montré que CDOS-1 n'était composé que de saccharose (Fig.2) et CDOS-2 était principalement composé de saccharose, de rhamnose et de mannitol (Fig.3), avec un rapport molaire de 1 :0,73 :3,61.

3.2. Activités immunobiologiques des CDO

De nombreuses preuves in vivo et in vitro ont démontré que les oligosaccharides naturels affichaient une fonction immunomodulatrice en stimulant à la fois les fonctions cellulaires et humorales.immunitaire réponses[27], [28]. Dans cet article, 100 mg/kg/PC de CDO ont augmenté l'indice de la rate de la souris, mais il n'y avait aucune différence significative dans l'indice du thymus entre les groupes traités et les groupes témoins (tableau 1). Les macrophages sont un élément important des défenses de l'hôte contre l'infection virale en inhibant la réplication intracellulaire des virus et en tuant les cellules infectées par le virus [29]. Lorsqu'ils sont activés, une variété d'intermédiaires oxygénés ou azotés et de cytokines sont libérés des macrophages et participent à diverses fonctions biologiques importantes, telles que les activités anti-inflammatoires et antitumorales [30]-[32]. Par conséquent, l'activité phagocytaire des macrophages est un indicateur important des fonctions immunitaires de l'organisme. Dans cette étude, les doses modérées et élevées de CDO ont augmenté l'activité de phagocytose des macrophages (tableau 1). La prolifération cellulaire productrice d'anticorps induite par les CDO a été étudiée en examinant l'augmentation du PFC hémolytique dans la rate de souris Kunming qui ont été immunisées avec SRBC plus l'échantillon d'essai. Les résultats ont indiqué que des doses modérées et élevées de CDO améliorent significativement la prolifération des cellules productrices d'anticorps (tableau 2). Des doses élevées de CDO ont provoqué une augmentation hautement significative du nombre de PFC (P <>

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