Effets de la préparation de plantes herbacées de Cistanche sur les effets de la préparation de plantes herbacées de Cistanche sur l'expression in vitro N Vitro des cytokines par les ostéoblastes de rat

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

ABSTRAIT

Les ostéoblastes (OB) jouent un rôle important dans le remodelage osseux les ostéoblastes (OB) jouent un rôle important dans le remodelage osseux par la libération de cytokines telles que la libération de cytokines telles que l'ostéoprotégérine (OOPG), un activateur des récepteurs du facteur nucléaire kappa- Le ligand B (RA PG), un activateur du récepteur du facteur nucléaire kappa-B ligand NKL) et l'ostéopontine (OPN). L'objectif de notre étude était d'évaluer les effets des extraits d'herbes chinoises deCistanche(Cistanche deserticola) sur l'expression in vitro de ces cytokines en culture de cellules OB de rat. Les OB primaires ont été isolés du crâne de rat par digestion à la trypsine et à la collagénase. Le phénotype cellulaire a été déterminé par la méthode de teinture suisse, la coloration à la phosphatase alcaline, la coloration de Von Kossa et la coloration au rouge Alizarine. L'expression génique de l'OPG, du RANKL et de l'OPN a été analysée par PCR quantitative en temps réel. Tous les traitements avec des extraits de plantes herbacées de Cistanche ont augmenté l'expression génique de l'OPG et du RANKL à 72 heures de culture, en particulier à des concentrations de 5 × 10-2 mg/mL, qui étaient significativement différentes par rapport aux cultures témoins. Le traitement a significativement réduit l'expression du rapport OPG/RANKL à 48 heures et l'expression de l'ARNm OPN à 72 heures de culture. L'exposition in vitro d'OB à la préparation végétale de Cistanche a favorisé l'expression génique d'OPG et de RANKL et réduit l'expression génique d'OPG/RANKL et d'OPN, et ainsi, pourrait maintenir l'équilibre de la formation et de la résorption osseuses au cours du métabolisme osseux.

Mots clés:Cistanche, ostéoblastes, ostéoprotégérine, RANKL, ostéopontine, rat

anti-ostéoblaste :Cistanche herbe

Introduction

La solidité des os est déterminée par la structure et la composition. Le tissu osseux s'adapte pour s'adapter à une variété de charges en se modelant pendant la phase de croissance et en se remodelant tout au long de la vie. Le remodelage osseux diminue avec l'âge en raison d'une réduction du volume d'os formé dans l'unité multicellulaire de base, d'un déficit en hormones sexuelles et d'une réduction de la formation d'os périosté (SEEMAN, 2008). Un déséquilibre dans le remodelage osseux peut provoquer des maladies liées aux os, telles que l'ostéoporose, et un risque accru de fracture.

L'ostéoporose, à l'origine de fractures, de douleurs et de troubles de la locomotion, touche des millions d'individus aux États-Unis (NAYAK et al., 2012 ; SILVERMAN, 2010). Le processus clé dans la prévention de l'incidence des maladies liées aux os est de maintenir la capacité de remodelage osseux.

Le remodelage osseux est l'équilibre dynamique de la formation et de la résorption osseuse (SEEMAN et DELMAS, 2006). Ces processus sont principalement contrôlés par les ostéoblastes (OB) et les ostéoclastes dans l'os adulte, et par l'expression de cytokines, de facteurs de croissance et d'hormones (PARFITT, 2000). Les OB, dérivés des cellules mésenchymateuses primordiales, se trouvent à la surface de l'os. Les OB sont responsables de la formation osseuse et ont un impact indirect sur la résorption osseuse (MACKIE, 2003). Les cytokines exprimées par les OB, telles que l'ostéoprotégérine (OPG), l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire kappa-B (RANKL) et l'ostéopontine (OPN), peuvent favoriser la cicatrisation des fractures et augmenter la formation osseuse dans l'ostéoporose (LINKHART et al., 1996) . Le développement de l'OB est un processus séquentiel qui comprend la prolifération des ostéoprogéniteurs, la maturation de la matrice et la minéralisation cellulaire (GIUSTINA et al., 2008). Ce processus est régulé par plusieurs gènes associés à l'OB et est fortement associé au développement de la formation osseuse (HUNG et al., 2010). La progression de la minéralisation ostéogénique stimule la formation osseuse lors de la cicatrisation des fractures osseuses. Ainsi, la recherche sur l'expression des cytokines ostéogéniques et leurs effets sur la minéralisation osseuse est essentielle dans la recherche d'un agent thérapeutique d'origine naturelle innovant et efficace pour la prévention des maladies osseuses.

