L'échinacoside favorise la prolifération des cellules épithéliales tubulaires rénales humaines en bloquant la voie de signalisation NF-κB médiée par HBX/TREM2

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHanG, QinFanG Wu, liMin ZHonG, donGWei GonG

Résumé.

La protéine du virus X de l'hépatite B (HBX) est nécessaire à la réplication du VHB et joue un rôle dans la progression de l'hépatite chez l'homme. Cependant, la fonction sous-jacente de HBX au cours de la glomérulonéphrite chronique induite par le VHB (VHB-Gn) est inconnue. (échinacoside de cistanche)(ecH) est un glycoside phényléthanoïde du genre Cistanche, qui possède de fortes activités anti-apoptose et neuroprotectrices. dans la présente étude, la fonction de HBX et la relation entre HBX et ecH dans les cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (rTecs ; lignée cellulaire HK-2) ont été explorées. Des analyses Pcr quantitatives par transcription inverse et Western blot ont été utilisées pour quantifier les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines de HBX dans les cellules HK-2, respectivement. Le kit de comptage de cellules-8 a été réalisé pour analyser la prolifération cellulaire. L'analyse par cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer le taux d'apoptose. HBX a montré des effets antiprolifératifs et proapoptotiques dans les cellules HK-2 et était positivement associé au récepteur déclencheur exprimé sur l'expression de la cellule myéloïde 2 (TreM2). De plus, ECH a perturbé la fonction de HBX dans les cellules HK -2, fonctionnant comme un suppresseur de HBX. De plus, un inhibiteur spécifique de NF-κB, PdTc, a été utilisé pour examiner plus en détail la relation entre HBX et nF-κB. Les résultats suggèrent que le nF-κB était impliqué dans la voie de signalisation HBX/TreM2 et régulait négativement l'expression de TreM2 dans RTECS. La présente étude a fourni de nouvelles informations sur la fonction de HBX et a également indiqué la valeur potentielle de l'ECH en tant qu'agent thérapeutique pour le VHB-Gn.

Introduction

Le virus de l'hépatite B (VHB) est un virus Hepadnaviridae, qui provoque une hépatite aiguë et chronique chez l'homme (1). Le VHB provoque non seulement une infection persistante ou transitoire du foie, mais infecte également les tissus extrahépatiques, notamment le pancréas, les voies biliaires, le système lymphoïde et les reins (2). De plus, l'infection par le VHB est étroitement associée à la glomérulonéphrite chronique (VHB-Gn) ; cependant, les mécanismes moléculaires du VHB au cours du VHB-Gn ne sont pas complètement compris (3,4).

La protéine régulatrice du virus X de l'hépatite B (HBX) du VHB est nécessaire à la réplication du VHB (5,6). un certain nombre d'études ont rapporté que le HBX favorise la prolifération cellulaire au cours de l'hépatocarcinome associé à l'infection par le VHB (7-9). Les cellules épithéliales tubulaires rénales humaines (rTecs) constituent une partie importante de l'interstitium tubulaire rénal et jouent un rôle actif dans l'inflammation rénale (10). L'apoptose rTec est étroitement associée au dysfonctionnement de l'interstitium tubulaire, qui conduit ensuite à la progression du VHB-Gn (10). HBX est principalement exprimé dans les cellules rTec et provoque l'apoptose de rTec et des lésions du tube rénal chez les patients atteints de VHB-Gn (11,12). De plus, il a été rapporté que HBX supprime la prolifération des rTecs de rat (13) et la surexpression de HBX accélère la progression du cycle cellulaire de la phase G1 à la phase S dans les rTecs primaires, conduisant à l'arrêt du cycle cellulaire en phase S (14). Par conséquent, l'identification d'un inhibiteur de HBX peut fournir une nouvelle thérapeutique pour le VHB-Gn. Cependant, le réseau moléculaire précis de HBX dans les rTecs humains n'est pas complètement compris.(échinacoside de cistanche)(ecH) est un composé naturel extrait deCistancheplantes, qui présente des effets anti-apoptotiques et anti-inflammatoires (15,16). Une étude précédente a rapporté que l'ecH induit la prolifération et empêche l'apoptose des cellules épithéliales intestinales (17). De plus, il a été rapporté que l'ecH accélère la régénération osseuse en augmentant la prolifération des cellules ostéoblastes (18). ecH peut également diminuer la réplication du VHB, l'expression de l'antigène et l'inflammation dans les cellules épithéliales intestinales du rat (16,19). Cependant, l'effet biologique de l'ecH sur les rTecs n'a pas été entièrement élucidé.

