Cistanche : l'échinacoside supprime la croissance cellulaire de l'adénocarcinome pancréatique en induisant l'apoptose via la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes

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WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG et XINFENG LI

Résumé.

L'application clinique de produits naturels dérivés de la médecine traditionnelle chinoise a attiré l'attention dans la chimiothérapie anticancéreuse.Échinacoside(ECH), l'un des phényléthanoïdes, isolé des tiges deCistanche(une plante médicinale chinoise) a des effets protecteurs des tissus et anti-apoptotique sur le système nerveux central. Cependant, il reste largement insaisissable si ECH possède une activité suppressive de tumeur. Dans la présente étude, il a été démontré que l'ECH peut nettement inhiber la prolifération des cellules d'adénocarcinome pancréatique en induisant la production d'espèces réactives de l'oxygène et la perturbation du potentiel membranaire mitochondrial et en déclenchant ainsi l'apoptose. En outre, il a été élucidé que ECH(Échinacoside)réprime la croissance des cellules tumorales en modulant l'activité MAPK. En conclusion, cette étude révèle une nouvelle fonction de ECH(Échinacoside) dans la prévention du développement du cancer, et implique que l'utilisation de l'ECH pourrait être une stratégie chimiothérapeutique potentielle pour le cancer.

Introduction

La voie du suppresseur de tumeur p53 via l'induction du suppresseur de tumeur, l'ARF atténue la dégradation de p53 médiée par l'E3-souris double minute (MDM)2-oncogène (3). Il s'agit d'un mécanisme autorégulé et autoprotecteur qui empêche les cellules de se transformer malignes. Notamment, p53 peut réprimer l'activité de Myc en activant de manière transcriptionnelle, par exemple, miR-145 qui cibleMycARNm pour le silençage de la traduction (4,5), formant ainsi une boucle régulatrice de rétroaction négative.

La stratégie la plus simple et la plus efficace pour traiter le cancer consiste à tuer les cellules cancéreuses. Il a été démontré que les médicaments anticancéreux couramment utilisés, tels que le cisplatine (6), l'actinomycine D (7) et l'adriamycine (8), inhibent la croissance tumorale en favorisant l'apoptose. Récemment, de plus en plus de preuves ont démontré qu'un certain nombre de produits naturels et de dérivés de plantes, en particulier de plantes médicinales utilisées dans la médecine traditionnelle chinoise (MTC), présentent une fonction suppressive des tumeurs en induisant l'apoptose des cellules cancéreuses et ont le potentiel d'une application clinique. dans le traitement du cancer (9). Par exemple, l'émodine anthraquinone naturelle est isolée de nombreux types de cellules cancéreuses (10,11). La camptothécine, dérivée de "l'arbre heureux" chinois,Camptothèque acuminé, est un produit naturel précieux qui inhibe la ligature de l'ADN suite à des ruptures de brin médiées par topo I (12). Dans une autre étude de cohorte rétrospective basée sur la population d'un total de 729 patientes atteintes d'un cancer du sein avancé, il a été suggéré que la thérapie TCM peut contribuer au traitement du cancer. De cette cohorte, 115 patients étaient des utilisateurs de MTC tandis que 614 patients n'utilisaient pas de MTC. L'analyse multivariée a démontré que, par rapport aux non-utilisateurs, l'utilisation de la MTC était associée à une diminution significative du risque de mortalité toutes causes confondues (13). Toutes les découvertes susmentionnées ont indiqué que la MTC est une médecine complémentaire et alternative importante qui peut être utilisée dans le traitement du cancer.

souris atteintes de lésions pulmonaires aiguës (16,17). ECH aussi(Échinacoside)Il a été démontré qu'il a des effets protecteurs sur le tissu nerveux et qu'il améliore les troubles du comportement dans des modèles murins de la maladie de Parkinson (18). Notamment, il a été découvert que l'ECH favorise la prolifération cellulaire et inhibe l'apoptose dans les cellules MODE-K épithéliales intestinales de souris (19). Jusqu'à présent, cependant, moins d'attention a été accordée au rôle potentiel de l'ECH dans la prévention du cancer.

