Le régime alimentaire influence de manière significative l'immunopathologie et la gravité des lésions rénales

Contact : emily.li@wecistanche.com

John E. Brus, et al

Résumé: 

«Le régime alimentaire est l'un des principaux facteurs de risque de morbidité et de mortalité dans le monde, mais il est rarement pris en compte dans la conception des études animales précliniques. Plusieurs des carences nutritionnelles signalées chez les Américains se sont avérées préjudiciables àun reinsanté; cependant, les mécanismes responsables ne sont pas clairs et ont été largement attribués au développement du diabète ou de l'hypertension. Ici, nous avons cherché à déterminer si le régime alimentaire influence la susceptibilité aux lésions rénales chez les souris mâles C57Bl/6. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire standard, un régime « occidental » disponible dans le commerce (WD) ou un nouveau régime américanisé (AD) pendant 12 semaines avant l'induction deun reinblessureen utilisant les modèles de néphropathie à l'acide folique (FAN) ou de lésion d'ischémie-reperfusion rénale unilatérale (uIRI). Dans FAN, les souris qui ont été nourries avec le WD et l'AD présentaient de pires preuves histologiques de lésions tissulaires et une plus grande expression rénale des gènes associés à la néphrotoxicité par rapport aux souris nourries avec de la nourriture. Les souris nourries avec l'AD ont développé une hypertrophie rénale plus sévère après la FAN, et les données d'expression génique suggèrent que le mécanisme de la FAN différait selon les régimes. Pendant ce temps, les souris nourries avec le WD avaient les plus grandes concentrations d'interleukine -6 circulante. Dans l'uIRI, aucune différence n'a été observée dans les lésions du tissu rénal entre les régimes ; cependant, les souris nourries avec le WD et l'AD ont montré des signes de réponse inflammatoire supprimée. Ensemble, nos données soutiennent l'hypothèse selon laquelle le régime alimentaire a un impact direct sur la gravité et la physiopathologie deun reinmaladieet est une variable expérimentale critique qui doit être prise en compte dans les études animales précliniques mécanistes.

Mots-clés : régime occidental ; Souris; aiguun reinblessure; qualité alimentaire; la nutrition

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1. Introduction

Le mode de vie est l'un des principaux contributeurs au bien-être général et influence de manière significative les résultats des maladies cardiovasculaires (MCV), quel que soit le risque génétique [1]. L'alimentation est une composante majeure du mode de vie, et une mauvaise alimentation et les maladies associées à l'alimentation représentent plus de huit des 30 principaux facteurs de risque de morbidité et de mortalité dans le monde [2]. Cependant, les mécanismes décrivant comment une mauvaise nutrition a un impact négatif sur la santé restent étonnamment flous.

Un obstacle majeur à la recherche sur la nutrition a été la difficulté de modéliser de manière inappropriée la nature complexe et multiforme des habitudes alimentaires humaines dans les études mécanistes précliniques sur les animaux. Les régimes Chow sont la source de nourriture la plus utilisée dans les études précliniques sur les rongeurs en raison de leur haute qualité nutritionnelle, de leur stabilité au stockage et de leurs coûts de fabrication relativement faibles. Composés de mélanges à base de céréales complétés par des huiles de haute qualité et des mélanges de vitamines/minéraux, les régimes chow sont de piètres représentations de la qualité nutritionnelle relativement faible signalée dans les sociétés développées. Cela a conduit à la création d'une variété de régimes induisant des maladies, dont la plupart se concentrent sur l'apport calorique élevé des pays développés et produisent de l'obésité et des dysfonctionnements métaboliques chez les animaux de type sauvage. Bien que l'obésité et les dysfonctionnements métaboliques restent des problèmes de santé majeurs dans le monde, les régimes hypercaloriques actuellement disponibles dans le commerce représentent une vision extrême et très étroite des insuffisances nutritionnelles complexes signalées dans les sociétés occidentales. Les effets physiologiques d'un nutriment donné dépendent souvent de l'existence et de l'abondance d'autres nutriments (tels que le rapport sodium-potassium [3,4]) et ces interactions ne sont pas prises en compte dans les régimes alimentaires induisant des maladies disponibles dans le commerce. Par conséquent, il est possible que l'approche réductionniste courante dans la recherche sur la nutrition ait involontairement entravé la traduction réussie des données mécanistes des rongeurs aux humains.

Pour tenter de résoudre ce problème, nous développons un nouveau régime américanisé (AD) qui comprend plusieurs des insuffisances nutritionnelles signalées chez les Américains [5]. L'AD est un régime à deux granulés composé d'un granulé à base de céréales et d'un granulé synthétique "sucré et salé". ]. Il est intéressant de noter qu'il a été suggéré que plusieurs des modifications nutritionnelles apportées à la MA ont un impact surun reinsantéde manière directe ou indirecte [7–10].Un reindysfonctionnementest l'une des principales causes de maladies cardiovasculaires et un résultat courant dans les maladies induites par l'alimentation telles queDiabèteethypertension. Des analyses récentes ont montré qu'une alimentation de mauvaise qualité augmente l'incidence desun reinblessureetmaladie[11] ; cependant, les mécanismes responsables restent flous. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si le régime alimentaire avait un impact significatif sur les résultats de deux modèles murins différents de lésions rénales.

