Profilage complet des formulations de sécrétomes à partir de cellules souches fœtales et périnatales du liquide amniotique humain Partie 1

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Résumé:Nous avons précédemment signalé que les cellules souches dérivées du liquide amniotique c-KIT plus htaman obtenues à partir d'échantillons restants du diagnostic prénatal de routine Ⅱ trimestre (hAFS fœtal) sont dotées d'un potentiel paracrine régénératif entraînant des effets pro-survie, anti-fibrotiques et prolifératifs. peuvent également être isolés à partir d'échantillons de déchets cliniques du IIIe trimestre lors de césariennes programmées (hAFS périnatale), offrant ainsi une alternative plus facilement accessible par rapport au hAFS fœtal. Néanmoins, on sait peu de choses sur le profil paracrine du hAFS périnatal. Ici, nous fournissons une caractérisation détaillée du sécrétome total du hAFS (c'est-à-dire l'intégralité des facteurs paracrines solubles libérés par les cellules dans le milieu conditionné, hAFS-CM) et des vésicules extracellulaires ( hAFS-EVs) en son sein, à partir de cellules périnatales fœtales du Ⅱtrimestre par rapport au troisième trimestre. Les hAFS fœtaux et périnataux ont été caractérisés et soumis à un préconditionnement hypoxique pour améliorer leur potentiel paracrine. Les formulations hAFS-CM et hAFS-EV ont été analysées pour la teneur en protéines et en chimiokines/cytokines, et la cargaison EV a été étudiée plus en détail par séquençage d'ARN. Le phénotype du hAFS fœtal et périnatal, ainsi que leurs formulations de sécrétome correspondantes, se chevauchaient ; pourtant, le hAFS fœtal a montré une activité de phosphorylation oxydative immature par rapport aux périnataux. Le profilage de leur cargaison paracrine a révélé quelques différences selon le stade gestationnel et le préconditionnement hypoxique. Les deux sources cellulaires ont fourni des formulations enrichies en facteurs stimulants neurotrophiques, immunomodulateurs, anti-fibrotiques et endothéliaux, et le sécrétome fœtal fœtal immature a été défini par un profil pro-vasculogénique, régénératif, pro-résolution et anti-vieillissement plus prononcé. Le profilage des petits ARN a montré un enrichissement en microARN dans la cargaison hAFS-EV fœtale et périnatale, avec un noyau pro-résolution exprimé de manière stable comme signature moléculaire de référence. Ici, nous confirmons que le hAFS représente une source attrayante de facteurs paracrines régénératifs ; la sélection de formulations de sécrétomes hAFS fœtales ou périnatales pour une future thérapie paracrine doit être évaluée en tenant compte du scénario clinique spécifique.

Mots clés:liquide amniotique; cellules souches; effets paracrines; vésicules extracellulaires; milieu conditionné cellulaire; chimiokine; les cytokines ; protéomique; séquençage d'ARN ; microARN

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1. Introduction

La médecine régénérative s'est récemment développée en tant que domaine émergent pour fournir une restauration fonctionnelle des tissus lésés au moyen de plusieurs stratégies. Alors que les approches d'ingénierie tissulaire ont considérablement progressé ces dernières années, l'étude des effets paracrines des cellules souches s'est parallèlement intensifiée de plus en plus. Il a été largement démontré que le potentiel thérapeutique des cellules souches transplantées est principalement médié par leurs facteurs solubles sécrétés, qui peuvent orchestrer un microenvironnement pro-régénérateur dans le tissu hôte tout en déclenchant l'activation de mécanismes endogènes de récupération fonctionnelle [1,2]. Par conséquent, les cellules souches sécrètent l'intégralité des molécules trophiques paracrines libérées par les cellules, ainsi que les vésicules extracellulaires liées à la membrane, ont été de plus en plus proposées comme médicament thérapeutique innovant par de multiples études précliniques indépendantes ciblant les maladies cardiovasculaires, neurologiques et/ou inflammatoires. maladie. Ainsi, les cellules souches peuvent être envisagées comme des usines biologiques pour l'exploitation de leur sécrétome thérapeutique en proposant des traitements régénératifs prêts à l'emploi et prêts à l'emploi. En appliquant une telle stratégie basée sur les cellules, mais sans cellules, de nombreux aspects limitants associés à la thérapie cellulaire canonique peuvent être surmontés, tout en garantissant des effets bénéfiques.qu'est-ce qu'un cistancheDans cette perspective, les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont-elles été largement testées en tant que candidats cellulaires putatifs ? En effet, les CSM et les cellules souches/progénitrices ont été conçues et/ou stimulées par différentes stratégies de préconditionnement pour améliorer leur capacité de régénération et leur potentiel de sécrétion [3,4] avec un intérêt explicite pour la pertinence biologique de leurs vésicules extracellulaires sécrétées (VE).

