Détermination de l'échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche Herba par HPLC

XU Shanshan1 ,WU Kangyu2 ,TU Xingming2 （1. Le troisième Collège de médecine clinique de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou, Canton 510405 Guangdong, Chine; 2. Le troisième hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou,Canton 510378 Guangdong,Chine） 

Abstrait: Objectif Une méthode HPLC a été établie pour la détermination deÉchinacosidedans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola. MéthodesL'échinacoside a été dosé par HPLC. La séparation a été réalisée sur Inertsil ODSSP C18 colonne avec phase mobile constituée d'acétonitrile（A）et 0.4 % de solution d'acide phosphorique（B）,par gradient d'élution. La longueur d'onde de détection a été fixée à 333 nm,et la température de la colonne était de 3 0 degrés. Le débit était de 1,0 mL·min-1 et le volume d'injection était de 10 μL.RésultatsLa relation linéaire de l'échinacoside dans la plage de concentration de 44.939 7-539.276 4 ug·mL- 1 c'était bien（r = 0.999 8）. Les récupérations étaient de 94,59 % -105,31 %（RSD= 2.93 %,n = 9）. La teneur en échinacoside des extraits aqueux de Cistanche herba était de 15.527,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Conclusion: La méthode HPLC établie avec une bonne répétabilité est précise,simple et faisable. Il convient à la détermination de l'échinacoside dans l'extrait aqueux deCistanche deserticola ma. 

Mots clés:CLHP;extrait aqueux deCistanche désertique;Échinacoside;détermination du contenu

Cistanche désertiqueest un tonique couramment utilisé en médecine traditionnelle chinoise en pratique clinique, et a la réputation de "ginseng du désert". Le Cistanche deserticola inclus dans l'édition 2015 de la Pharmacopée chinoise est la tige séchée, écailleuse et charnue de la plante Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Il a une nature chaude, un goût sucré et salé, et appartient aux méridiens des reins et du gros intestin. Il a pour effet de tonifier le yang des reins, d'être bénéfique pour l'essence et le sang, d'humidifier les intestins et de soulager la constipation. [2]. 

Ginseng du désert

Le "Shennong Materia Medica Classic" déclare qu'il peut "nourrir le milieu, nourrir les cinq organes internes, renforcer le yin et nourrir l'essence".Cistanche deserticola contient principalement des glycosides phényléthanoïdes, des iridoïdes et des glycosides, des lignanes et des glycosides, des polysaccharides, des esters et des alcaloïdes [3].Glycosides de phényléthanolsont les principaux composants actifs deCistanche désertique, parmi lesquels l'échinacée et le poolside sont les composants indicateurs pour l'identification et la détermination du contenu de Cistanche deserticola dans la pharmacopée chinoise. 

Le glycoside de phényléthanol est le principal composant actif de Cistanche deserticola

Des études pharmacologiques [4] indiquent que Cistanche désertiquea divers effets pharmacologiques tels que l'humidification des intestins et le soulagement de la constipation, la protection du foie, la résistance à l'ostéoporose, l'antioxydation, l'anti-âge et l'anti-fatigue. L'extrait aqueux deCistanche désertiquepeut promouvoir les gènes de la protéine morphogénétique osseuse 2 des ostéoblastes chez le rat, ainsi que la phosphatase acide tartrate-résistante et l'ostéocalcine dans le sérum de souris ovariectomisées, ainsi que les gènes Smad1 et Smad5 et les facteurs de croissance transformants dans la moelle osseuse- L'expression de, etc., a uneeffet anti-ostéoporose [5-6]. Échinoside peut favoriser la prolifération des ostéoblastes et favoriser la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse en ostéoblastes in vitro[7-9]. 

L'échinoside, principal composant chimique de Cistanche deserticola

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Ces dernières années, de nombreux rapports ont été publiés sur la détermination de la teneur en échinacoside et en poolside dans l'extrait alcoolique de Cistanche deserticola et ses préparations composées [10-12], mais il existe peu de rapports sur la détermination de la teneur en composants indicateurs dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola. Dans cette étude, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été utilisée pour déterminer la teneur en échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.