2. Matériels et méthodes

2.1. Animaux et régimes

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Liberty et conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire [12]. Des souris C57Bl/6 mâles sevrées (3-âgées d'une semaine) ont été achetées au Jackson Laboratory et logées en groupe (3 à 5 souris par cage) avec une litière en rafles de maïs, un aliment standard pour rongeurs (Teklad Global 18 %, # 2018) et de l'eau du robinet filtrée au charbon. Après une période d'acclimatation de 1- semaine, les souris ont eu accès ad libitum à l'un des trois régimes : chow (Teklad Global 18 %, #2018, n=14), un régime occidental disponible dans le commerce ("WD, " #TD.88137, n=13), ou notre roman "AD" (n=14).

L'AD se compose de deux pastilles, appelées AD chow (TD.170651) et ADsyn thetic (TD.170698 et TD.170699). Le granulé AD chow est un granulé à base de chow modifié avec des vitamines liposolubles réduites (A, D et E) et des fibres insolubles (fibre détergente neutre). Le régime synthétique a été formulé pour inclure un excès de saccharose, de fructose, de graisses saturées, de cholestérol, d'acides gras polyinsaturés oméga-6, d'acides gras trans, de sodium et de phosphore tout en ayant une réduction du potassium et des acides gras polyinsaturés oméga-3 . Les acides gras trans ont été inclus dans la formulation car ils sont toujours consommés à partir de sources naturelles (comme le bœuf), mais l'inclusion dans le granulé ADsynthetic était bien inférieure à celle utilisée dans d'autres études précédentes [13-16]. L'inclusion de chaque nutriment était basée sur l'appariement de la différence en pourcentage de l'apport réel et recommandé chez les souris et les humains (illustré à l'annexe A, tableau A1) sur la base de rapports récents du ministère de l'Agriculture des États-Unis [5,12]. La composition en nutriments de chaque granule était basée sur la différence en pourcentage calculée entre les valeurs d'apport signalées et recommandées de chaque nutriment chez les Américains, et cette différence en pourcentage a ensuite été appliquée aux besoins en nutriments de la souris [13]. La formulation fifinale de chaque pastille a ensuite été ajustée pour tenir compte de la consommation quotidienne moyenne de 2 et 0,5 g d'AD synthétique et d'ADchow, respectivement. Une autre pastille synthétique, ADsythetic2, a été formulée pour s'adapter à un changement de préférence alimentaire au-delà de 8 semaines, où les souris consommaient des quantités approximativement égales (1,5 g) d'ADchow et d'ADsynthetic2 quotidiennement. Un résumé des régimes alimentaires utilisés dans cette étude est fourni dans le tableau 1.

2.2. Modèles murins d'insuffisance rénale aiguë (IRA)

Les souris sont restées sur leurs régimes expérimentaux pendant 12 semaines avant l'induction deun reinblessureavec des modèles de néphropathie induite par l'acide folique (FAN) ou de lésion d'ischémie-reperfusion unilatérale (uIRI). Ces modèles ont été choisis car ils sont couramment utilisés dans la littérature et induisent desun reinblessurede manière dose-dépendante [17]. Le modèle FAN a été réalisé sur la base de publications précédentes [18–21] avec des modifications. En raison des différences de poids corporel entre les groupes alimentaires, nous avons calculé la dose de 250 mg/kg pour la plus petite souris de notre étude (25 g) et avons administré la même dose (6,25 mg/500 µL) à toutes souris sous anesthésie brève à l'isoflurane (3 % dans 100 % d'oxygène, 600 mL/min). Les souris témoins (n ​​= 4 pour chaque régime) ont reçu un volume égal (500 µL) de véhicule de bicarbonate de sodium 0,3 mM que les souris recevant le FAN (n=4 pour chaque régime). Pour le modèle uIRI, des souris (n=5–6 pour chaque régime) ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et une incision du flanc a été faite et l'artère et la veine gaucheun reinont été isolés du tissu conjonctif et adipeux environnant et obstrués avec une pince microvasculaire. Après 45 min, la pince a été retirée et la restauration du flux sanguin a été visuellement confirmée. La musculature a été fermée avec une suture de soie 4.0 et l'incision cutanée a été fermée avec des agrafes chirurgicales. La température corporelle de surface a été maintenue à 28–30 ◦C avec une lampe chauffante et un coussin chauffant (température corporelle normale de surface ~ 30 ◦C). La buprénorphine (0,1 mg/mL, injection sous-cutanée de 100 µL) a été administrée comme analgésique une fois que l'animal a commencé à reprendre conscience.