Les VE sont des nanoparticules délimitées par une bicouche lipidique et activement sécrétées par tous les types cellulaires. Les véhicules électriques incluent de très petites (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); ils fonctionnent comme des transporteurs biologiques critiques de la signalisation intercellulaire en délivrant leur cargaison moléculaire d'une cellule parentale à une cellule répondeuse/cible [5,6]. Étant donné que leur potentiel paracrine particulier dans l'exercice d'effets bénéfiques est comparable à leurs cellules d'origine, les VE de cellules souches sont apparues comme des options thérapeutiques attrayantes dans des modèles précliniques de maladies, telles que l'ischémie, l'inflammation ou les blessures, comme examiné en détail dans [{{3 }}]. D'un point de vue translationnel, en plus du potentiel de modulation cellulaire, la faisabilité de l'isolement et l'auto-renouvellement élevé sont des aspects clés de la source idéale d'EV thérapeutiques et de facteurs solubles. Dans un tel scénario, les CSM fœtales et périnatales peuvent offrir une option intéressante compte tenu de leur potentiel prolifératif et de leur profil de développement immature avec des caractéristiques intermédiaires entre les progéniteurs somatiques embryonnaires et adultes [10,11]. Les CSM fœtaux peuvent être isolés des annexes extra-embryonnaires pendant la gestation en tant que restes d'échantillonnage obtenus lors du dépistage prénatal (c.-à-d. villosités choriales [12-14] et liquide amniotique [15,16]) ou obtenus en tant que progéniteurs périnataux à la naissance, à partir de déchets cliniques (c'est-à-dire les membranes amniotiques et placentaires [17-21], les composants du cordon ombilical [22-24] et le liquide amniotique à terme [25,26]).

Cistanche peut anti-âge

Notamment, les cellules souches du liquide amniotique humain (hAFS) ont été mises en évidence comme des stratégies thérapeutiques prometteuses en médecine régénérative. et se sont révélés largement multipotents in vitro et in vivo [16, 27, 28], contribuent à la lignée hématopoïétique après une greffe in utero [29] et se greffent dans des organes lésés tout en exerçant des effets immunomodulateurs [26, 30] et en activant réponses réparatrices endogènes, telles que décrites en détail dans [31]. Notre équipe et d'autres ont en outre démontré que le hAFS libère un sécrétome hautement enrichi en molécules trophiques bioactives capables de cibler différents mécanismes de réparation. Il a été rapporté que les facteurs paracrines hAFS fournissent des stimuli pro-survie avec l'extinction de l'inflammation [32], fournissent une cardioprotection contre l'ischémie prolongée [33.34] et la cardiotoxicité [35], et stimulent l'angiogenèse locale avec la rentrée du cycle cellulaire des cardiomyocytes [ 34,36]. Étant donné qu'il a été démontré que la plupart de ces effets sont récapitulés par l'administration de hAFS-EV seule, des études indépendantes se sont concentrées sur la dissection de leur profil régénératif dans différents contextes pathologiques, notamment les lésions des muscles squelettiques et cardiaques, les maladies rénales, l'arthrose, l'ostéoporose, l'entérocolite nécrosante et les maladies neurodégénératives. modèles [34,37-44].