La surexpression de TreM2 a favorisé la prolifération des cellules de gliome (22). En revanche, l'inactivation de TreM2 diminue la translocation de nF-κB vers le noyau dans les cellules dégénératives du noyau pulpeux humain (23). En outre, TreM2 a été identifié comme une nouvelle cible thérapeutique pour la dégénérescence du disque intervertébral humain (23). Cependant, la fonction biologique de TreM2 dans les rTecs humains n'a pas été rapportée. dans la présente étude, la surexpression de HBX (oeHBX) a été induite dans les rTecs humains (lignée cellulaire HK-2) ​​et par la suite, l'effet de ecH(échinacoside de cistanche) sur des cellules oeHBX transfectées a été étudiée. Le but de la présente étude était d'étudier les fonctions de HBX et la valeur potentielle de l'ecH en tant qu'agent thérapeutique efficace pour le VHB-Gn.

Matériaux et méthodes

Cellule Culture.La lignée cellulaire humaine rTec HK-2 a été achetée auprès de Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. Les cellules HK-2 ont été cultivées dans un milieu DME/F12 (n° cat. SH30023.01B ; Hyclone ; cytiva) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (n° cat. 16000‑044 ; Gibco ; Thermo Fisher Scientific, inc. .), 2 mM de l-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine (n° cat. P1400-100 ; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) à 37 °C avec 5 % de CO2.

ARN isolation et inverse transcription-quantitatif PCR (RT‑qPCR).L'ARN total a été extrait des cellules HK-2 à l'aide de Trizol® (cat. n° 1596 -026 ; Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific, inc.), conformément au protocole du fabricant. L'ARN total a été rétrotranscrit en ADNc en utilisant le kit de synthèse d'ADNc premier brin selon le protocole du fabricant (n° de catalogue K1622 ; Thermo Fisher Scientific, Inc.). La qPCR a été réalisée à l'aide du prémélange SYBr-Green conformément au protocole du fabricant (réf. K0223 ; Thermo Fisher Scientific, Inc.) sur un détecteur en temps réel ABI‑7300 ​​(Applied Biosystems ; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Les conditions de PCR étaient : 95°C pendant 10 min suivi de 40 cycles de 95°C pendant 15 sec, 60°C pendant 45 sec. Trois répétitions ont été nécessaires pour chaque réaction. Les paires d'amorces suivantes ont été utilisées pour la qPCR : HBX sens, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' et sens inverse, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3' ; TreM2 avant, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' et arrière, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3' ; et GaPdH vers l'avant, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' et vers l'arrière, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'. Les niveaux d'ARNm ont été quantifiés à l'aide de la méthode 2‑ΔΔCq et normalisés au gène de référence interneGAPDH (24).