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2.3. Euthanasie des animaux, analyse histologique et mesures sériques de la fonction rénale

Les animaux ont été euthanasiés 24 (uIRI) ou 48 h (FAN) plus tard par dislocation cervicale sous anesthésie brève à l'isoflurane. Le cœur a été prélevé et le sang du tronc a été prélevé, laissé à température ambiante pendant 10 min et centrifugé pendant 10 min à 2500 g. Le sérum a été prélevé et congelé à -80 °C jusqu'à ce qu'il soit analysé pour la créatinine (Crystal Chem), l'azote uréique du sang (BUN, Arbor Assays) ou l'interleukine -6 (IL6, Biolegend) à l'aide de dosages disponibles dans le commerce. Les reins ont été disséqués et décapsulés, et une section sagittale centrale a été fixée dans du formol tamponné au phosphate à 10 %, incluse dans de la paraffine, et des sections de 5 µm ont été coupées et colorées avec H&E ou Picro Sirius Red (ABCAM). Dans les coupes colorées par H&E, la gravité de la nécrose tubulaire aiguë a été évaluée par un individu aveugle au plan expérimental basé sur une échelle de 0 à 4, où (0) se réfère à aucune preuve de blessure, (1) est<25% of="" the="" identifiable="" tissue="" area="" consists="" of="" injury,="" (2)="" 25–50%,="" (3)="" 50–75%,="" and="" (4)="">75 pour cent. Semblable à des travaux antérieurs [22], la «lésion tubulaire» consistait en une dilatation tubulaire, des cylindres protéiques et un remodelage tubulo-interstitiel apparent. Le degré de fibrose tubulo-interstitielle a été évalué sur des coupes colorées au Picro Sirius.

2.4. Réseau PCR de néphrotoxicité

Environ 30 à 100 mg de morceaux de décapsuléun reintissuont été stockés dans une solution RNAlater™ (Thermo). Un seul échantillon représentatif de chaque groupe de régime dans l'étude FAN a été choisi qui ressemblait étroitement à la moyenne du groupe pour la créatinine sérique, l'urée et les scores histologiques dans chaque groupe de traitement. L'échantillon sélectionné a ensuite été traité pour quantifier l'expression de 84 gènes liés à la néphrotoxicité à l'aide du RT2 ProfilerTM PCR Array—Mouse Nephrotoxicity (#PAMM-094Z) tel que recommandé par le fabricant (Qiagen). L'ARN total a été isolé à l'aide du kit RNeasy®, l'ADN génomique a été éliminé par digestion d'ADN et 0,5 ug d'ARN total a été utilisé pour la synthèse d'ADNc à l'aide du kit RT2 First Strand. Le mélange d'ADNc a été mélangé avec le RT2 SYBR® Green Mastermix et de l'eau sans nucléase, puis appliqué sur la plaque RT2 et analysé comme recommandé à l'aide d'un instrument Lightcycler™ 96 (Roche). Les valeurs ∆Ct pour chaque groupe de traitement ont été calculées sur la base de l'expression des gènes domestiques à l'aide de l'équation suivante : 2ˆ (∆CT), où ∆CT=(ménage (GAPDH))-CT (gène d'intérêt)] . La différence en pourcentage d'expression par rapport aux souris témoins (souris nourries avec un véhicule de traitement) a été calculée pour chaque gène. Pour identifier les gènes potentiellement influencés par le FAN et l'alimentation, nous avons modifié l'analyse fournie par le fabricant (Qiagen). Les gènes avec une différence supérieure à 2- par rapport aux souris témoins ont été identifiés et à partir de cette liste, nous avons identifié les gènes avec une différence supérieure ou égale à 25 % entre les souris nourries avec le WD et l'AD. Six gènes ont été identifiés à l'aide de cette méthodologie et leur expression d'ARNm rénal a été quantifiée à l'aide de la RT-PCR conventionnelle en temps réel.

2.5. RT-PCR pour les gènes associés à la néphrotoxicité, à l'inflammation et au remodelage tissulaire

Les reins et les rates ont été traités pour la RT-PCR à l'aide de kits disponibles dans le commerce (Qiagen et BioRad) en suivant les recommandations du fabricant. Les amorces couvrant les introns pour les gènes impliqués dans la néphrotoxicité ou les marqueurs spécifiques des leucocytes ont été achetées auprès de BioRad ou créées à l'aide du logiciel Primer3 [23–25]. L'information sur l'amorce est fournie à l'annexe C, tableau A2. Ensuite, des réactions de RT-PCR de 10 µL ont été effectuées à l'aide de l'iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad) et les valeurs ∆CT ont été calculées pour chaque gène. Toutes les données sont présentées normalisées à la moyenne des groupes de contrôle pour chaqueun reinblessuremodèle (souris nourries avec un véhicule injecté pour FAN ou un rein controlatéral de souris nourries avec de la nourriture en IRI).