Bien que les preuves puissent soutenir la traduction clinique des hAFS-EV pour une future thérapie paracrine, il est important de considérer que la plupart de ces études ont principalement étudié le potentiel modulateur du hAFS fœtal obtenu lors du dépistage prénatal d'un quart de trimestre. En effet, un profil complet du sécrétome de la contrepartie périnatale (c'est-à-dire à partir des césariennes du troisième trimestre) n'a pas encore été explorée en détail. Les hAFS périnatals du troisième trimestre ont montré des propriétés de régulation immunitaire distinctes par rapport à celles des trimestres me et II [26], tout en maintenant un potentiel de régénération endothélial pertinent [25].combien de cistanche prendreIl convient de noter que le récent rapport sur la morphologie hétérogène du hAFS fœtal [45] a fourni de nouvelles informations sur leur souche et leur profil d'expression génique.bioflavonoïdesCela a tout à fait jeté un nouvel éclairage sur la valeur régénératrice des différentes fractions cellulaires de hAFS [46]. Par conséquent, la caractérisation complète des différentes sous-populations de hAFS attire de plus en plus l'attention. Nous avons précédemment rapporté qu'une stimulation hypoxique et sans sérum de 24 h représente une stratégie efficace pour augmenter le potentiel paracrine du SAFh fœtal pendant Ⅱ trimestre [34,35,37]. Étant donné que l'on sait peu de choses sur la composition du sécrétome du hAFS du troisième trimestre, nous rapportons ici la comparaison complète du hAFS du trimestre Ⅱ versus Ⅲ et de leurs fractions de sécrétome (y compris les chapeaux-EV), afin d'aborder l'influence du stade gestationnel et de la cellule hypoxique préconditionnement sur les caractéristiques des cellules et des sécrétomes.

2. Résultats

2.1. Le hAFS périnatal présente une correspondance phénotypique étroite avec le fœtus

Aucune différence statistiquement pertinente n'a été appréciée dans l'âge du donneur entre les échantillons de liquide amniotique du trimestre fœtal II et du trimestre périnatal III. fœtal c-KIT * hAFS (f-hAFS à partir d'échantillons de liquide amniotique du IIe trimestre) et périnatal c-KIT * hAFS (p-hAFS à partir de déchets cliniques de liquide amniotique du IIIe trimestre) ont confirmé des caractéristiques similaires avec une morphologie de type fibroblaste et ovale-ronde (Figure 1A) et le phénotype stromal mésenchymateux (données non présentées), comme indiqué précédemment [16, 25]. Le f-hAFS et le p-hAFS cultivés in vitro jusqu'au passage 5 ont montré des niveaux négligeables de sénescence de l'activation de la - -galactosidase (SA- -Gal) associée à la sénescence dans environ 4 % des cellules (Figure 1B) . Le f-hAFS et le p-hAFS ont tous deux présenté un niveau élevé de co-expression des marqueurs mésenchymateux CD107a et CD146, qui ont récemment été signalés comme définissant un phénotype hautement sécrétoire [47]. Les cellules CD107at CD146* représentaient la majorité de la population f-hAFS (environ 64 % ,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figure 1. Évaluation phénotypique a fœtale et a périnatale. (A) Images représentatives du hAFS fœtal (f-hAFS, panneau de gauche) et du hAFS périnatal (p-hAFS, panneau de droite) cultivés in vitro dans des conditions standard ; barre d'échelle : 200 um. (B) Analyse du marqueur sénescent beta-galactosidase (SA- -Gal, en bleu) par coloration cytochimique sur f-hAFS et p-hAFS après 5 passages en culture ; des images représentatives sont rapportées dans le panneau de gauche, barre d'échelle : 200 um. Le pourcentage correspondant de cellules/champ positifs pour -Gal est indiqué dans le graphique du panneau de droite (f-hAFS : 4,12 ± 0,58 % et p-hAFS : 3,88 ± 2,10 % ;p=0.1424,n{ {24}} expériences).(C)Immunophénotype de hAFS exprimant les marqueurs mésenchymateux CD146 et CD107a. Parcelles représentatives de cytométrie en flux de f-hAFS et p-hAFS (panneau de gauche) et valeurs correspondantes faisant référence à des cellules doubles positives CD107a plus CD146 plus ; CD107a plus CD146* f-hAFS : 63,68 ± 5,82 %,*p=0,016 par rapport au resteg36,32 ± 5,82 % f-hAFS (autre) ; CD107 à CD146 plus p-hAFS : 52,07 ± 6,76 % avec le reste47. 93 ± 56,76 % p-hAFS (autre) ; CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 expériences. Autre : quantité totale de CD107a-CD146~hAFS restants, CD107a~CD146*hAFS et CD107at CD146-hAFS. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± sem d'expériences indépendantes. SA- -Gal : galactosidase associée à la sénescence- -.