1. Matériel

1.1 Appareil

LC-20Chromatographie liquide haute performance AT, SPD-20Un détecteur, SIL-20Un échantillonneur automatique, CTO-10Boîte de température de colonne ASvp, station de travail de chromatographie liquide LCsolution, Shimadzu Corporation du Japon; Balance analytique électronique MES125P-OCE-DU, Sartorius, Allemagne ; SHZ-D (III) pompe à vide polyvalente à circulation d'eau, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd ;

Système de circulation de refroidissement à évaporateur rotatif 1.2RC2BSO25, évaporateur rotatif RV10DS96, IKA, Allemagne ; Bain-marie thermostatique électrique DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd ; Machine à eau ultra-pure série UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Matériels médicinaux et réactifs

Viande Rong matériel médicinal, acheté auprès de Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., numéro de lot : 18010011806001, 181001. Les tiges séchées, écailleuses et charnues de la plante Leobaceae Cistanche deserticola identifiée par l'herboriste chinois en chef Tu Xingming du troisième affilié L'hôpital de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Guangzhou est stocké dans la salle d'inspection des médicaments du troisième hôpital affilié de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Guangzhou ; Substance de référence des échinosides, teneur de 89,7 %, Institut chinois pour le contrôle des aliments et des médicaments, numéro de lot : 111670-201706 ; L'acétonitrile est chromatographiquement pur (Merck, Allemagne); Le méthanol et l'acide phosphorique sont analytiquement purs (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); L'eau est de l'eau ultra-pure.

2. Méthodes et résultats

2.1 Préparation de l'extrait aqueux de Cistanche deserticola

Prendre lapoudre de cistanche, ajoutez 10 fois la quantité d'eau distillée, chauffez et refluez pour extraire deux fois, à chaque fois pendant 1 heure. Filtrez, combinez le filtrat et utilisez un évaporateur rotatif pour concentrer le filtrat à une teneur en médicament brut de 0.100 g · mL-1. Conserver à 4 degrés pour la veille. 2.2 Conditions chromatographiques et adéquation du système Colonne chromatographique : Colonne InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μ m） ; Phase mobile : acétonitrile (A) - 0. Solution d'acide phosphorique à 4 % (B), gradient d'élution : 0~ 5min, 17 % A ; 5~25min, 20 % A ; 25~30min, 17 % A ; Longueur d'onde de détection : 333 nm ; Température de la colonne : 30 degrés ; Débit : 1,0 mL · min-1 ; Volume d'injection : 10 μ L. Dans ces conditions chromatographiques, la résolution entre les pics d'échinacée et les composants adjacents est supérieure à 1,5 et le nombre théorique de colonnes ne doit pas être inférieur à 4000 pour les pics d'échinacée.Le chromatogramme est illustré à la figure 1.

Figure1 Chromatogrammes HPLC de l'échinacoside (A) et de l'extrait aqueux de Cistanche herba (B)

2.3 Préparation de la solution

2.3.1 Solution de référence

Pesez une quantité appropriée deÉchinacétinesubstance de référence, pesez-la avec précision, placez-la dans une fiole jaugée de 10 ml, ajoutez du méthanol pour dissoudre et faites-la contenir 898,794 échinacétine par millilitre μ G de la solution de référence, stockée à 4 degrés pour la veille.

Echinoside de Cistanche deserticola

2.3.2 Solution d'essai

Mesurer avec précision 2,0 mL d'extrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer au bain-marie, dissoudre dans du méthanol, amener à volume constant dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter, 0,22 μ M microporeux filtration membranaire, nommément.

2.4 Recherche d'une relation linéaire

Mesurer avec précision {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, et 3.00 ml de la solution de référence sous 2.3.1 et placez-les dans une fiole jaugée de 5 ml, ajoutez du méthanol à volume constant et agitez bien pour obtenir des concentrations de gradient de 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,5176, 449,3970 , et 539,2764 μ G · mL-1 de la solution témoin, 0,22 μ M Filtration sur membrane microporeuse. Effectuer la détermination selon les conditions chromatographiques en 2.2 et enregistrer la surface du pic. En utilisant la concentration massique de la substance de référence comme abscisse (X, μ G · mL-1), la surface du pic est l'ordonnée (Y) et l'équation de régression linéaire est obtenue : Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Les résultats ont montré que l'échinacée variait de 44,9397 à 539,2764 μ La relation linéaire dans la plage de concentration de g · mL-1 est bonne.