2.6. Analyses statistiques

Toutes les études ont été réalisées selon un plan complètement randomisé. Dans l'étude FAN, « Régime » et « Traitement » étaient les variables indépendantes, « Régime » ayant les 3 niveaux (chow, WD et AD) et « Traitement » ayant 2 niveaux (véhicule ou FAN). Des analyses similaires ont été utilisées dans l'étude uIRI, où le "traitement" a été déterminé en comparant les données d'expression génique dans le rein ischémique au rein témoin controlatéral non ischémique. Toutes les données ont été examinées avant l'analyse GLM et les valeurs aberrantes ont été identifiées à l'aide de la fonction Explorer et analysées à l'aide de procédures de modèle linéaire général dans SPSS (IBM). Les valeurs ont été considérées comme significatives avec p inférieur ou égal à 0.05 avec l'analyse Tukey Post Hoc, et une tendance a été définie comme p inférieur ou égal à 0,1.

3. Résultats

3.1. Une mauvaise alimentation exacerbe les lésions tissulaires dans le FAN

Les souris nourries avec le WD avaient le poids corporel total le plus élevé (37,4 ± 4,1 g) par rapport aux souris nourries avec l'AD (30.3 ± 1.0, p=0.{{ 17}}01) et des souris nourries avec de la nourriture (26,8 ± 1,1, p <{{20}}.001). l'adiposité="" différait="" également="" entre="" les="" groupes,="" où="" les="" souris="" nourries="" avec="" le="" wd="" avaient="" le="" poids="" de="" coussinet="" adipeux="" épididymaire="" le="" plus="" élevé="" (2,0="" ±="" {{30}},6="" g,="" p="">< 0.="" 001)="" par="" rapport="" aux="" souris="" nourries="" avec="" de="" la="" nourriture="" (0,4="" ±="" 0,08,="" p="">< 0,001)="" et="" l'ad="" (0,7="" ±="" 0,3,="" p="">< 0,001).="" l'augmentation="" du="" poids="" corporel="" et="" adipeux="" observée="" chez="" les="" souris="" nourries="" avec="" l'ad="" était="" également="" plus="" importante="" que="" chez="" les="" souris="" nourries="" avec="" de="" la="" nourriture="" (p="0" 0,001="" et="" p="">< 0,001,="" respectivement).="" les="" poids="" des="" tissus="" adipeux="" ne="" différaient="" pas="" entre="" les="" souris="" des="" groupes="" traités="" avec="" le="" véhicule="" ou="" fan="" (p="">

Fait intéressant, les souris nourries avec AD avaient les reins les plus lourds par rapport aux souris nourries avec de la nourriture (p <{0}}.001) et="" wd="" (p="" {{2="" }}.01)="" (tableau 2).="" le="" poids="" des="" reins="" ne="" différait="" pas="" entre="" les="" souris="" nourries="" avec="" de="" la="" nourriture="" ou="" wd="" (p="0.1)" et="" ces="" données="" étaient="" cohérentes="" lorsque="" le="" poids="" corporel="" était="" utilisé="" comme="" covariable="" (p="0.52)." la="" créatinine="" circulante="" (p="">< 0,001)="" et="" l'azote="" uréique="" (p="">< 0,001)="" étaient="" significativement="" élevés="" en="" réponse="" à="" la="" fan,="" mais="" ni="" l'un="" ni="" l'autre="" n'étaient="" significativement="" influencés="" par="" le="" régime="" alimentaire="" (p="0" 0,74="" et="" 0,67,="" respectivement).="" le="" régime="" alimentaire="" a="" cependant="" influencé="" de="" manière="" significative="" la="" gravité="" des="" lésions="" tissulaires="" évaluées="" par="" microscopie="" avec="" des="" souris="" nourries="" avec="" le="" wd="" (p="0.001)" et="" ad="" (p="0.004)" ayant="" des="" lésions="" tissulaires="" plus="" graves="" par="" rapport="" à="" souris="" nourries="" avec="" de="" la="" nourriture="" (tableau="" 2="" et="" figure="" 1).="" les="" caractéristiques="" histologiques="" prédominantes="" des="" lésions="" rénales="" étaient="" la="" dilatation="" tubulaire="" et="" la="" nécrose="" tubulaire="" aiguë,="" qui="" étaient="" plus="" graves="" et="" répandues="" dans="" tout="" le="" cortex="" chez="" les="" souris="" nourries="" avec="" ad="" et="" wd.="" aucune="" différence="" dans="" la="" fibrose="" rénale="" n'a="" été="" observée="" entre="" les="" groupes="" de="" régime="" dans="" les="" coupes="" colorées="" au="" picro="" sirius="" (annexe="" c,="" figure="" a1).="" fan="" a="" provoqué="" une="" augmentation="" significative="" (p="0.005)" de="" l'interleukine="" circulante="" -6="" (il6)="" qui="" a="" été="" encore="" exacerbée="" avec="" wd="" par="" rapport="" aux="" souris="" nourries="" avec="" ad="" (p="0.01)" et="" bouffe="" (p="0.006," tableau="" 2).="" de="" même,="" fan="" a="" provoqué="" une="" augmentation="" drastique="" de="" l'expression="" rénale="" de="" l'arnm="" de="" l'il6="" (p="">< 0,001)="" ;="" cependant,="" il="" n'y="" avait="" pas="" de="" différence="" significative="" entre="" les="" groupes="" de="" régime="" (p="">

3.2. Le régime alimentaire influence de manière significative l'expression rénale de l'ARNm des gènes néphrotoxiques et spécifiques aux leucocytes dans le FAN

Nous avons ensuite entrepris d'identifier les mécanismes potentiels responsables de l'exacerbation des lésions tissulaires chez les souris nourries avec le WD et l'AD. Des échantillons représentatifs de chaque régime alimentaire ont été sélectionnés et l'expression de 84 gènes associés à la néphrotoxicité a été criblée à l'aide d'un réseau PCR disponible dans le commerce (les données brutes sont présentées à l'annexe E, tableau A3). Par rapport aux souris nourries avec un véhicule, 57 gènes néphrotoxiques ont été identifiés comme ayant un changement d'expression supérieur à 50 % avec le FAN, et six d'entre eux ont été identifiés comme différant en fonction du régime alimentaire (annexe F, tableau A4). Sur les six gènes identifiés par le test de néphrotoxicité, l'expression rénale de Btg2 (p=0.03), Cdkn1a (p=0.01) et Spp1 (p=0.001) était significativement influencé par le régime alimentaire tel que déterminé par RT-PCR conventionnelle. Les souris nourries avec le WD avaient une plus grande expression de Btg2 et Spp1 par rapport aux souris nourries avec de la nourriture et l'AD, tandis que les souris nourries avec l'AD avaient une plus grande expression de Cdkn1a par rapport aux souris nourries avec de la nourriture et le WD (annexe F, tableau A4 et figure 2) . Nous avons également quantifié l'expression de l'ARNm rénal de 4 marqueurs spécifiques aux leucocytes (CD3e, CD19, CCR2 et Ly6G), qui ont tous été significativement influencés par le FAN (annexe F, tableau A4). Cependant, un régime n'a eu aucun effet significatif sur l'expression des marqueurs spécifiques des leucocytes dans le rein.

Nous avons précédemment montré que la rate influençait de manière significative l'immunopathologie des lésions rénales [26–28]. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si le régime alimentaire modifie l'expression de l'ARNm splénique des mêmes marqueurs spécifiques aux leucocytes dans FAN. FAN a provoqué une diminution significative de l'expression de l'ARNm splénique du marqueur de cellules T Cd3e (p=0.001) et du marqueur de cellules B Cd19 (p <0,001) (figure="" 3="" et="" annexe="" f,="" tableau="" a4).="" en="" ce="" qui="" concerne="" le="" régime="" alimentaire,="" les="" souris="" nourries="" avec="" l'ad="" avaient="" une="" expression="" d'arnm="" splénique="" plus="" faible="" de="" cd3e="" (p="0.01)" et="" cd19="" (p="0.009)" par="" rapport="" aux="" souris="" nourries="" avec="" de="" la="" nourriture,="" mais="" pas="" aux="" souris="" nourries="" avec="" le="" wd="" (p="" supérieur="" ou="" égal="" à="" 0,2).="" il="" n'y="" avait="" aucun="" effet="" significatif="" du="" régime="" alimentaire="" (p="0.8)" ou="" du="" fan="" (p="0.1)" sur="" l'expression="" splénique="" d'il6="" (données="" non="">

3.3. Le régime alimentaire influence de manière significative l'expression génique spécifique des leucocytes dans l'uIRI

Nous avons répété nos études sur l'alimentation dans le modèle uIRI pour évaluer la généralisabilité des données FAN. Malgré la différence significative d'adiposité entre les groupes de traitement diététique, il n'y avait aucune différence significative dans le temps chirurgical (~ 5 min) entre les groupes de traitement (p=0.5). Le régime alimentaire n'a eu aucun effet sur la gravité de la lésion tissulaire, déterminée par la quantification de H&E- (p=0.7, figure 4) ou de lames colorées Picro Sirius (annexe D, figure A2). Alors que les souris nourries avec AD avaient des poids de rein plus élevés dans l'étude FAN, il n'y avait qu'une tendance à ce qu'un régime influence le poids des reins (p=0.07) dans l'étude uIRI. Dans le rein controlatéral non ischémique, les souris nourries avec de la nourriture avaient des poids de rein numériques inférieurs (160 ± 22 mg) par rapport aux souris nourries avec AD (168 ± 14) et WD (186 ± 15). Des tendances numériques similaires ont été observées dans les reins ischémiques où les souris nourries avec de la nourriture (173 ± 24 mg) ou les souris nourries avec AD (170 ± 12) avaient un poids numérique des reins inférieur à celui des souris nourries avec le WD (195 ± 32). Ces données suggèrent que l'effet du régime alimentaire sur le poids des reins avec lésion dépend du modèle utilisé.