La médecine traditionnelle chinoise est utilisée depuis des milliers d'années dans le traitement des maladies liées aux os. La plante herbacée Cistanche, largement utilisée pour tonifier les reins et dans le traitement des maladies osseuses, appartient à un genre de la famille des Orobanchacées. Il a été rapporté que les constituants de l'espèce Cistanche sont : les glycosides phényléthanoïdes (PhG), les iridoïdes, les lignanes, les alditols et les oligosaccharides (JIANG et TU, 2009 ; LI et al., 2010). Les plantes Cistanche sont des herbes parasites vivaces, qui poussent principalement dans le désert ou sur des salines stériles, principalement distribuées dans les déserts arides et chauds du nord-ouest de la Chine. En Médecine Traditionnelle Chinoise, le Cistanche est considéré comme un tonique extraordinaire, et est nommé le "Ginseng du désert". Une étude réalisée chez des rats ovariectomisés (LIANG et al., 2011) a montré queExtraits de Cistancheadministré par voie orale a augmenté de manière significative la densité minérale osseuse et le contenu minéral osseux de manière dose-dépendante. Cependant, les mécanismes détaillés de l'action de Cistanche sur la formation osseuse ne sont pas encore clairs. Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient d'évaluer les effets de Cistanche sur l'expression in vitro des gènes des cytokines OPG, RANKL et OPN par des cultures de cellules OB de rat, et d'évaluer les mécanismes par lesquels Cistanche favorise la cicatrisation osseuse ou prévient/contrôle maladies liées aux os.

Cistanche herbe pour la prévention des maladies liées aux os

matériaux et méthodes

Préparation d'ostéoblastes de rat. Des OB de rat ont été préparés à partir de calvarias de rats nouveau-nés (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Préparation d'extraits aqueux de Cistanche en dilutions en série. Le Cistanche utilisé dans cette étude a été fourni par la pharmacie Tongrentang en Chine. Des morceaux secs de Cistanche ont été réduits en poudre. Les extraits liquides de Cistanche ont été préparés en décoctant 50 g de poudre d'herbes pendant 1 heure. Ensuite, la préparation a été concentrée à 100 ml à l'aide d'un évaporateur rotatif et filtrée à travers des filtres de 0,22 mm. Le filtrat a été stocké à 4 degrés dans l'obscurité. L'extrait liquide de Cistanche a été dilué à des concentrations en série allant de 5 × 10 -1 à 5 × 10-4 mg/mL avec le fluide DMEM.

Isolement d'ARN et PCR de transcription inverse. La troisième génération d'OB cultivés a été traitée avec différentes concentrations d'extraits de Cistanche pendant 24, 48 et 72 heures. Les traitements de culture cellulaire OB ont été effectués en triple exemplaire. Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et l'ARN a été isolé des cellules avec le réactif TransZol (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Chine) selon les instructions du fabricant, et extrait avec du chloroforme, précipité avec de l'isopropyle. alcool, lavé avec de l'alcool éthylique à 75% puis dissous dans de l'eau. La transcription inverse de l'ARN (5 μL) a été réalisée à l'aide du Supermix de synthèse d'ADNc TransScript First-Strand (Trans, Pékin, Chine).

Confirmation des produits PCR en temps réel. Après électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5%, un séquençage d'ADN a été effectué afin de prouver que les produits de PCR étaient les segments de gènes codant pour OPG, RANKL et OPN dans l'OB de rat.

L'établissement d'un plasmide contenant le gène cible. La séquence d'ADN dans un gel d'agarose à 2% a été purifiée et récupérée par extraction sur gel EZNA (Kangweishiji, Chine) et transférée dans un kit de clonage pEASY-T3 (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Chine). La transformation cellulaire a été réalisée via un plasmide construit contenant le gène cible. Les colonies positives ont été criblées par le test de dépistage des taches bleu-blanc et séquencées par la suite. Les plasmides extraits des colonies positives, contenant le gène cible, ont été dilués proportionnellement avec de l'eau déionisée pour obtenir une courbe standard. PCR quantitative en temps réel (RTQ PCR). Des amorces spécifiques ont été construites selon les séquences de gènes publiées (NCBI, Nucleotide Database) et synthétisées par Liuhe-Nuada Gene (Beijing, Chine) comme indiqué dans le tableau 1.

L'expression des ARNm dans les échantillons a été quantifiée en utilisant les courbes standards plasmidiques spécifiques décrites ci-dessus. Les produits ont été comparés au gène domestique -actine. La quantité de gène cible a été quantifiée par RTQ PCR, en utilisant le SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, Chine) selon le protocole du fabricant. Les conditions de PCR étaient les suivantes : 94 degrés pendant 1 minute, 58 degrés pendant 30 secondes, 68 degrés pendant 1 minute et ont été répétées pendant 40 cycles. Les données ont été calculées à l'aide du système de PCR en temps réel 7500 (Applied Biosystems ; Waltham, MA, États-Unis).

Analyses statistiques. Les données ont été traitées par ANOVA unidirectionnelle, à l'aide d'un logiciel statistique commercial (SPSS 17.0, IBM Corporation ; Armonk, NY, États-Unis). Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne ± écarts-types des gènes cibles et du rapport -actine. Les différences ont été considérées comme significatives à P<0.05>

Bienfait de l'herbe de cistanche : prévenir les maladies osseuses

Résultats

L'identification des OB de rat. Les OB ont été identifiés par des méthodes de coloration cellulaire spécifiques et ont été phénotypiquement démontrés comme le montre la figure 1. (A, B, C et D)

Confirmation des gènes cibles. Les tailles de bande des gènes cibles ont été analysées dans un gel d'agarose à 2 % et se sont avérées conformes à la taille attendue (Fig. 2).

Les résultats obtenus pour les segments de gènes OPG, RANKL, OPN et -actine qui contenaient les séquences plasmidiques du gène cible ont été comparés aux séquences de gènes correspondantes précédemment publiées dans GENBANK par analyse BLAST-N, et se sont révélés être : 100 %, 100 % , 100 % et 99 % identiques, respectivement.

Effet des extraits liquides de Cistanche sur l'expression d'OPG, RANKL et OPN. Les niveaux d'ARNm d'OPG ont été régulés à la baisse lorsque les OB ont été exposés à toutes les concentrations appliquées de Cistanche pendant 24 h et 48 h (tableau 2).

Des différences significatives ont été observées à des concentrations de 5×10-1, 5×10-2 et 5×10-4 mg/mL après 24 heures, et à des concentrations de 5×10-1 et 5 ×10-2 mg/mL après 48 heures de culture (P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Discussion

Les ostéoblastes (OBs) jouent non seulement un rôle essentiel dans la création de l'architecture osseuse mais également dans l'homéostasie calcique, en régulant l'activité ostéoclastique (MACKIE, 2003). Certaines maladies osseuses sont associées à la fonction ou au dysfonctionnement de l'OB, comme l'ostéoporose. Les marqueurs phénotypiques d'apparition des OB sont principalement leur prolifération et leur différenciation, et secondairement la minéralisation des nodules osseux (PAN et al., 2005). OPG et RANKL sont des membres de la famille des cytokines du facteur de nécrose tumorale (TNF), et ce sont les protéines dérivées de l'OB cruciales pour la régulation et le maintien de la masse osseuse (HUMPHREY et al., 2006 ; REINHOLZ et al., 2002). RANKL régule la différenciation, l'activation et la survie des ostéoclastes. RANKL peut également augmenter la résorption osseuse en interagissant avec son récepteur sur la membrane ostéoclastique (SODEK et al., 2000). L'OPG est le récepteur leurre du RANKL et empêche le RANKL de se lier à son récepteur (RANK). La relation RANK/RANKL/OPG contrôle l'équilibre entre formation et résorption osseuse, en régulant les activités OB et ostéoclastes (SODEK et al., 2000 ; HUMPHREY et al., 2006 ; MAZZIOTI et al., 2012). En conséquence, on pourrait conclure qu'une diminution du rapport OPG/RANKL peut induire une résorption osseuse en augmentant l'activation des ostéoclastes.

Dans cette étude, tous les traitements avec des préparations herbacées de Cistanche ont augmenté le gène de l'expression de l'OPG et du RANKL à 72 heures, en particulier aux concentrations de 5 ×10-2 mg/mL et 5 ×10-3 mg/mL, qui étaient significativement différente par rapport aux cultures témoins.

En revanche, l'expression de l'OPG était significativement régulée à la baisse après 24 et 48 heures de culture avec des extraits de Cistanche. L'expression du rapport OPG/RANKL était significativement régulée à la baisse lorsque les OB étaient traités avec Cistanche pendant 24 heures et 48 heures. De plus, l'extrait de Cistanche n'a eu aucun effet significatif sur les cultures OB après 72 heures de traitement. Nous émettons l'hypothèse que les extraits liquides de Cistanche peuvent améliorer l'activation des ostéoclastes après 24 heures et 48 heures grâce à l'expression régulée d'OPG/RANKL, mais peuvent n'avoir aucun effet sur l'activation des ostéoclastes après 72 heures. L'OPN présente plusieurs diversités fonctionnelles dans la formation et le remodelage osseux liés aux rôles fondamentaux de l'OPN dans la défense de l'hôte et la réparation des tissus. Le rôle principal de l'OPN semble être la régulation de la rétroaction négative au niveau systémique, la promotion de l'adhésion des cellules OB, l'induction d'événements de calcification précoce, ainsi que le contrôle de la taille et de la forme des cristaux minéraux (SODEK et al., 2000). De plus, il a été confirmé que l'OPN peut représenter une protéine de pont, augmenter la rigidité artérielle pendant l'inflammation et peut par conséquent causer des lésions articulaires et augmenter le risque cardiovasculaire chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (BAZZICHI et al., 2009).

Dans notre étude, nous avons montré qu'un extrait liquide de Cistanche régulait à la baisse l'expression de l'OPN. La tendance à la diminution des concentrations d'OPN dans les cultures OB par rapport aux cultures témoins observées à 24 heures et 48 heures de culture, et les niveaux significativement inférieurs enregistrés à 72 heures, suggèrent que Cistanche peut améliorer la formation osseuse, comme démontré par l'expérience in vitro.

L'exposition in vitro des cultures OB à Cistanche a considérablement favorisé l'expression génique de l'OPG et du RANKL après 72 heures, réduit l'expression génique de l'OPG / RANKL après 24 heures et 48 heures et diminué l'expression de l'OPN après 72 heures de culture.

LaCistanche herbeest toujours utilisé comme une prescription composée de plusieurs herbes chinoises, par conséquent l'efficacité clinique de Cistanche utilisé dans cette étude et les composants de l'extrait liquide sont complexes et pas encore clairs. Les résultats de notre étude démontrent que l'extrait de Cistanche affecte l'expression d'OPG et de RANKL lorsqu'il est appliqué à l'OB de rat en culture cellulaire, mais le niveau d'expression varie en fonction de la concentration d'extraits de Cistanche et de la durée de la culture. La concentration appropriée des extraits liquides de Cistanche deserticola, associée à la durée appropriée d'exposition aux OB de rat, peut maintenir l'équilibre de la formation et de la résorption osseuses au cours du métabolisme osseux.

Des recherches supplémentaires sont nécessaires afin d'améliorer nos connaissances sur les ingrédients bioactifs de Cistanche et leurs concentrations dans les préparations, afin qu'ils soient validés en tant que modulateurs de cytokines pour la restauration et la réparation osseuse.

supplément de cistanche : prévient les pertes osseuses

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