2.2.Le hAFS fœtal montre un métabolisme différent de celui du hAFS périnatal

Pour évaluer si le stade gestationnel peut influencer le métabolisme mitochondrial, f-hAFS et p-hAFS ont été analysés dans des conditions de culture in vitro standard par des analyses biochimiques. L'évaluation du métabolisme aérobie a montré que le taux de consommation d'oxygène (OCR) et la synthèse d'ATP étaient inférieurs dans le f-hAFS par rapport au p-hAFS, tous deux stimulés avec du pyruvate plus du malate (P/M ;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.Le préconditionnement hypoxique n'affecte pas la viabilité fœtale et périnatale et maintient leur activité sécrétoire

Afin de définir les formulations de sécrétome hAFS, les cellules ont été cultivées dans des conditions sans sérum pour éviter toute contamination par le FBS. Nous avons précédemment montré que les conditions de culture hypoxique sans sérum (SF) et à 1% d'O2 de 24 h n'altéraient pas de manière significative la viabilité du hAFS fœtal Ⅱtrimestre (f-hope), alors qu'elles soutenaient la libération de facteurs paracrines régénératifs dans leur milieu conditionné cellulaire (hAFS-CM) et dans les vésicules extracellulaires (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. Ici, en plus de profiler les fractions de sécrétome p-hAFS pour la première fois, nous avons évalué si p-ont présenté un comportement similaire sous le même régime de préconditionnement, en utilisant la condition de culture normoxique comme contrôle. La viabilité de f-hAFS et de p-hAFS a été analysée après 24 h dans les conditions suivantes : condition normoxique (20 % d'O2) dans un milieu de culture de contrôle complet (Ctrl) (Ctrlf-hAFSnormo et Ctrl p-hAFSnormo), une condition normoxique dans un milieu SF (SF f-hAFSnormo et SF p-hAFSnormo), condition hypoxique (1 % O2) dans un milieu de contrôle complet (Ctrlf-a hypo et Ctrl p-hAFSnypo) et condition hypoxique dans un milieu SF (SF f-a hypo et SF p -a hypo, figure 3A). Nous avons confirmé que la viabilité de f-has était inchangée dans les conditions Ctrl et SF et sous stimulation hypoxique, avec plus de 80 % (jusqu'à près de 88 %) du nombre total de cellules non affectées. Les cellules apoptotiques précoces et tardives variaient d'env. 13 % à 18 % dans les conditions SF, sans aucune pertinence statistiquement significative. De même, la viabilité périnatale était de l'ordre de 80-92 %, et les cellules apoptotiques précoces et tardives représentaient jusqu'à 18 % dans les conditions SF. p-hAFS n'a été influencé que de manière marginale dans les conditions combinées hypoxique et SF ; en effet, alors que le préconditionnement n'a pas influencé la survie des cellules lorsque les p-hAFS ont été cultivés dans un milieu complet, la condition SF correspondante a montré une augmentation d'env. 4-plier (* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figure 2. Caractérisation métabolique du SAFh fœtal et périnatal. (A) Taux de consommation d'oxygène (OCR), synthèse d'ATP par F1-F.ATP synthase et rapport P/O dans f-have et-have en présence de pyruvate plus malate (P/M) ou succinate (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistancheLa comparaison du pourcentage d'inhibition de la synthèse d'OCR et d'ATP dans f-et-hAFS due aux inhibiteurs indiqués ci-dessus est rapportée dans le panneau inférieur B. Pour les expériences d'OCR : hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Nous avons ensuite évalué le rendement des fractions de sécrétome obtenues à partir de f-hAFS par rapport à p-hAFS sur la base de l'enrichissement en protéines. L'a sécrétome total, comme l'ensemble des facteurs paracrines sécrétés par les cellules, est ici représenté par le hAFS-CM. La concentration en protéines de f-hAFS-CM et de p-hAFS-CM dans le milieu SF après le préconditionnement des cellules hypoxiques par rapport à l'état normoxique de contrôle comme ligne de base (à savoir, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo et p -hAFS-CMHypo,) a été évalué par dosage BCA et mesuré selon les cellules 10§.cistanchLes résultats acquis suggèrent que f-has-CM et p-hAFS-CM ont montré une tendance positive égale dans l'enrichissement en protéines après l'amorçage hypoxique (f-hAFS-CMnypo'166.10±22,13 ug/10 cellules de degré ; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 cellules de degré) par rapport à leurs homologues normoxiques (f-hAFS-CMnormo : 105,50±19,89 ug/10 cellules de degré ; p- hAFS-CMhypoi 91,12 ± 24,39 ug/cellules de 10 degrés） De même, la concentration en protéines de surface des hAFS-EV a été mesurée dans f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo et p-hAFS-EVShypo Les véhicules électriques ont montré un rendement comparable lorsqu'ils sont obtenus à partir de f-hAFS ou de p-hAFS. Comme pour les formulations de hAFS-CM, une tendance positive à l'augmentation de la teneur en protéines sur les f-hAFS-EV et p-hAFS. Les véhicules électriques ont été appréciés après une stimulation hypoxique au cours de la condition normoxique correspondante （f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/cellules de 10 degrés et p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/cellules de 10 degrés ;f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/cellules de 10 degrés et p -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 degrés de cellules, Figure 3C).