Dans cette étude, il a été exploré si le traitement ECH affecte la croissance et la prolifération des cellules tumorales et si ECH(Échinacoside)induit l'apoptose, augmente la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et réduit le potentiel de membrane mitochondriale (MMP), et par conséquent supprime la croissance des cellules tumorales. En outre, la présente étude visait à identifier les mécanismes moléculaires responsables de l'inhibition de la croissance cellulaire médiée par l'ECH.

Matériaux et méthodes

Cellule ligne, réactif, et anticorps.Des cellules d'adénocarcinome pancréatique SW1990 (ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 50 U/ml de pénicilline et 0,1 mg/ml de streptomycine à 37 °C dans un Atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. ECH(Échinacoside)a été acheté auprès de Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Chine). Les anticorps contre AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 et GAPDH ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); les anti-Bax et anti-Bcl-2 ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Californie, États-Unis) ; et l'anti-caspase-3 a été acheté auprès d'Abcam (Shanghai, Chine).

Cellule viabilitéessai. Pour évaluer le taux de croissance des cellules tumorales, le kit de comptage de cellules{{0}} (CCK-8 ; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, États-Unis) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. Les suspensions cellulaires ont été ensemencées à 5,000 cellules par puits avec un traitement ECH pendant 0, 12, 24, 48 ou 72 h dans des plaques de culture 96 -puits. L'inhibition de la croissance cellulaire a été déterminée en ajoutant le réactif WST-8 du kit CCK‑8 à une concentration finale de 10 % dans chaque puits, et l'absorbance des échantillons a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Multiskan MK3 ; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, États-Unis).

Höchst 33342 coloration.Les cellules (60 pour cent de confluence) ont été traitées avec Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Chine) à une concentration finale de 1µg/ml, incubé dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min, lavé deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate, fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante et monté sur des lames. Les changements morphologiques des noyaux cellulaires ont été observés au microscope à fluorescence (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Les noyaux normaux étaient ronds et colorés en bleu clair, tandis que les noyaux apoptotiques étaient rétrécis et colorés en bleu vif.

Activé par fluorescence cellule tri (FACS) analyses.Pour l'évaluation de l'apoptose, le kit de détection de l'apoptose de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-Annexine V (BD Biosciences, Shanghai, Chine) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. En bref, 5x104 cellules ont été lavées avec du PBS glacé, remises en suspension dans 0,1 ml de tampon de liaison (Beyotime Institute of Biotechnology) et colorées avec 10 ml d'annexine V conjuguée au FITC (10 mg/ml) et 10 ml d'iodure de propidium (PI) (50 mg/ml). Après une incubation de 15 min à température ambiante dans l'obscurité et l'ajout de 400 ml de tampon de liaison, les cellules ont été analysées par un cytomètre en flux (C6 ; BD Biosciences, Shanghai, Chine).

La mesure de réactif oxygène espèces (ROS).Pour évaluer la production de ROS, le kit Reactive Oxygen Species Assay (Vigorous Biotechnology, Pékin, Chine) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules (confluence à 80 %) ont été récoltées et lavées avec du PBS avant coloration avec la solution de dihydroéthidium (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Les cellules ont ensuite été analysées par des analyses de cytométrie en flux.

La mesure de mitochondrial membrane potentiel (MMP).

Un kit de dosage de l'ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) a été utilisé pour détecter les changements de MMP. En bref, les cellules (confluence à 80 %) ont été récoltées, lavées avec du PBS et colorées avec du TMRM pendant 15 à 20 min dans un incubateur à 37 °C. Les cellules ont ensuite été lavées une fois avec du PBS et soumises à des analyses de cytométrie en flux.

Immunoblotanalyses. Les cellules (80 % de confluence) ont été récoltées et lysées dans un tampon RIPA (Jrdun Biotechnology) composé de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 ; 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 1 % de NP‑40, 1 % d'acide désoxycholique de sodium et 0,1 % de SDS et des inhibiteurs de protéasome fraîchement ajoutés. Des quantités égales de lysat de cellules claires ont été utilisées pour l'analyse par immunotransfert comme décrit précédemment (20).