Surexpression et abattre.Pour induire la surexpression de HBX et TreM2, les séquences d'ADNc pleine longueur de HBX ou TreM2 ont été insérées dans le vecteur plVX-puro (laboratoires cleantech, inc.) par double digestion (De derrièreiii etEcoRI). Par la suite, le plasmide recombiné (1,5 µg) a été transfecté dans des cellules HK-2 (2x105). Le plasmide factice (un vecteur vide, 1 µg) a été transfecté de manière transitoire dans des cellules HK-2 (2x105) en tant que contrôle négatif (oenc) à l'aide de lipofectamine® 2000 (n° de cat. 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). ecH(échinacoside de cistanche)(n° cat. 82854-37-3 ; Biopurify Phytochemicals, ltd.) a été dissous dans du DMSO (n° cat. d2650 ; Sigma-Aldrich ; Merck KGaa) à la concentration de 1, 2,5, 5, 10, 20 et

50 mg/l respectivement ; et ajouté à la culture de cellules oeHBX ou oeTreM2 transfectées. L'expérimentation suivante a commencé 48 h plus tard.

Pour faire tomber l'expression de TreM2, trois petits ARN (si) interférents (siTreM2-1, siTreM2-2 et siTreM2-3 ; 20 μM) ciblant TreM2 ont été synthétisés (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co . ltd.) et ensuite transfecté dans des cellules HK-2 (2x105) en utilisant de la lipofectamine® 2000 selon le protocole du fabricant (Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Une séquence de siRNA brouillé non spécifique (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) contrôle si-négatif (nc) a été utilisé comme contrôle négatif. Le locus ciblé et les séquences des sirnas TreM2 sont fournis dans le tableau Si. L'expérimentation suivante a été réalisée 48 h plus tard.

Occidental buvardage.La protéine totale a été extraite des cellules HK-2

en utilisant un tampon de lyse RIPA (n° de catalogue BY140825 ; Jrdun Biotech Co., Ltd.). La protéine totale a été quantifiée à l'aide du kit de dosage de l'acide bicinchoninique (n° de catalogue PICPI23223 ; Thermo Fisher Scientific, inc.) selon le protocole du fabricant et 20 µg de protéine/piste ont été séparés via SDS-PaGe sur un gel à 15 %. La densitométrie des échantillons a été déterminée à l'aide d'un lecteur de microplaques (dnM-9602, Pulangxin). Ensuite, les protéines séparées ont été transférées sur une membrane PVDF. Après blocage avec du lait en poudre écrémé à 5 % pendant 1 h à température ambiante, la membrane a été incubée avec des anticorps primaires (tableau SII) à 4 °C pendant une nuit et réincubée avec l'anticorps secondaire anti-igG de souris (1 : 1, 000, n° de catalogue a0216, Beyotime Institute of Biotechnology) pendant 1 h à 37 °C. Les bandes de protéines immunoréactives ont été visualisées à l'aide d'un système ecl (cytiva). Les blots ont été réalisés en triple exemplaire.GAPDHet H3 ont été utilisés comme contrôles de charge pour les protéines cytoplasmiques et nucléaires, respectivement.

Résultats

ECH (échinacoside de cistanche)supprime la fonction de HBX dans HK‑2 cellules.Pour évaluer

la fonction de HBX, la surexpression de HBX a été induite dans les cellules HK-2. Les niveaux relatifs d'ARNm et de protéines de HBX étaient significativement régulés à la hausse dans les cellules oeHBX par rapport aux cellules oenc (Fig. 1a et B). Par la suite, des cellules oeHBX ont été cultivées avec différentes concentrations d'ecH (1, 2,5, 5, 10, 20 et 50 mg/l ; e1, e2,5, e5, e10, e20 et e50, respectivement). La surexpression de HBX a réduit de manière significative la prolifération des cellules HK -2, et cette diminution a été inversée par ecH de manière dose-dépendante à 24 et 48 h (Fig. 1c).

De plus, le taux de prolifération des cellules oeHBX ne présentait aucune différence significative par rapport aux cellules traitées avec E1 (Fig. 1c). En revanche, le traitement e10 a augmenté de manière significative le taux de prolifération des cellules oeHBX par rapport aux traitements E20 et E50 qui ne présentaient aucune différence significative (Fig. 1c). Par conséquent, l'effet d'ecH sur l'apoptose a été examiné dans les cellules traitées avec e2.5, e5 et e10-. La surexpression de HBX a augmenté de manière significative l'apoptose des cellules HK-2 et le taux d'apoptose des cellules oeHBX a diminué avec le traitement ecH de manière dose-dépendante (Fig. 1d). dans l'ensemble, les résultats suggèrent que ecH inhibe la fonction de HBX dans les cellules HK -2 de manière dose-dépendante.

TREM2 expression est inhibé par ECH(échinacoside de cistanche) dans transfecté oeHBX

cellules.rT-qPcr et western blot ont été utilisés pour examiner les niveaux relatifs d'expression de l'ARNm et des protéines de TreM2 dans les cellules oeHBX, respectivement. Les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines TreM2 étaient significativement régulés à la hausse dans les cellules oeHBX par rapport aux cellules oenc (Fig. 2a et B). Cependant, ecH a diminué les niveaux d'expression de TreM2 dans les cellules oeHBX transfectées de manière dose-dépendante (Fig. 2a et B). Par conséquent, les résultats suggèrent que l'expression de HBX est positivement associée à l'expression de TreM2 et indiquent en outre l'effet suppresseur d'ecH sur HBX dans les cellules HK-2.

Abattre et surexpression de TREM2 dans HK‑2 cellules.Pour mieux évaluer la fonction de TreM2, l'inactivation et la surexpression de TreM2 ont été induites dans les cellules HK-2 en utilisant respectivement l'interférence ARN et un vecteur lentiviral. Pour le test knock-down, trois siARN ciblant le gène humainTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 et siTreM2-3) ont été transfectés dans des cellules HK-2, et un siRNA non spécifique a été utilisé comme contrôle négatif (sinc). les trois sirènes TreM2 ont réussi à faire tomber l'expression endogène de TreM2 dans les cellules HK-2 (Fig. 3a et B). Cependant, les plus faibles niveaux relatifs d'expression de l'ARNm et de la protéine TreM2 ont été observés dans les cellules transfectées siTreM2-1 et siTreM2-2- (Fig. 3a et B), par conséquent, siTreM2-1 et siTreM{{13 }} les cellules transfectées ont été choisies pour une expérimentation ultérieure. Pour les expériences de surexpression, un plasmide contenant la séquence TreM2cdna humaine pleine longueur a été construit puis transfecté dans des cellules HK-2 (oeTreM2). un

le plasmide factice a servi de contrôle négatif (oenc). Le niveau d'expression de TREM2 était significativement augmenté dans les cellules oeTREM2 par rapport aux cellules oenc (Fig. 3c et d). Par conséquent, des cellules oeTreM2 ont été utilisées pour une expérimentation ultérieure.

TREM2 silence diminue la apoptose de oeHBX cellules.Le profil d'apoptose des cellules oeHBX transfectées avec siTREM2 ou sinc a été évalué. Le taux d'apoptose des cellules oeHBX plus sinc était significativement plus élevé que celui des cellules ouvertes. Cependant, le taux d'apoptose était significativement diminué dans les cellules oeHBX plus siTreM2-1 ou siTreM2-2 par rapport aux cellules oeHBX plus sinc (Fig. 4a). Les résultats suggèrent que l'inactivation de TreM2 inhibe la fonction de HBX pendant l'apoptose des cellules HK-2.