2.4. EV de libération de hAFS fœtal et périnatal avec une morphologie et une distribution de taille analogues

L'analyse morphologique par microscopie électronique à transmission (TEM) a accru la prolifération élevée de sécrétion d'EV des f-hAFS et p-hAFS (Figure 4). Nous avons en outre étudié la taille et la surface des f-hAFS-EV et des p-hAFS-EV (figure 4B) après le préconditionnement hypoxique par rapport à la ligne de base normoxique. Le fœtus et le périnatal ont libéré des VE de taille hétérogène, de l'ordre de 40-250 nm, comprenant donc à la fois des exosomes/petits VE et des microvésicules/vésicules excrétrices. La taille moyenne des EV/champ dans les différents groupes était comparable, les hAFS-EV fœtaux mesuraient 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo : 104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo : 97,10 ± 10,10 nm) et périnatales mesurées 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo : 94,60 ± 19,53 nm ; p-hAFS-EVShypo : 76,43 ± 4,86 nm, Figure 4B, panneau de gauche). En ce qui concerne le rendement, le hAFS stimulé sous hypoxie a montré une tendance positive à l'augmentation de la quantité de petits véhicules électriques, bien que cette augmentation ne soit pas statistiquement significative. f-hAFS-EVStypo mesurait 40-70 nm, soit presque le double de son homologue normoxique. Perinatal-has-EVSHypo qui mesurait 40-70 nm, 70-100 nm et 100-130 nm étaient presque le triple de ceux obtenus en culture normoxique (figure 4B).

L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) a montré un nombre élevé de particules dans les préparations f-hAFS-EV et p-hAFS-EV, et a confirmé l'augmentation des EV dans les échantillons hypoxiques, comme également observé dans les analyses précédentes (f-hAFS- EVsnormo : 182±0.10'particules/10 degrés ; f-have-EVshypo : 3,30±0,22×10 particules de degrés/10 degrés de cellules ; p-hAFS-EVsnormo : 2,43 ± 0,80 × particules de 10 degrés/cellules de 10 degrés ; p-hAFS-EVshypo : 3,05 ± 0,62 × particules de 10 degrés/cellules de 10 degrés, figure 4C).

Figure 4. Caractérisation morphologique des EV fœtales et périnatales. (A) Images représentatives de la microscopie électronique à transmission (TEM) de f-hAFS et p-hAFS (panneau supérieur et inférieur gauche, respectivement, avec des flèches noires indiquant des corps multi-vésiculaires intracytoplasmiques avec de petits EV/exosomes en leur sein), et de f -hAFS-EVs et p-hAFS-EVs (panneaux supérieur et inférieur droit, respectivement) libérés dans des conditions sans sérum et sous préconditionnement normoxique versus hypoxique (f-hAFS-EVSnormo ; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo ; et f-hAFS-EVshypo, respectivement), barres d'échelle : 200 nm. (B) Panneau de gauche : analyse TEM de la distribution de taille des hAFS-EV ; panneau de droite : la distribution du nombre de f-hAFS-EV et de p-hAFS-EV par taille de champ, des intervalles de 40 nm à 250 nm ont été pris en compte ; les valeurs sont exprimées en moyenne ± sem de n =3 expériences indépendantes. (C) Analyse de suivi des nanoparticules pour la taille et la distribution de hAFS. Panneau de gauche : image représentative de la sortie graphique ; panneau de droite : concentration de hAFS-EVs mesurée en particules de 10 degrés par cellules sécrétant 10 degrés ; nm : nanomètre ; mL : millilitre.