2.5 Essai de précision

Prendre 539,2764 μ G · mL-1 solution de référence, injecter l'échantillon en continu 6 fois selon les conditions chromatographiques en 2.2 et enregistrer la surface du pic. Résultats Le RSD de la surface maximale de l'échinacée était de 1,81 %, indiquant une bonne précision de l'instrument.

2.6 Essai de stabilité

Mesurez avec précision 2,0 ml deCistanche désertiqueextrait aqueux, évaporer à sec au bain-marie, dissoudre dans du méthanol, porter à volume constant dans une fiole jaugée de 10 mL, bien agiter, 0.22 μ Filtrer avec une membrane microporeuse, injecter échantillons pour la détermination à 0, 2, 4, 8, 12 et 24 heures selon les conditions chromatographiques en 2.2, et enregistrer la surface du pic. Résultats Le RSD de la surface du pic d'échinacée était de 1,16 %, ce qui indique que la solution d'essai avait une bonne stabilité dans les 24 heures.

2.7 Essai de répétabilité

Mesurer avec précision 6 portions de 2.0 ml de solution aqueuseextrait de Cistanche deserticola, préparer en parallèle 6 portions de la solution à examiner selon la méthode décrite en 2.3.2, injecter les échantillons à doser selon les conditions chromatographiques décrites en 2.2 et enregistrer la surface du pic. Résultats Le RSD de la concentration massique d'échinacée était de 1,28 %, indiquant que la méthode avait une bonne répétabilité.

Expérience Cistanche deserticola

2.8 Test de récupération de l'ajout d'échantillon

Mesurez avec précision 9 portions de 1.0 ml deCistanche désertiqueextrait aqueux, ajouter {{0}}.8, 1.0 et 1,2 mL de solution témoin (101,552 mg · mL - 1), évaporer au bain-marie, dissoudre dans méthanol et porter au volume dans une fiole jaugée mL ; Bien agiter, 0,22 μ Filtre avec m membrane filtrante microporeuse pour préparer une solution de test à concentration élevée, moyenne et faible. Préparez 3 parties de chaque concentration en parallèle, mesurez selon les conditions chromatographiques en 2.2, enregistrez la zone de pic et calculez la récupération de la dépendance de l'échantillon. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

2.9 Détermination du contenu de l'échantillon

Mesurez avec précision 3 portions de 2.0mLextrait aqueux de Cistanche deserticola, évaporer à sec au bain-marie, dissoudre dans du méthanol, amener à volume constant dans une fiole jaugée de 10mL, bien agiter, 0,22 μ Filtrer avec une membrane microporeuse, mesurer selon les conditions chromatographiques en 2.2, notez la surface du pic et calculez la teneur en échinacée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Tableau 1 Résultats des tests de récupération de l'échinacoside

Tableau 2 Résultats de la détermination de la teneur en échinacoside dans l'extrait aqueux de Cistanche herba

3.Discussion

3.1 Méthode de préparation de l'article d'essai

L'extrait aqueux deCistanche désertiquecontient divers composants chimiques tels que les glycosides de phényléthanol et les polysaccharides, qui provoquent certaines interférences avec les composants à tester. Cette étude a porté sur deux concentrations différentes de solvants, 50 % de méthanol et de méthanol. Les résultats ont montré que l'effet de séparation des pics dans le chromatogramme du produit testé en utilisant 50 % de méthanol comme solvant était faible entre l'échinacée et les composants adjacents ; En utilisant du méthanol comme solvant, la résolution du pic de glycoside d'échinacée est bonne et il n'y a pas d'interférence avec d'autres pics d'impuretés. Par conséquent, le méthanol a été choisi comme solvant pour la solution d'essai. En utilisant du méthanol comme solvant, l'extrait aqueux de Cistanche deserticola a été évaporé à sec dans un bain-marie. Deux méthodes de traitement ont été utilisées : dissolution du méthanol, agitation à volume constant et dissolution du méthanol par ultrasons (10 min). Les résultats ont montré qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux méthodes. Cette méthode a été choisie pour préparer la solution d'essai en raison de la simple opération de dissolution du méthanol et d'agitation à volume constant.

Cistanche aux herbes chinoises

3.2 Sélection de la phase mobile

Dans cette étude, il a été fait référence à la phase mobile (méthanol-0.1 % d'acide formique) utilisée pour la détermination du contenu de Cistanche deserticola dans la Pharmacopée chinoise (Volume I) (2015). Les résultats ont montré que le pic de glycoside d'échinacée s'élargissait et qu'il y avait un phénomène de bord d'attaque, qui peut être lié à la faible capacité d'élution de la phase mobile ; En se référant à la littérature pertinente [12-13], l'acétonitrile-0.5 % d'acide acétique a été utilisé comme phase mobile, mais la forme du pic de l'échinacée était médiocre et il y avait un phénomène de traînée. Compte tenu de la valeur du pH de la phase mobile, l'acétonitrile-0.4 % d'acide phosphorique a finalement été utilisé comme phase mobile. En conséquence, le nombre théorique de pics d'échinacée sur plaque était supérieur à 4 000 et la résolution entre l'échinacée et les pics des composants adjacents était supérieure à 1,5. La forme du pic était symétrique, sans interférence des pics d'impuretés, et la ligne de base était stable. Par conséquent, dans cette étude, l'acétonitrile - 0.4 % d'acide phosphorique a été utilisé comme phase mobile chromatographique pour la détermination de la teneur en échinacée. Dans cette étude,la méthode HPLC a été utilisée pour déterminer l'échinacée dans l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.

Poudre d'extrait de Cistanche

La méthode est simple, précise et reproductible. Il convient à la détermination de l'échinacée dans l'extrait aqueux de cistanche deserticola et peut être utilisé comme méthode de contrôle de qualité pour l'extrait aqueux de cistanche deserticola.Cette étude a uniquement déterminé la teneur en échinacée de l'extrait aqueux de Cistanche deserticola.À l'avenir,il est prévu de déterminer la teneur en échinacée dans la décoction composée de Cistanche deserticola pour explorer l'impact de divers facteurs sur la teneur en échinacée, fournissant une référence pour le contrôle de la qualité de la décoction contenant Cistanche deserticola.

référence:

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[2] National Pharmacopoeia Commission Pharmacopoeia of the People's Republic of China (Part I) [M] Pékin : China Medical Science and Technology Press, 2015 :135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al Progrès de la recherche sur Cistanche deserticola [J] Étude d'évaluation des médicaments, 2013, 36 (6) : 469-475

[4] Fang Jian Advances in pharmacological research on Cistanche deserticola [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Effet de l'extrait aqueux de cistanche deserticola sur l'expression du gène de la protéine morphogénétique osseuse 2 dans les ostéoblastes de rat [J] Chine AnimalÉlevage et médecine vétérinaire, 2013, 40 (1) : 17-21

[6] LIANG H, YU F, TONG Z, et al. Extrait aqueux de Cistanches herba affectant les niveaux d'expression de l'ARNm de Smad1, de l'ARNm de Smad5, de l'ARNm de TGF- 1 et de l'ARNm de TIEG1 dans la maladie de l'ostéoporose [J]. Rapports de biologie moléculaire, 2013, 40 （2） :757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming et al Observation sur l'échinoside favorisant la prolifération des ostéoblastes de rat en activant ERK/BMP-2 Signal Pathway [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4) : {{5 }}

[8] Étude Tian Yuan sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse en ostéoblastes induite par l'échinaside et son mécanisme [D] Shenyang : Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan, etc. Étude sur la différenciation induite par les échinosides des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse en ostéoblastes [J] Pharmacologie et clinique de médecine traditionnelle chinoise, 2017, 33 (2) : 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al Determination of Echinoside and Piloside in Cistanche deserticola Micropowder by HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, et al Détermination simultanée de l'échinoside, du piloside et de l'isopiloside dans les capsules de glycoside total de cistanche par HPLC [J] Science et technologie mondiales - Modernisation de la médecine traditionnelle chinoise, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Études pharmacodynamiques et métabonomiques sur les effets anti-ostéoporotiques de Cistanche deserticola et de ses composants efficaces [D] Yinchuan : Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan, et al Determination of Echinoside and Piloside in Qirong Runchang Oral Liquid by High Performance Liquid Chromatography [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892