L'effet protecteur de l'échinacoside sur la néphropathie diabétique

Contact : Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Effets protecteurs de l'échinacoside sur la fonction rénale, le tissu rénal et les lésions des cellules mésangiales chez les rats atteints de néphropathie diabétique

HE Qin, LIU Fan, WANG Hongli, LI Jianping, DUAN Jun

Résumé:

Objectif Explorer l'effet protecteur deéchinacoside(ECH) sur le dysfonctionnement rénal, l'histopathologie et les lésions des cellules mésangiales chezdiabétiquenéphropathie(DN) rats et son mécanisme. Méthodes Soixante rats SD ont été divisés au hasard en groupe témoin, groupe modèle, ECH (échinacoside) groupe (doses élevées, moyennes et faibles ECH (échinacoside), 100, 50, 20 mg·kg'·j') et groupe losartan potassique (losartan potassium, 16 mg·kg'·j'), 10 rats dans chaque groupe. Le groupe modèle, ECH (échinacoside) et le groupe losartan potassium ont été nourris avec un régime riche en graisses et en sucre, et de la streptozotocine injectée par voie intrapéritonéale (40 mg·kg"') pour établir des modèles de rat DN. Après 2 semaines de traitement, poids corporel, consommation d'eau sur 24 h , et le volume d'urine des rats ont été enregistrés. Le contenu de la glycémie à jeun, de la créatinine sérique, de l'azote uréique, de la microprotéine urinaire, de l'acide hyaluronique (HA), de l'inhibiteur de la métalloprotéinase tissulaire-1(TIMP-1) et de la laminine (LN) ont été déterminées. Une coloration HE et une coloration TUNEL ont été réalisées pour observer les changements pathologiques dans le tissu rénal. Une RT-PCR a été réalisée pour détecter l'expression du lymphome à cellules B (Bcl-2), associé à Bcl2- Protéine X (Bax), Caspase-3 ARNm. Le Wester Blot a été réalisé pour déterminer les niveaux d'expression de la molécule d'adhésion cellulaire vasculaire-1(VCAM-1), Transforming growth factor (TGF- ), - Actine musculaire lisse (-SMA) Résultats Par rapport au groupe témoin, le poids corporel du groupe modèle a été significativement diminué (P< 0.05),="" water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly="" increased=""><0.05). bax,="" caspase-3="" mrna,="" and="" expression="" of="" vcam-1,="" tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05),="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="">< 0.05).="" compared="" with="" the="" model="" group,="" bodyweight="" of="" rats="" was="" significantly="" increased="" in="" the="" medium-dose="" ech="">échinacoside) groupe, ECH à haute dose (échinacoside) et le groupe losartan potassique (P<0.05), water="" intake,="" urine="" volume,="" fasting="" blood="" glucose,="" urine="" microalbumin,="" urea="" nitrogen,="" creatinine,="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" were="" significantly=""><0.05).bax,caspase-3 mrna,="" expression="" of="" vcam-1,tgf-β="" and="" α-sma="" protein="" were="" significantly="">< 0.05);="" and="" expression="" of="" bcl-2="" mrna="" was="" significantly=""><0.05).he and="" tunel="" staining="" showed="" that="" pathological="" changes="" in="" renal="" tissue="" were="" significantly="" decreased.="" conclusion="" medium="" and="" high="" doses="" of="" ech="">échinacoside) peut protéger les lésions tissulaires rénales et améliorer la fonction rénale chez les rats DN en inhibant l'expression protéique du TGF- et du VCAM -1 et en inhibant la fibrose interstitielle rénale et l'apoptose des cellules rénales.

Mots clés:Cistanches herba;Échinacoside; diabétiquenéphropathie; fibrose interstitielle rénale; apoptose; les rats

cistanche échinacoside traiter la néphropathie diabétique

Introduction

Diabétique néphropathie(néphropathie diabétique, DN) est unediabétiquecomplication microvasculaire, qui peut non seulement causer des lésions rénales, mais également affecter d'autres organes. La caractéristique pathologique clinique de la fibrose tubulo-interstitielle rénale est la pathogenèse compliquée dediabétiquenéphropathie. Des études antérieures [P2-5 pensent que la maladie est principalement due à l'hyperglycémie chezdiabétiquepatients, ce qui provoque des changements hémodynamiques rénaux et un métabolisme anormal. Les manifestations cliniques sont principalement une protéinurie et une diminution du taux de filtration glomérulaire. Maintenant,diabétiquenéphropathieLes patients manquent toujours de méthodes de traitement clinique efficaces, et la découverte de nouveaux médicaments efficaces est la clé du traitement desdiabétiquenéphropathie.

échinacoside(ECH) est l'un des extraits de Cistanche Tubulosa. Il a pour effet de revigorer les reins et de renforcer le yang." Des études pharmacologiques modernes ont montré que l'échinacoside a un effet antioxydant, anti-apoptotique, anti-inflammatoire et améliore le flux sanguin. La microcirculation et d'autres effets pharmacologiques peuvent également réguler le métabolisme du glucose dans le corps et améliorer le glucose. Ces dernières années, des études ont montré que l'échinacoside pouvait inhiber la voie de signalisation du facteur de croissance de transformation (Transforming growth factor, TGF- ) et inhiberdiabétiquenéphropathie. La fibrose interstitielle des reins de rat protège le tissu rénal de rat. Cependant, il existe peu de rapports dans la littérature sur le traitement desdiabétiquenéphropathieavecéchinacoside, et son mécanisme spécifique de protectiondiabétiquenéphropathiechez le rat n'est pas claire. Par conséquent, cette étude a exploré davantage l'effet deéchinacosidesur la fibrose rénale et l'apoptose des cellules rénales chezdiabétiquenéphropathierats et son mécanisme possible est destiné à fournir une base théorique pour l'application clinique deéchinacoside.

Bénéfice du cistanche : traiter les maladies rénales et améliorer la fonction rénale

1 Matériel et méthodes

1.1 Animaux :

60 rats SD, mâles, grade SPF, âgés de 8 semaines, poids corporel 240 ~ 280 g, fournis par Beijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd., numéro de licence animale : SCXK (Beijing) 2015-0001, qualité animale est qualifié Numéro de certificat : 11400700106210, élevé dans le laboratoire du centre animalier de l'hôpital, maintenant la température ambiante constante à 25 degrés, simulant le jour et la nuit, changeant les conditions d'éclairage une fois toutes les 12 heures, et les animaux sont libres de manger et de boire .

1.2 Médicaments et réactifs :

Échinacoside, Institut chinois pour le contrôle des aliments et des médicaments, numéro de lot : 111670-201706 ; Potassium de losartan, Hangzhou Merck Pharmaceutical Co., Ltd., National Medicine Standard : H20030654 ; Streptozotocine, American Sigma Company, numéro de lot : 040103 ; Kit de détection de la teneur en protéines urinaires, Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd., numéro de lot : 20170612 ; Kit de détection TUNEL, Amicage Technology Co., Ltd., numéro de lot : 20180406 ; Kit d'extraction d'ARN, kit de transcription inverse, Shanghai Hengfei Bio-Technology Co., Ltd., numéro de lot : 20180705, 20180904 ; Acide hyaluronique sérique (HA), inhibiteur de la métalloprotéinase tissulaire-1 (TIMP-1) et kits de détection de laminine (laminine, LN), Shanghai Yuanmu Biotechnology Co., Ltd., les numéros de lot sont 20180612, 20180624, 20180706.

1.3 Appareillage

Analyseur biochimique automatique de type 7600, société japonaise HITACHI ; lecteur de glycémie portable, Beijing Yicheng Bioelectronics Technology Co., Ltd. ; Microscope optique B X60, société japonaise OLYMPUS ; Analyseur de dosage radioimmunologique SN-695B, société Shanghai Rihuan Instrument Shenbei Co., Ltd.

1.4 Regroupement, réplication du modèle et méthode d'administration

Après une semaine de pré-alimentation, 60 rats ont été répartis au hasard dans le groupe témoin, le groupe modèle, leéchinacosidegroupes à dose élevée, moyenne et faible et le groupe losartan potassique, avec 10 rats dans chaque groupe. Le groupe modèle,échinacosidegroupe et le groupe losartan potassium ont été traités avec un régime riche en graisses et en sucre combiné avec de la streptozotocine à faible dose pour induirediabétiquenéphropathiechez le rat. Avant la réplication du modèle, les rats ont jeûné avec de l'eau pendant 12 h. Les rats du groupe témoin ont été nourris avec des aliments ordinaires et les autres groupes ont été nourris avec des aliments riches en matières grasses et en sucre. Après 4 semaines d'alimentation continue, les rats du groupe témoin ont reçu une seule injection intrapéritonéale d'un volume égal de tampon citrate, et les autres groupes ont reçu une seule injection intrapéritonéale de streptozotocine bactériocine (40 mg·kg') pour reproduire le modèle de rat dediabétiquenéphropathie. 72 heures après l'injection de streptozotocine aux rats, la glycémie était supérieure ou égale à 16,7 mmol·L et le taux d'excrétion des protéines urinaires de 24 heures après 3 semaines était supérieur à celui du groupe témoin. La protéine urinaire quantitative de 24 heures était supérieure à 50 % avant la réplication du modèle, ce qui indique que le modèle a été répliqué avec succès. Quatre semaines après l'injection de streptozotocine, les groupes recevant les doses faible, moyenne et élevée deéchinacosideont reçu 20 mg·kg', 50 mg·kg et 100 mg·kg'échinacoside(selon 5mL·kg chez le rat). kg"' de poids corporel est dissous dans des solutions salines normales à 37 degrés), les rats du groupe losartan potassium reçoivent par voie intragastrique 16 mg·kg de losartan potassium, et le groupe modèle et le groupe témoin reçoivent par voie intragastrique des volumes égaux de solution saline normale, une fois par jour Le gavage a été poursuivi pendant 2 semaines.

1.5 Prélèvement d'échantillons

Après la dernière administration, les rats ont jeûné sans nourriture ni eau. Les 24 heures d'eau potable des rats ont été enregistrées et les 24 heures d'urine ont été recueillies. Au petit matin du deuxième jour, les rats ont été pesés. Après avoir recueilli l'urine, injection intrapéritonéale d'une solution de pentobarbital sodique à 2 % 2 mL·kg~ pour l'anesthésie, séparation du sang de l'aorte abdominale du rat, centrifugation (3 500 r·min²', 15 min), prélever le sérum et le placer dans le réfrigérateur- Conserver temporairement à 20 degrés ; séparer le tissu rénal de rat et le diviser en deux parties, une partie est fixée dans du paraformaldéhyde à 4 %, l'autre partie est préparée sous forme d'homogénat à 10 % et placée dans un réfrigérateur à -80 degrés pour une utilisation ultérieure.

1.6 Détermination du métabolisme du glucose et des lipides chez le rat

Le sérum de chaque groupe de rats a été prélevé, la glycémie à jeun a été mesurée avec un lecteur de glycémie et les taux de triglycérides, de cholestérol et de lipoprotéines de basse densité ont été détectés par un analyseur biochimique automatique.

1.7 24 h protéines urinaires, fonction rénale et indicateurs liés à la fibrose rénale

L'urine de 24- heure des rats de chaque groupe a été recueillie et la teneur en microprotéines urinaires de 24- heure a été déterminée par dosage radioimmunologique. L'opération s'est déroulée dans le strict respect des consignes. Le sérum de chaque groupe de rats a été collecté et l'analyseur biochimique automatique a été utilisé pour détecter les niveaux de créatinine sanguine et d'azote uréique, qui sont liés à la fonction rénale, le niveau de TIMP sérique -1 a été détecté par ELISA, et les niveaux de HA et de LN ont été détectés par dosage radio-immunologique. L'opération s'est déroulée dans le strict respect des consignes.

1.8 Coloration HE pour observer les changements pathologiques du tissu rénal et coloration TNUEL pour observer l'apoptose des cellules du tissu rénal

Les tissus rénaux fixés de chaque groupe ont été prélevés, systématiquement inclus dans de la paraffine et sectionnés. Une section est utilisée pour la coloration HE pour observer les changements morphologiques des tubules rénaux, des glomérules et de l'interstitium rénal au microscope optique ; l'autre section est utilisée pour la coloration TUNEL, en suivant les instructions du kit et en observant le nombre et la positivité des cellules du tissu rénal au microscope Le nombre de cellules est calculé comme le rapport du nombre de cellules positives au nombre de tissu rénal cellules, qui est le taux d'apoptose.

1.9 Méthode RT-PCR pour détecter l'expression de gènes liés à l'apoptose dans les tissus rénaux

Prenez l'homogénat de tissu rénal de rat, extrayez l'ARN total par la méthode Trizol, déterminez la concentration par spectrophotomètre ultraviolet et synthétisez l'ADNc avec le kit de transcription inverse.

1.10 Méthode Western Blot pour déterminer l'expression des protéines VCAM-1, TGF- et -SMA du tissu rénal.

Prenez environ 50 mg d'homogénat de tissu rénal de rat, dissolvez-le avec un lysat cellulaire contenant des inhibiteurs de protéase et extrayez la protéine totale avec un lysat cellulaire, en utilisant la méthode BCA pour la quantification des protéines. L'échantillon de protéine totale extrait par 50 μmol·L" a été transféré sur une membrane de nitrocellulose par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et scellé avec du lait écrémé à 5 %, et l'anticorps primaire (1∶1000) et la protéine -actine ont été ajoutés respectivement. Anticorps (1 : 300), incuber une nuit à 4 degrés. Enfin, ajouter l'anticorps secondaire et incuber pendant 2h à 37 degrés, surveillé par électrochimiluminescence. Utiliser le logiciel d'analyse d'images Photoshop pour analyser la valeur de gris des bandes de protéines.

1.11 Méthodes de traitement statistique

Le logiciel SPSS 17.0 a été utilisé pour analyser les données obtenues, et les données de mesure qui satisfont à la distribution normale sont exprimées en moyenne ± écart type ((x±s), et une analyse de variance à facteur unique est utilisée pour comparer les différences entre les groupes La comparaison par paires entre les groupes utilise SNK- Avec le test q, P<0.05 indicates="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

2 Résultats

2.1 Les effets de l'échinacoside sur la masse corporelle, l'eau potable et le débit urinaire des rats atteints de néphropathie diabétique sont présentés dans le tableau 1.

Tableau 1 Effets de l'ECH sur le poids corporel, la consommation d'eau et le volume d'urine chez les rats DN（x ± s,n=10）

Par rapport au groupe témoin, le poids corporel des rats du groupe modèle a été significativement réduit et les 24- heures d'eau potable et de production d'urine ont été significativement augmentées. La différence était statistiquement significative (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" doses="" of="">échinacosideLe poids corporel des rats du groupe losartan potassium a augmenté de manière significative, et les 24-heures de consommation d'alcool et d'urine ont diminué de manière significative, et la différence était statistiquement significative (P<>

2.2 Les effets de l'échinacoside sur le métabolisme du glucose et des lipides chez les rats atteints de néphropathie diabétique sont présentés dans le tableau 2.

Tableau 2 Effets de l'ECH sur le métabolisme du glucose et des lipides chez les rats DN

Noter:Par rapport au groupe témoin,' P<0.05; compared="" with="" the="" model="" group,=""><>

Comparativement au groupe témoin, la glycémie à jeun des rats du groupe modèle était significativement augmentée et la différence était statistiquement significative (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" increased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05) ). Par rapport au groupe modèle, la glycémie à jeun des rats des groupes recevant les doses moyenne et élevée deéchinacosideet le groupe losartan potassium a été significativement réduit, et la différence était statistiquement significative (P<0.05); triglycerides,="" cholesterol,="" and="" low-density="" lipoprotein="" decreased,="" but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05).

2.3 Les effets de l'échinacoside sur les protéines urinaires 24-heures et la fonction rénale des rats atteints de néphropathie diabétique sont présentés dans le tableau 3.

Comparativement au groupe témoin, les niveaux de microalbumine urinaire, d'azote uréique et de créatinine du groupe modèle ont été significativement augmentés, et les différences étaient statistiquement significatives (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" middle="" and="" high="" dose="">échinacosideLes taux de microalbumine urinaire, d'azote uréique et de créatinine des rats du groupe losartan potassium ont été significativement réduits et les différences étaient statistiquement significatives (P<>

Tableau 3 Effets de l'échinacoside sur les protéines urinaires de 24h et la fonction rénale de rats atteints de néphropathie diabétique (x±s, n=10)

2.4 Les effets de l'échinacoside sur la fibrose rénale chez les rats atteints de néphropathie diabétique sont présentés dans le tableau 4.

Par rapport au groupe témoin, les taux sériques de HA, TIMP -1 et LN dans le groupe modèle ont augmenté de manière significative et les différences étaient statistiquement significatives (P<0.05); the="" levels="" of="" ha,="" timp-1="" and="" ln="" of="" rats="" in="" the="" sartan="" potassium="" group="" were="" significantly="" reduced,="" and="" the="" differences="" were="" statistically="" significant=""><>

Tableau 4 Effets de l'ECH sur la fibrose rénale chez les rats DN

2.5 coloration HE pour observer les changements pathologiques du tissu rénal chez les rats atteints de néphropathie diabétique (voir figure 1).

La coloration HE des rats du groupe témoin a montré que la structure des cellules du tissu rénal était intacte et qu'aucun changement pathologique évident n'a été observé. La coloration HE des rats dans le groupe modèle et la faible doseéchinacosidegroupe a montré: glomérule gonflé et élargi en taille, cellules épithéliales tubulaires rénales gonflées ou tombées, l'interstitium rénal s'accompagnait d'une infiltration de cellules inflammatoires et une certaine hyperplasie mésangiale et une prolifération interstitielle étaient également visibles. Fibrose qualitative.Échinacosidegroupes à dose moyenne et élevée et groupes Losartan potassique. La coloration a montré que les modifications pathologiques du tissu rénal étaient significativement réduites, accompagnées d'une petite quantité d'infiltration de cellules inflammatoires, et le degré d'hyperplasie mésangiale et de fibrose interstitielle était également plus léger que celui du groupe modèle.

Figure 1 Modifications pathologiques des tissus rénaux des rats de chaque groupe

2.6 L'effet de l'échinacoside sur l'apoptose du tissu rénal chez les rats atteints de néphropathie diabétique est illustré à la figure 2.

La coloration TUNEL a montré que par rapport au groupe témoin, le taux d'apoptose des rats du groupe modèle était significativement augmenté et la différence était statistiquement significative (P <0.05) ; par="" rapport="" au="" groupe="" modèle,="" les="" doses="" moyennes="" et="" élevées="">échinacosideet Corsa Le taux d'apoptose des rats du groupe potassium a été significativement réduit, et la différence était statistiquement significative (P<>

Figure 2 Apoptose des cellules du tissu rénal chez les rats DN

2.7 L'effet de l'échinacoside sur l'expression des gènes liés à l'apoptose dans les tissus rénaux de rats atteints de néphropathie diabétique est présenté dans le tableau 6.

Les résultats de la RT-PCR ont montré que, par rapport au groupe témoin, l'expression de l'ARNm de Bax et Caspase-3 dans le groupe modèle était significativement régulée à la hausse, et l'expression de l'ARNm de Bcl-2 était significativement régulée à la baisse , et la différence était statistiquement significative (P<0.05); compared="" with="" the="" model="" group="" in="" comparison,="" the="" expression="" of="" bax="" and="" caspase-3="" mrna="" was="" significantly="" down-regulated="" in="" the="" middle="" and="" high-dose="">échinacosidegroupes et le groupe Losartan potassium, et l'expression de l'ARNm de Bcl-2 était significativement régulée positivement, et les différences étaient statistiquement significatives (P<>

Tableau 6 Effets de l'ECH sur l'expression du gène lié à l'apoptose dans le tissu rénal de rats DN

2.8 Les effets deéchinacosidesur l'expression des protéines VCAM-1, TGF- et -SMA dansdiabétiquenéphropathieles rats sont illustrés à la figure 3 et au tableau 7. Par rapport au groupe témoin, l'expression des protéines VCAM -1, TGF- et -SMA dans le groupe modèle était régulée de manière significative et la différence était statistiquement significative (P ＜0.05 ); Les expressions des protéines VCAM-1, TGF- et -SMA chez les rats du groupe dose et du groupe losartan potassium étaient significativement régulées à la baisse, et les différences étaient statistiquement significatives (P<>

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