2.5. La caractérisation protéomique du hAFS fœtal et périnatal met en évidence les différences dans leur composition en sécrétome en fonction de l'âge gestationnel et du préconditionnement hypoxique

La caractérisation protéomique des formulations de sécrétome f-hAFS et p-hAFS a été réalisée au moyen d'une plate-forme sans étiquette de fusil de chasse, basée sur le couplage de la nano chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse haute résolution (nLC-HRMS). Quarante-huit profils protéomiques ont été acquis par l'analyse en double de trois réplicats biologiques de hAFS-CM et de have-EVs de f-hAFS et p-hAFS subissant un préconditionnement de cellules hypoxiques par rapport à l'état normoxique comme contrôle. Un total de 4179 groupes de protéines distincts ont été identifiés avec au moins un peptide unique et avec des poids moléculaires allant de 2 à 3900 kDa et des points isoélectriques de 3,6 à 13. Une expression protéique moyenne plus élevée dans les hAFS-EV a été observée par rapport à hAFS-CM . L'alignement de toutes les listes de protéines obtenues a été réalisé sur la base des protéines identifiées. Pour chaque condition expérimentale, une liste unique a été créée en normalisant et en faisant la moyenne [50] des valeurs de correspondance du spectre peptidique (PSM) attribuées aux protéines, qui représentent le nombre de spectres de masse attribués à chacune et représentent indirectement leur abondance dans les échantillons. La liste complète des protéines identifiées dans les formulations hAFS-CM et have-EV est présentée dans le tableau S1.

L'application de l'analyse discriminante linéaire (LDA[51]) sur cette liste maîtresse a permis l'extraction de protéines statistiquement significatives (Fratio supérieur ou égal à 4,5 et** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 dans les formulations hAFS-CM et have-EV considérées séparément. Alors qu'environ 69,5 % et 69,9 % des protéines étaient partagées respectivement entre les conditions hAFS-EV et hAFS-CM, le contenu restant semblait exclusif dans des proportions différentes, allant de 3,7 % à 13,4 %, parmi les formulations.

Pour examiner quantitativement les changements protéomiques, une analyse différentielle sans étiquette a été réalisée en utilisant le logiciel maison MAProMa et en appliquant deux algorithmes, DAve (Differential Average) et DCI (Differential Confidence Index, représentant le rapport et la confiance dans l'expression différentielle, respectivement), sur les PSM de chaque protéine entre les deux termes comparés. Utilisation de filtres rigoureux pour DAve et DCI afin de maximiser la confiance de l'identification et de considérer les protéines avec une variation supérieure à un facteur de variation de 1,5, des comparaisons par paires de f-hAFS-CM contre p-hAFS-CM et de f-hAFS-EV contre Les p-hAFS-EV ont été fabriqués en fonction du stade de gestation cellulaire. Au total, 58 et 109 protéines ont été trouvées exprimées de manière différentielle dans les compartiments has-CM et have-EV ci-dessus, respectivement (Figure S1B, C pour des détails sélectionnés et tableaux S 2- S3 sous forme étendue). Parmi celles-ci, 30 protéines ont été régulées positivement dans f-hAFS-CM et 28 ont été régulées positivement dans p-hAFS-CM (Figure S1B); de même, 44 protéines distinctes ont entraîné une régulation positive dans les f-have-EV et 65 ont été régulées à la hausse dans les p-hAFS-EV (Figure S1C). Notamment, les protéines qui ont entraîné une régulation positive dans f-ha doivent être considérées comme régulées à la baisse dans p-ha et vice versa.

les valeurs sont rapportées ; voir le tableau S2 pour la liste complète et les paramètres détaillés des protéines rapportées. (C) Analyse d'enrichissement des processus biologiques des protéines identifiées avec une fréquence d'au moins 2 dans le hAFS-CM fœtal (panneau de gauche) et le have-CM périnatal (panneau de droite) selon le préconditionnement hypoxique cellulaire. Sur la base de l'outil FunRich, les termes d'ontologie des gènes sont présentés dans des graphiques à barres indiquant le pourcentage de gènes enrichis pour chaque catégorie (barres roses pour-avoir-CMnormo, barres violettes pour f-hAFS-CMhypo ou barres bleu clair pour p-hAFS-CMnormo, et boules bleues pour p-hAFS-CMhypo).acheter cistancheSeuls les termes d'ontologie des gènes avec Bonferroni corrigés avec * p<0.05 are="">

Cet article est extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms