Cistanche alimentaire atténué les dommages aigus à l'iléon du canard

Résumé : L'aflatoxine B1 (AFB1) est un métabolite toxique stable menaçant la santé des humains et des animaux et des aliments pour animaux et humains largement contaminés. Cette présente étude visait à étudier les effets decistanche diététiquesur les lésions de l'iléon chez les canards induites par l'administration d'AFB1 et explorent ses mécanismes sous-jacents. Des canards (N=450, mâle d'un jour) de poids similaire ont été répartis au hasard en 3 groupes, contenant le groupe témoin, le groupe AFB1 (60 µg AFB1 kg−1 de poids corporel) et le cistanche (500 mg régime cistanche kg−1) plus groupe AFB1. L'administration d'AFB1 a considérablement augmenté les dommages à l'iléon, les adduits d'ADN AFB1-dans le plasma, ainsi que le stress oxydatif et l'inflammation. L'ajout de cistanche dans l'alimentation a protégé l'iléon contre les dommages morphologiques induits par l'administration d'AFB1, a diminué les adduits d'ADN AFB1-dans le plasma et a éliminé le stress oxydatif et l'inflammation dans l'iléon des canards.Anti-oxydationetanti-inflammatoire effets de cistanchepourrait protéger l'iléon contre les dommages aigus en activant la voie de signalisation Nrf2-ARE et en inhibant la voie de signalisation NF-κB. En conclusion,cistancheétait un régimeanti-oxydationetlutte contre l'inflammationvia l'activation de la voie de signalisation Nrf2-ARE et l'inhibition d'un dommage aigu de la voie de signalisation NF-κB induit par l'administration d'AFB1.

Mots clés:cistanche; iléon aigu; AFB1-adduits à l'ADN ; Nrf2-SONT ;

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1. Introduction

La viande est une source importante de protéines de haute qualité pour l'alimentation humaine. La viande de canard est abondamment consommée dans le monde, notamment en Asie en raison de ses caractéristiques nutritionnelles recherchées [1]. Par conséquent, l'élevage de canards a attiré l'attention des gens. Pour les canards, il existe divers inconvénients dans le processus d'élevage, tels que l'AFB1 qui menacent la santé des canards. L'aflatoxine B1 (AFB1) est l'un des métabolites toxiques de table produits par les espèces d'Aspergillus. AFB1 est reconnu comme le plus toxique parmi les groupes d'aflatoxines (AF), avec un assortiment d'effets toxiques pour menacer la santé des humains et des animaux [2].

Pour les personnes ou les animaux, l'alimentation humaine ou animale est un moyen courant et important d'exposition à l'AFB1, mais l'inhalation et le contact direct avec la peau ou les muqueuses sont également comptés et non ignorés [3]. Des études antérieures ont prouvé que l'AFB1 exerce une toxicité puissante, très complexe et forte, entraînant un retard de croissance, des malformations biologiques, une toxicité hépatique, des troubles du tube digestif et même un cancer [4,5]. L'AFB1 obtenu par contact avec des aliments ou des muqueuses a eu des effets négatifs sur les systèmes respiratoires, le système digestif et les tissus et les performances de croissance [3,6,7]. Dommages tissulaires et organiques induits par l'administration d'AFB1 liés au stress oxydatif et à l'inflammation. L'administration d'AFB1 a marqué une augmentation de la teneur en adduits d'ADN d'AFB1-dans l'organe lésé [8]. L'absorption et la conversion des nutriments et des toxines se sont produites dans l'estomac et l'intestin grêle, de sorte que le petit

Le système immunitaire de la muqueuse intestinale est la première ligne pour protéger les corps contre les blessures [9]. La fonctionnalité et la morphologie du tractus gastro-intestinal sain pourraient être détruites par des facteurs défavorables tels que des substances toxiques, des bactéries et des virus [10,11]. L'AFB1 induit la destruction de la structure intestinale, se manifestant par l'excrétion de cellules épithéliales dans les villosités jéjunales et l'infiltration de cellules lymphocytaires dans l'intestin du poulet [12,13]. La fonctionnalité et la morphologie de la variation peuvent être attribuées au processus de métabolisme des toxines qui s'accompagne souvent d'une inflammation par le stress oxydatif. Il est urgent de trouver un antidote pour réduire et minimiser la menace de l'AFB1 pour les personnes et les animaux.

Par conséquent, l'AFB1 est l'une des principales préoccupations de l'industrie avicole en raison de sa puissante toxicité. cistanche est une sorte de composant polyphénol présent dans les rhizomes de curcuma (Cur cuma Longa Linn) en tant qu'additif alimentaire fonctionnel utilisé dans l'alimentation du bétail [14], et largement utilisé

comme épice verte et naturelle, colorant, conservateur et arôme dans l'industrie alimentaire. Des extraits de plantes comme le cistanche contenant des polyphénols ont amélioré l'immunité de l'organisme [15]. cistanche joue un rôle clé contre les conditions et les activités pathologiques médiées par le stress oxydatif lorsqu'il est utilisé comme thérapie pour le traitement et la prévention des maladies chroniques [16,17]. Les essais cliniques ont indiqué que le cistanche n'a pas d'effet toxique ou secondaire grave, et avec des propriétés anti-cancérigènes et anti-toxicogènes, ce qui a conduit au cistanche en tant qu'agent chimiopréventif attrayant contre les lésions tissulaires induites par les BAAR [18–20]. La littérature a démontré que le cistanche a la capacité d'anti-inflammation, d'anti-apoptose et d'antioxydation en activant la voie Nrf2/HO-1, la capacité antiox régulée à la hausse pour éliminer l'inflammation et le stress oxydatif dans le corps et éliminer l'AFB1-induit stress oxydatif [21–25]. cistanche a supprimé le stress oxydatif et la formation d'inflammasomes en activant Nrf2-ARE et en inhibant la voie de signalisation NF-κB dans le démonage du rein résiduel [26], propriété anti-oxydante et anti-inflammatoire. De plus, le cistanche alimentaire a significativement amélioré la capacité antioxydante des poulets de chair [27] et des canards [28]. Aucune tentative n'a été faite pour corréler le rôle du cistanche dans la voie de signalisation Nrf2-ARE et NF-κB et dans le modèle animal d'administration aiguë d'AFB1.

Cette étude a mis en lumière cette question et a fourni une base théorique pour le cistanche en tant qu'additif alimentaire pour protéger la santé des canards contre l'administration d'AFB1 et réduire les pertes économiques des industries de l'alimentation et de l'élevage causées par la pollution par l'AFB1.

2. Matériels et méthodes

2.1. Produits chimiques

cistanche a été acheté auprès de Nanjing Nutri-herb Biotech Co., Ltd. (Nanjing, Jiangsu, Chine, CAS : 458-37-7), sa pureté était supérieure à 98 % par analyse HPLC. L'AFB1 (pureté supérieure ou égale à 98 %, N° CAS 1162-65-8) a été acheté auprès de Shanghai Yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Les anticorps utilisés dans cette étude ont été achetés auprès de Bey time Biotechnology, Shanghai, Chine, y compris GAPDH (numéro de catalogue : AG019), Nrf2 (numéro de catalogue : AF7623), Phospho-NF-κB p65 (Ser276) (numéro de catalogue : AF5875), HRP étiqueté Goat Anti-Lapin IgG (H plus L) (numéro de catalogue : A0208) et HRP-labeled Goat

IgG anti-souris (H plus L) (numéro de catalogue : A0216).

2.2. Canards et élevage

Le protocole expérimental a été réalisé conformément aux pratiques décrites dans le Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agriculture Research and Teaching of Northeast Agricultural University (numéro de protocole : NEAU-[2011]-9).

Des canards (n {{0}}, mâle d'un jour Anas platyrhynchos, 33,8 ± 0,2 g) sans différence de poids significative ont été achetés dans un couvoir commercial et répartis au hasard en 3 groupes (tableau 1), avec 10 répliquer les enclos (cages) par groupe et 15 canards par enclos pendant 70-jour

essai d'alimentation. Les régimes de base ont été formulés selon le National Research Council (1994). Les canards des groupes T0 et T0 plus AFB1 ont reçu un régime de base maïs-soja (tableau 2), les canards du groupe T500 plus AFB1 ont reçu le régime de base complété par 500 mg de

cistanche kg−1 de régime (T500) un essai de 70-jours. Au cours des 70 jours, des canards de poids corporel similaire dans les groupes T0 plus AFB1 et T500 plus AFB1 ont reçu 60 µg d'AFB1 kg−1 de poids corporel, et les canards du groupe T0 ont reçu le même volume de solution PBS. Les canards ont été nourris à la base expérimentale d'Acheng de l'Université agricole du Nord-Est et ont eu accès à volonté à de l'eau et à des aliments en poudre. Quinze canards de poids corporel similaire (1,4 ± 0,3 kg) de chaque groupe ont été sélectionnés et ont jeûné pendant 12 h, puis ont donné une solution de PBS aux canards du groupe T0 et 60 µg d'AFB1 kg−1 de poids corporel aux canards de T0 plus AFB1 et T500 plus groupes AFB1 en même temps. Après 12 h, les quinze canards de chaque groupe devaient obtenir des échantillons de canard.

2.3. Collecte d'échantillons

Des échantillons de sang (10 mL) ont été obtenus à l'aide de tubes d'héparine provenant de veines d'ailes de canard et centrifugés à 1000 × g pendant 15 min à 4 ◦C. Le plasma obtenu a été immédiatement séparé et stocké à -80 ◦C pour analyse. Les canards ont été anesthésiés par inhalation d'éther et tués pour obtenir de l'iléon. L'iléon a été lavé 3 fois dans du PBS, immédiatement, et stocké individuellement dans un réservoir d'azote liquide puis à -80 ◦C pour qRT-PCR et analyse de la capacité antioxydante. Ensuite, environ 0,125 cm3 d'iléon ont été obtenus et placés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour la section des tissus et environ 1 mm3 d'iléon ont été placés au microscope électronique.

solution à 4 ◦C pour une observation ultrastructurale ultérieure.

2.4. Dosage des niveaux d'antioxydants dans le plasma

Les taux plasmatiques de superoxyde dismutase totale (T-SOD), de glutathion peroxydase (GSH Px), de glutathion S-transférase (GSH-ST) et de malondialdéhyde (MDA) ont été mesurés par des kits de dosage (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine) , respectivement, avec

Spectrophotomètre UV-VIS (UV1100, MAPADA, Shanghai, Chine).

2.5. Dosage des niveaux d'adduits d'ADN1-AFB dans le plasma

La génération d'adduits d'ADN1-AFB dans le plasma a été déterminée à l'aide de kits ELISA conformément aux spécifications du kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nan jing, Chine).

2.6. Dosage de la capacité antioxydante dans l'iléon

L'iléon (100.00 mg) a été dévolu et mélangé dans 0,9 mL de solution saline physiologique d'AVC (4 ◦C, 0,9 % de NaCl, pH=7.2 –7,4) pour obtenir 10 % d'iléon/homogénat SPSS. L'activité ou la teneur en superoxyde dismutase totale (T-SOD U/mg de protéine), en Glu glutathion réducteur (GSH-PX µmol/mg de protéine), en glutathion S-transférase (GSH-ST U/mg de protéine) et en malondialdéhyde (MDA nmol/ mg de protéine) dans l'iléon ont été évalués à l'aide de kits de dosage (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine), respectivement, avec un appareil UV-VIS

spectrophotomètre (UV1100, MAPADA, Shanghai, Chine).

2.7. Isolement d'ARN et réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR)

L'ARN total de l'iléon de canard (100.00 mg) a été isolé à l'aide d'un kit de réactifs (TaKaRa, Japon) selon le protocole recommandé par les fabricants. La concentration et la pureté de l'ARN total ont été détectées au rapport A260/A280 avec un spectrophotomètre (IMPLEN, Allemagne). 1 µg d'ARN total dans chaque échantillon a été converti en ADNc avec un kit de réactifs Prime Script™ RT avec gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, Chine) selon

au protocole recommandé par les fabricants. L'ADNc obtenu à partir de chaque iléon de canard a été utilisé comme matrice pour un kit TB Green™ Premix Ex Taq™ (TaKaRa, Dalian, Chine) RT-PCR (qRT-PCR). Le numéro d'accession génétique des canards a été obtenu auprès du NCBI et

les amorces de gène de canard ont été synthétisées par Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Chine) (tableau 3). L'expression génique pertinente dans l'iléon du canard a été déterminée par l'appareil thermocycleur Quanta gene Q225. Le qRT-PCR a été exécuté dans Monad Selected Real-Time

Système PCR (instrument de PCR en temps réel ABI 7500 (USA)) circulant à la condition : un cycle à 95 ◦C pendant 30 s, 40 cycles à 95 ◦C pendant 5 s et à 60 ◦C pendant 30 s. Le rapport relatif d'expression génique de l'ARNm de détection a été détecté à l'aide de la méthode 2−∆∆Ct et normalisé par rapport à l'expression de l'actine.

2.8. Western blot

L'iléon de canard a été pulvérisé et lysé dans un tampon RIPA contenant 1 mmol/L de PMSF (Beyotime, Shanghai, Chine) dans la glace. La concentration totale de protéines de l'iléon a été déterminée par un kit de dosage de l'acide bicinchoninique (BCA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). 12 pour cent et 10 pour cent de gel SDS-polyacrylamide pour l'électrophorèse ont été

utilisé pour obtenir des protéines cibles avec différents poids moléculaires. Ensuite, les protéines cibles ont été transférées sur une membrane de polyvinylidène-difluorure (PVDF) (Beyotime, Shanghai, Chine) pour des transferts avec un appareil de transfert trans. La membrane PVDF a été lavée 3 fois pendant 10 min à chaque fois dans du PBST 1 × puis bloquée 2 h dans du lait écrémé à 5 %. La membrane PVDF a été à nouveau lavée 3 fois et incubée avec les anticorps primaires GAPDH, Nrf2 et P-P65 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine) pendant 8 à 12 h à 4 ◦C, respectivement. Le lendemain, la membrane de PVDF a été à nouveau lavée 3 fois et incubée avec l'anticorps correspondant marqué à la peroxydase de raifort à 37 °C pendant 1 h, puis lavée à nouveau 3 fois.

Les bandes de protéines cibles ont été détectées et visualisées sous l'action du kit de détection de fluorescence améliorée BeyoECL Star (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine). Les images de blots ont été enregistrées et analysées par la plateforme d'imagerie Essential V6 (UVITEC, Cambridge,

Angleterre). La protéine GAPDH a servi de protéine de contrôle interne. Tous les résultats de l'expérience ont été répétés en triple. Les expressions relatives des protéines cibles ont été exprimées sous la forme du rapport des intensités de bande des protéines à GAPDH.

2.9. Analyses statistiques

Les données expérimentales ont été obtenues au moins six fois et chaque échantillon a été mesuré trois fois. Analyse des données de recherche à l'aide du test T pour échantillons indépendants par SPSS (version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis) avec 5 % La probabilité d'erreur et la signification statistique étaient p <{{4} }.05 dans cette étude