La survivine appartient à l'inhibiteur d'une famille de protéines d'apoptose, qui inhibe l'activité apoptotique et supprime la mort cellulaire (25). Ciblage La survivine a été identifiée comme une nouvelle approche pour le traitement du carcinome à cellules rénales (26). Le nF-κB est également un inhibiteur de l'apoptose qui joue un rôle dans les processus tumoraux anti-apoptotiques (27). De plus, l'activation de la caspase3 est étroitement associée à l'apoptose (28). dans la présente étude, la teneur en protéines de TreM2, de Survivine et de caspase3 clivée dans les cellules HK-2 a été quantifiée. Le niveau d'expression de TREM2 était significativement diminué dans les cellules oeHBX plus siTreM2-1/2 par rapport aux cellules oeHBX plus sinc (Fig. 4B). Le niveau d'expression de la survivine a été significativement augmenté dans les cellules oeHBX plus siTreM2-1/2 par rapport aux cellules oeHBX. de plus, le niveau d'expression de la caspase3 clivée était significativement diminué dans les cellules oeHBX plus siTreM2-1/2 par rapport aux cellules oeHBX plus sinc (Fig. 4B). De plus, oeHBX a diminué de manière significative la translocation de NF-κB vers le noyau, et la transfection de siTREM2-1/2 a augmenté de manière significative la translocation nucléaire de nF-κB (Fig. 4B). Pris ensemble, les résultats suggèrent que TreM2 était un facteur en aval de HBX dans les cellules HK -2, par conséquent, HBX pourrait favoriser l'apoptose en régulant l'expression de TreM2 dans les rTec humains.

TREM2 surexpression supprime la translocation deNF‑κB à la noyau dans HK‑2 cellules.L'effet de l'ecH(échinacoside de cistanche)sur des cellules transfectées par oeTreM2- a été analysé. La surexpression de TreM2 a favorisé l'apoptose des cellules HK-2 (Fig. 5a). L'apoptose des cellules oeTREM2 a été significativement diminuée par le traitement ECH (E10; Fig. 5A). De plus, ECH a significativement diminué l'expression de TreM2 dans les cellules oeTreM2. La surexpression de TREM2 a diminué de manière significative les niveaux d'expression de Survivin, cependant, cette diminution de l'expression a été inversée par ecH. en outre, les niveaux d'expression protéique de la caspase3 clivée étaient significativement augmentés dans les cellules oeTreM2 par rapport aux cellules oenc ; un effet qui a été significativement diminué par le traitement ECH. De plus, ecH a favorisé la translocation de nF-κB vers le noyau dans les cellules oeTreM2 (Fig. 5B). Pris ensemble, les résultats ont indiqué que ecH supprimait également la fonction de TreM2 dans les cellules rTec humaines.

Fonctions HBX sommes supprimé par la NF‑κB inhibiteur PDTCdans Humain RTEC.Pour évaluer davantage la relation entre

Les cellules HBX et nF-κB, HK-2 ont été cultivées avec un inhibiteur spécifique de nF-κB, PdTc (10 µmol/l ; P10). Le taux d'apoptose cellulaire des cellules oeHBX était significativement augmenté par rapport aux cellules oenc (Fig. 6a). Cependant, les cellules oeHBX plus PdTc ont affiché un taux d'apoptose significativement accru par rapport aux cellules oeHBX. De plus, les niveaux relatifs d'expression de l'ARNm et des protéines de TreM2 ont diminué dans les cellules oeHBX plus PdTc par rapport aux cellules oeHBX (Fig. 6B). Par conséquent, les résultats

ont suggéré que nF-κB régulait négativement l'expression de TreM2 dans les cellules transfectées par oeHBX.

NF‑κB inhibiteur PDTC supprime TREM2 promoteur activité dans oeHBX cellules.un rapporteur de luciférase (pGl3-enhancer-luc2) contenant la séquence promotrice de type sauvage de TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) a été construit puis transfecté dans oenc , oeHBX et oeHBX plus cellules cultivées P10.

L'activité luciférase du vecteur rapporteur contenant le promoteur TREM2 de type sauvage a été significativement augmentée dans les cellules oeHBX par rapport aux cellules oenc. Cependant, PdTc a supprimé de manière significative l'activité luciférase du rapporteur dans les cellules oeHBX (Fig. 7). Dans l'ensemble, les résultats ont indiqué que PdTc inhibait la transcription de TreM2 en supprimant l'activité de promoteur de TreM2 dans les cellules oeHBX.

Discussion

Le HBX est principalement exprimé dans les rTecs des patients atteints du VHB-Gn et fonctionne comme un déterminant de la pathogenèse virale (11,29). Par conséquent, l'amélioration des connaissances sur la fonction du réseau de molécules HBX est une étape critique dans le développement d'une nouvelle approche pour le traitement du VHB-Gn. Le but de la présente étude était d'examiner plus avant la fonction de HBX et d'explorer son réseau moléculaire potentiel dans les rTecs humains.

HBX inhibe la prolifération des rTecs (11). dans la présente étude, les fonctions d'antiprolifération et de pro-apoptose de HBX dans les RTEC humains ont été identifiées, ce qui suggère que HBX a supprimé le développement de rTecs humains. une étude précédente a indiqué que ecH(échinacoside de cistanche)inhibe la réplication du VHB et l'expression de l'antigène (19). dans la présente étude, ecH(échinacoside de cistanche)le traitement a perturbé la fonction de HBX dans les cellules HK-2, par conséquent, HBX peut être affecté par ecH dans les cellules HK-2.

RAPPORTS DE MÉDECINE MOLÉCULAIRE 22 : 1137-1144, 2020 1143

De plus, les résultats suggèrent que ecH(échinacoside de cistanche)peut servir d'agent thérapeutique potentiel pour le VHB-Gn.

TreM2 est un récepteur immunitaire inné qui joue un rôle dans la réponse inflammatoire (30). Dans la présente étude, l'expression de HBX était positivement associée à l'expression de TreM2 dans le RTECS humain. De plus, l'inactivation de TREM2 a considérablement réduit le taux d'apoptose des cellules oeHBX, et ecH(échinacoside de cistanche)le traitement a réduit l'effet de oeTreM2 sur l'apoptose cellulaire. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que TreM2 était ciblé par HBX dans les cellules HK-2. Par conséquent, ecH(échinacoside de cistanche)peut inhiber l'apoptose des rTecs humains en bloquant l'activité de la voie de signalisation HBX/TreM2.

Un rapport précédent a démontré que le nF-κB joue non seulement un rôle dans l'apoptose cellulaire, mais est également impliqué dans la régulation des réponses immunitaires et de l'inflammation (31). De plus, TreM2 est médié par le microARN -34a sensible au nF-κB au cours de la maladie d'Alzheimer et de la dégénérescence maculaire (32,33). dans la présente étude, le taux d'apoptose des cellules oeHBX était significativement augmenté en présence de PdTc . À notre connaissance, la présente étude a suggéré pour la première fois que l'inhibiteur de NF-κB PdTc supprimait l'activité promotrice de TreM2. De plus, les résultats suggèrent que TreM2 régulait négativement la translocation de nF-κB vers le noyau dans les cellules HK-2, mais était positivement associé aux niveaux d'expression clivés de la caspase3. TreM2 a joué un rôle opposé dans les cellules HK -2 à son rôle dans les cellules dégénératives humaines du noyau pulpeux et du gliome (22,23). Par conséquent, la présente étude a suggéré que TreM2 pourrait avoir différentes fonctions dans différents types de cellules humaines.

Dans l'ensemble, la présente étude a non seulement indiqué que le nF-κB était un nouveau composant de la voie de signalisation HBX/TreM2, mais a également suggéré que le nF-κB régule négativement l'expression de TreM2 dans les rTecs humains. Cependant, les principales limites de la présente étude étaient le manque dedans vivoexpériences et données cliniques. Par conséquent, plus loindans vivoet des études cliniques sont nécessaires pour confirmer les résultats de la présente étude.

dans la présente étude, la fonction de ecH(échinacoside de cistanche)a été étudiée et les résultats ont suggéré les effets potentiels de l'ecH(échinacoside de cistanche)sur les voies de signalisation dans les rTecs humains. En outre, la présente étude a amélioré les connaissances existantes sur la fonction biologique de l'ecH dans les cellules rTec humaines et a également suggéré son potentiel en tant que nouvel agent thérapeutique pour le VHB-Gn.

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