Tous les gènes néphrotoxiques et spécifiques aux leucocytes quantifiés dans les reins ont été significativement influencés par l'uIRI, à l'exception de Cd3e (p=0.1, annexe G, tableau A5). Cependant, aucun des gènes néphrotoxiques identifiés dans l'étude FAN n'a été significativement influencé par l'alimentation. En ce qui concerne l'expression des gènes spécifiques aux leucocytes, l'effet de l'uIRI sur l'expression rénale de l'ARNm de Cd19 dépendait fortement de l'alimentation (p=0.008), les souris nourries avec le WD et l'AD ayant environ quatre fois expression rénale Cd19 plus élevée après uIRI par rapport aux souris nourries avec de la nourriture (Figure 5). Les souris nourries avec de la nourriture avaient également tendance à avoir une plus grande expression rénale de Ly6g après uIRI (p=0.06, annexe G, tableau A5). Fait intéressant, les souris nourries avec le WD (p=0.006) et l'AD (p=0.004) avaient des concentrations d'IL6 circulantes significativement plus faibles par rapport aux souris nourries avec de la nourriture (Figure 5).

Le régime alimentaire a affecté de manière significative l'expression de l'ARNm splénique de Cd19 (p=0.008), Ccr2 (p =0.004) et Ly6g (p {{7} }.03) suivant uIRI (Figure 6 et Annexe G Tableau A5). Les souris nourries avec de la nourriture avaient l'expression splénique la plus élevée de ces marqueurs, avec Ccr2 que les souris nourries avec le WD (p=0.02) et AD (p=0.005), l'expression de Cd19 étant significativement plus élevée que les souris nourries l'AD (p=0.007), mais pas WD (p=0.4), et une plus grande expression de Ly6g que les souris nourries avec l'AD (p=0.04) et une tendance à une plus grande expression chez les souris nourries avec le WD (p=0.07). Il n'y avait aucune différence dans l'expression des marqueurs spécifiques aux leucocytes entre les souris nourries avec le WD ou l'AD (p=0.9, 0,8 et 0,1 pour Ccr2, Cd19 ou Ly6g, respectivement.

4. Discussion

Ici, nous présentons des données montrant l'effet du régime alimentaire sur la gravité et l'immunopathologie de la maladie rénale dans des modèles précliniques de souris. Les souris nourries avec le WD et l'AD avaient toutes deux des degrés élevés de lésions tissulaires et une expression différentielle des gènes néphrotoxiques après FAN par rapport aux souris nourries avec de la nourriture. Les souris nourries avec le WD, mais pas avec l'AD, avaient également des niveaux circulants significativement plus élevés d'IL6 après FAN. Dans l'uIRI, nous n'avons pas observé d'effet significatif du régime alimentaire sur la gravité des lésions tissulaires ou sur l'expression rénale de gènes néphrotoxiques similaires. Cependant, nous avons observé une réduction significative de l'IL -6 circulante et de l'expression de gènes spécifiques aux leucocytes dans le rein et la rate de souris nourries avec le WD et l'AD. Prises ensemble, ces données suggèrent que le régime alimentaire influence de manière significative l'immunopathologie de deux modèles murins distincts de lésions rénales.

Il existe étonnamment peu d'études traitant de l'effet du régime alimentaire sur les résultats des lésions rénales. Les souris C57Bl/6 nourries avec un régime riche en graisses pendant 9 semaines présentaient des lésions rénales induites par le cisplatine plus graves que les souris nourries avec de la nourriture [29]. Il convient de noter que la dose de cisplatine dans cette étude était basée sur le poids corporel et que les souris riches en graisses recevaient une quantité absolue plus élevée de cisplatine. Il s'agit d'une complication courante dans les études sur l'alimentation et c'est la raison de notre administration du même volume et de la même quantité absolue d'AF à toutes les souris.

Alors qu'il existe un nombre limité d'articles décrivant l'effet du régime alimentaire sur les résultats de la maladie rénale, il existe une littérature appréciable décrivant l'effet du diabète sur la susceptibilité et la progression des lésions rénales chez les rongeurs [30–33]. Des études en cours (non publiées) dans notre laboratoire suggèrent que les souris nourries avec le WD et l'AD ont un apport calorique quotidien plus élevé (16 et 15 kcal/jour, respectivement) par rapport aux souris nourries avec de la nourriture (12 kcal/jour). Fait intéressant, seules les souris nourries avec le WD présentent des signes de résistance à l'insuline, avec une hypoglycémie à jeun (120.3 mg/dL) observée dès 8 semaines après le début du régime et développant une multiplication par quatre de l'insuline circulante à jeun ( 4,2 ng/mL) après 24 semaines. Les souris nourries avec de la nourriture et l'AD ont une glycémie à jeun presque identique (166 et 167 mg/dL, respectivement) et des taux d'insuline (0,6 et 1,0, respectivement) à des moments similaires. Compte tenu de la cinétique de ces données, nous pensons que l'AD modélise avec succès des insuffisances nutritionnelles modérées et est dépourvue de dysfonctionnement métabolique dans la période de l'étude actuelle, alors que les souris nourries avec le WD développaient probablement une résistance à l'insuline.

Previous work has shown diabetic mice have altered renal hemodynamics [30], exacerbated inflflammatory response [31,32], and altered expression of cell-cycle regulators [33] following kidney injury. Interestingly, we also observed alterations in the immune response and cell-cycle regulators in both WD- and AD-fed mice. Regarding the immune response, mice fed the WD had greater circulating IL6 concentrations than mice fed chow and the AD. This suggests that the overt obesity and developing metabolic dysfunction that is likely developing in the WD-fed mice exacerbates the immune response in FAN. We did not observe a signifificant increase in renal or splenic mRNA expression of IL6 in either the FAN or uIRI model suggesting another tissue source (perhaps the liver [34]) is responsible. The spleen is a reservoir of deployable leukocytes [35,36] and we have previously shown the spleen to play a signifificant role in the pathophysiology of kidney injury with splenic size being inversely correlated with kidney injury [26–28]. Mice fed the WD and AD had a>Réduction de 30 % de l'expression des marqueurs leucocytaires dans la rate, ce qui pourrait être interprété comme un déploiement accru des leucocytes de la rate. Cela suggérerait une augmentation de l'inflammation chez les souris nourries avec le WD et l'AD ; cependant, les données circulantes sur l'IL6 ne soutiennent cette hypothèse que chez les souris nourries par WD. Des études supplémentaires avec cytométrie en flux et une caractérisation plus large des chimiokines et des cytokines en circulation sont nécessaires pour mieux comprendre comment le régime alimentaire influence l'immunologie et la physiopathologie du FAN.

En ce qui concerne les régulateurs de la progression du cycle cellulaire, le régime alimentaire a également influencé de manière significative l'expression de l'ARNm de Btg2 et Cdkn1a (p21) après FAN. Des études knock-out suggèrent un rôle protecteur pour Cdkn1a dans les maladies rénales (examinées dans [37]) et l'expression de Btg2 s'est également avérée augmentée dans le rein ischémique, mais pas controlatéral [38]. Cependant, la fonction et l'importance de la régulation à la hausse de Btg2 dans les lésions et les maladies rénales n'ont pas été déterminées. Btg2 est un effecteur en aval de NFκB et des régulateurs du cycle cellulaire p53 et p19 qui entraînent le blocage du cycle cellulaire en utilisant divers mécanismes cellulaires (revu dans [39]). Ensemble, la littérature actuelle suggère que les inhibiteurs du cycle cellulaire sont bénéfiques pour réduire les lésions rénales initiales, mais peuvent également améliorer, voire faciliter, la progression ultérieure vers des formes plus chroniques de la maladie [37,38,40–43]. La différence d'expression de Btg2 et de Cdkn1a chez les souris nourries avec le WD et l'AD suggère que l'obésité morbide et les insuffisances nutritionnelles influencent la physiopathologie des lésions rénales via différents mécanismes cellulaires et peuvent avoir des résultats à long terme différents. De plus, les différences d'expression de Btg2 et de Cdkn1a peuvent contribuer à l'hypertrophie rénale observée dans le modèle FAN. Il a été démontré que le modèle FAN induisait une hypertrophie rénale aiguë [20, 21], et que l'AD avait une composition minérale alimentaire qui induisait également une hypertrophie et des lésions rénales chez le rat [44, 45]. Par conséquent, il est possible que la teneur en minéraux altérée (en particulier le calcium et le phosphore) dans la MA soit responsable de l'exacerbation de l'hypertrophie rénale dans la FAN. Des études futures sont nécessaires pour vérifier cette spéculation et si Btg2 et Cdkn1a sont impliqués.

Nous avons également constaté que l'expression rénale de l'ARNm de Spp1 était significativement influencée à la fois par le FAN et le régime alimentaire, avec une expression plus élevée chez les souris nourries avec le WD par rapport aux souris nourries avec de la nourriture, mais pas avec AD. Spp1 (ostéopontine) est une glycoprotéine normalement sécrétée dans l'urine et fortement exprimée dans les reins, en particulier dans le néphron cortical distal. Spp1 joue un rôle clé dans la régulation de la formation et du dépôt de cristaux de calcium dans les tubules rénaux [46–49], un processus qui dépend de l'alimentation, des œstrogènes et du FGF23 [7,50,51]. Elle est généralement régulée à la hausse après une lésion rénale [52] ; Cependant, le rôle de Spp1 dans les lésions rénales ischémiques n'est pas clair et d'autres études sont nécessaires pour élucider la signification physiologique de son expression accrue avec l'adiposité et la maladie.

Nous avons également évalué les résultats dans un modèle de lésion d'ischémie-reperfusion unilatérale. Nous n'avons pas observé de changements dans l'histologie ou l'expression de l'ARNm des gènes associés à la néphrotoxicité identifiés dans l'étude FAN dans notre modèle uIRI. L'absence de différence dans l'expression rénale de Btg2 et de Cdkn1a dans l'étude uIRI peut expliquer pourquoi l'hypertrophie rénale n'a pas été observée chez les souris nourries avec l'AD dans l'étude FAN. Cependant, le régime alimentaire a eu des effets sur l'expression de marqueurs immunitaires dans les reins et la rate. L'expression rénale du marqueur des lymphocytes B CD19 a plus que doublé chez les souris nourries avec le WD et l'AD par rapport aux souris nourries avec de la nourriture. La signification de cette découverte n'est pas claire, car le rôle des lymphocytes B dans les modèles murins d'IRA ischémique est complexe et les résultats dépendent de plusieurs facteurs (sous-type, classe d'anticorps, etc.) [53–56]. Le régime alimentaire a également influencé de manière significative l'expression de l'ARNm des marqueurs immunitaires dans la rate (Ccr2, Cd19 et Ly6g), où les souris nourries avec le WD et l'AD avaient une expression plus faible que les souris nourries avec de la nourriture. Comme mentionné ci-dessus, cela pourrait être interprété comme un déploiement accru de leucocytes de la rate et une exacerbation de la réponse immunitaire systémique chez les souris nourries avec le WD et l'AD. Cependant, la suppression de l'IL6 circulant chez les souris nourries avec le WD et l'AD suggérerait un effet immunosuppresseur de ces régimes dans le modèle uIRI. Différents mécanismes moléculaires de lésions cellulaires dans des modèles de maladie rénale ont été décrits [57–59], et notre étude suggère que l'alimentation peut modifier ces mécanismes. Des études supplémentaires sont nécessaires pour vérifier cette spéculation et déterminer comment l'alimentation modifie de manière significative la réponse inflammatoire et les voies de mort cellulaire impliquées dans les lésions rénales.

Il y a des limites à prendre en compte lors de la comparaison de nos données avec d'autres dans la littérature, en particulier dans les études uIRI. Nous avons choisi un modèle unilatéral pour réduire les complications que nous avons rencontrées tout en isolant le système vasculaire rénal du tissu adipeux excessif chez les souris nourries avec WD et AD. Par conséquent, les mesures sériques de la fonction rénale n'ont pas été quantifiées dans les études uIRI étant donné la présence d'un rein controlatéral sain et non ischémique. Nous avons également utilisé l'anesthésie à l'isoflurane car les souris obèses ne toléraient pas le mélange anesthésique kétamine/xylazine couramment utilisé dans ce modèle [60]. Il a été démontré que l'isoflurane réduisait les lésions rénales dans l'IR [61] et exigeait que nous augmentions notre temps ischémique de 30 à 45 minutes pour obtenir les dommages observés. Ces expériences ont suscité des inquiétudes quant aux résultats de nos études uIRI et ont justifié notre concentration sur le modèle FAN. Il est également important de souligner que les changements dans l'expression des gènes ne correspondent pas à des changements dans la production de protéines, et des études supplémentaires sont nécessaires pour valider les changements dans l'abondance des protéines et les changements ultérieurs dans la santé et la fonction cellulaires.

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5. Conclusions

En conclusion, nous présentons des données soutenant l'importance du régime alimentaire sur la susceptibilité aux lésions rénales. Nos résultats suggèrent qu'un régime créé pour modéliser le 50e centile de l'apport en nutriments chez les Américains est suffisant pour aggraver les lésions rénales chez les rongeurs à un degré similaire à celui observé dans un WD disponible dans le commerce. Nos données suggèrent également un lien mécaniste entre la nutrition, l'inflammation et la régulation du cycle cellulaire dans l'immunopathologie des lésions rénales qui modifie considérablement les résultats de la maladie. Dans l'ensemble, notre étude met en évidence la nécessité d'accroître l'appréciation et la prise en compte de la nutrition dans les études animales mécanistes précliniques.

Les contributions de l'auteur:

Conceptualisation, JCG ; méthodologie, JCG, JFH, JEB, RL ; analyse formelle, JCG ; enquête, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH ; ressources, JCG, JFH ; conservation des données, JCG, JFH ; rédaction—préparation du brouillon original, JCG, JFH ; rédaction—révision et édition, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; supervision, JCG, JFH ; gestion de projet, JCG, JFH ; financement acquisition, JCG Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:

Cette recherche a été soutenue par des subventions internes de la Liberty University et du Liberty University College of Osteopathic Medicine, une subvention de l'American Osteopathic Association (subvention #19133749) et une subvention des National Institutes of Health (1R01DK113632-01A1) .

Déclaration du comité d'examen institutionnel :

L'étude a été menée conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [8] et approuvée par l'Institutional Animal Care and Use Committee of Liberty University (#49.190710, 11 juillet 2019).

Remerciements :

Nous tenons à remercier Jessica Flowers, de Teklad Diets (Envigo) pour son aide à la création de l'AD et de l'Université de Virginie Histology Core Facility pour leurs services d'histologie.

Les conflits d'intérêts:

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Extrait de : "Le régime alimentaire influence de manière significative l'immunopathologie et la gravité des lésions rénales" parJohn E. Brus, et al

---Nutriments 2021, 13, 1521