Statistique une analyse.Les données quantitatives sont exprimées en moyenne ± écart-type. Les différences statistiques ont été évaluées par le test t de Student non apparié à l'aide du logiciel statistique SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Résultats

ECH (Échinacoside)supprime tumeur cellulecroissance. Bien qu'il ait été signalé que l'ECH(Échinacoside)présente un rôle protecteur en inhibant l'apoptose et les signaux inflammatoires dans les cellules somatiques, telles que les cellules épithéliales neuronales et intestinales (16-19), il reste difficile de savoir si l'ECH contrôle la croissance et la prolifération des cellules cancéreuses. Pour tester cela, un test de survie cellulaire a été réalisé en traitant des cellules SW1990, dérivées d'un adénocarcinome pancréatique de grade II, avec des doses titrées d'ECH comme le montre la Fig. 1. Notamment, il a été démontré que l'ECH retarde de manière significative la prolifération des cellules tumorales à une dose -dépendante pendant une période de culture de 5-jours (Fig. 1).ECH déclencheursl'apoptose. Comme la perte d'apoptose est l'un des principaux mécanismes responsables de la prolifération incontrôlée des cellules cancéreuses du pancréas (21), la présente étude a réalisé une série d'expériences pour déterminer si l'ECH déclenche l'apoptose. Tout d'abord, en colorant les noyaux des cellules tumorales avec Hoechst 33342, il a été démontré que l'ECH entraîne l'apoptose de manière dose-dépendante (Fig. 2A). De plus, des analyses FACS ont été effectuées à l'aide de la coloration à l'annexine V / PI pour confirmer davantage l'effet apoptotique de ty ECH (Fig. 2B). Le pourcentage moyen de cellules apoptotiques était de 1, 1% dans des conditions de culture normales, tandis que ce pourcentage augmentait de manière significative à 10, 6, 21, 4 et 51, 3% en réponse au traitement ECH de manière dose-dépendante (Fig. 2C). Ces résultats, ainsi que le test de viabilité cellulaire illustré à la figure 1, démontrent que le traitement ECH supprime la prolifération des cellules tumorales en déclenchant l'apoptose.

générer de l'éthidium qui s'intercale avec l'ADN, a été utilisé dans cette étude pour évaluer la production de ROS. Il a été constaté que, comme d'autres médicaments anticancéreux, l'ECH stimule également la production de ROS de manière dose-dépendante, comme le montre l'intensité de fluorescence élevée lors du traitement à l'ECH (Fig. 3).

ECH (Échinacoside)réduit MPM.Il a été démontré que le dysfonctionnement mitochondrial est impliqué dans l'induction de l'apoptose. Il a été démontré que l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale induisait la dépolarisation du potentiel transmembranaire et la libération de facteurs pro-apoptotiques (23). Par conséquent, il a été testé si ECH pouvait induire une perte de MMP dans les cellules tumorales en effectuant un test TMRM, qui est une approche bien établie, car l'intensité de la fluorescence TMRM est proportionnelle au potentiel de membrane. Il a été démontré que le traitement ECH réduit significativement la MMP de manière dose-dépendante (Fig. 4).ECH les contrôles tumeur cellule croissance passant par protéine activée par un mitogènela base moléculaire de la mort des cellules tumorales médiée par l'ECH, l'activité de plusieurs voies de signalisation vitales, telles que MAPK et AKT (24,25), qui contrôlent la survie et la mort des cellules, a été examinée. Les MAPK sont des protéines kinases Ser/Thr dirigées par la proline conservées au cours de l'évolution, y compris les kinases extracellulaires régulées par le signal (ERK), la kinase c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) et les membres de la famille p38 qui sont activés par trois cascades de signalisation de kinase de niveau (26,27). Dans cette étude, l'expression des MAPK et des AKT, ainsi que leurs formes phosphorylées activées, a été évaluée et il a été révélé que l'ECH supprime nettement l'activité JNK et ERK1/2, mais améliore l'activité p38 (Fig. 5). Notamment, il a été démontré que l'activité AKT, qui est également d'une importance critique pour la prolifération cellulaire, n'est pas affectée par le traitement ECH (Fig. 5). De plus, il a été démontré que le traitement ECH élève l'expression de Bax et Caspase-3 tout en réduisant l'expression de Bcl-2 (Fig. 5), ce qui est cohérent avec la Fig. 2. Ainsi, les résultats indiquent que L'ECH déclenche l'apoptose des cellules tumorales via la voie MAPK.

Discussion

À notre connaissance, il s'agit de la première étude à montrer que l'ECH a une fonction de suppression tumorale en déclenchant l'apoptose (Fig. 2), en favorisant la production de ROS (Fig. 3) et en induisant une dépolarisation du potentiel de la membrane mitochondriale (Fig. 4) , entraînant par conséquent une inhibition de la croissance des cellules tumorales (Fig. 1). De plus, il a été démontré que la base moléculaire de la mort des cellules tumorales médiée par ECH se produisait en régulant les voies de signalisation MAPK (Fig. 5). Ces découvertes démontrent une nouvelle fonction de l'ECH dans la prévention de la tumorigenèse et suggèrent ainsi qu'elle pourrait être un agent candidat pour le traitement du cancer.

La majorité des médicaments anticancéreux peuvent induire l'apoptose, la sénescence et/ou l'arrêt du cycle cellulaire des cellules tumorales, ce qui entraîne une inhibition de la croissance et de la prolifération des cellules tumorales. L'arrêt du cycle cellulaire est une réponse cellulaire à des signaux de stress légers qui permettent aux cellules de réparer l'ADN endommagé avant d'initier la synthèse d'ADN réplicatif ou la mitose, tandis que l'apoptose et la sénescence (arrêt permanent du cycle cellulaire) se produisent en réponse à des signaux de stress qui éliminent les cellules irréparables ou malignes ( 28,29). Par conséquent, seul l'effet apoptotique de l'ECH sur les cellules tumorales a été évalué dans cette étude, car la destruction des cellules cancéreuses est un critère majeur pour évaluer la puissance d'un agent anticancéreux. Notamment, il a été démontré que l'ECH induit l'expression debax(Fig. 5), un gène pro-apoptotique, activé transcriptionnellement par le suppresseur de tumeur p53 (30). Ainsi, il est intéressant de tester si ECH peut activer la voie de signalisation p53. Si tel est le cas, ECH peut également être en mesure de provoquer un arrêt du cycle cellulaire, une sénescence, une apoptose ou une autophagie dépendant de p53-. Dans cette étude, la fonction de suppression tumorale de l'ECH dans la lignée cellulaire d'adénocarcinome pancréatique SW1990 a été élucidée. Cependant, d'autres études observant davantage de lignées cellulaires de cancer du pancréas sont nécessaires. Il a été démontré que des mutations de la protéine oncogène RAS et du suppresseur de tumeur p53 sont associées au développement du cancer du pancréas (31) ; cependant, la lignée cellulaire SW1990 n'héberge aucune mutation p53, selon la base de données p53 du CIRC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Par conséquent, il est important d'étudier si l'ECH peut affecter la croissance et la prolifération d'autres lignées cellulaires de cancer du pancréas avec différentes mutations de p53. De plus, il serait intéressant de déterminer si l'ECH est capable de favoriser l'apoptose et d'inhiber la croissance d'autres types de tumeurs.

L'élévation des ROS et la réduction des MMP, qui ont été causées par le traitement à l'ECH, se sont avérées essentielles dans l'induction de l'apoptose (22). De plus, il a été constaté que les ROS peuvent induire l'oxydation des pores mitochondriaux contribuant à la libération de cytochromec, un intermédiaire dans l'apoptose, due à la perturbation de la MMP (22). Ainsi, il reste à déterminer si ECH perturbe MMP indirectement par l'induction de ROS. De plus, il a également été démontré que le stress oxydatif induit par les ROS est impliqué dans la modulation d'une myriade de signaux de contrôle de la croissance cellulaire, notamment p53, NF-κB, HIF et PI3K (32). Il reste à déterminer si et, si oui, comment ECH régule ces importantes voies de signalisation. Notamment, le stress oxydatif provoque diverses maladies neurodégénératives en raison de la forte consommation d'oxygène, des systèmes antioxydants faibles et des caractéristiques de différenciation terminale du système nerveux central (33). Cependant, plusieurs études ont montré que l'ECH a des effets protecteurs et anti-apoptotique sur le tissu nerveux. À cet égard, il est raisonnable de supposer que l'ECH peut réduire la production de ROS dans les cellules neurales différenciées terminales. Par conséquent, il reste également à déterminer si la régulation de la production de ROS par ECH dépend de l'état de différenciation cellulaire. Par conséquent, les présents résultats ainsi que d'autres études révèlent que l'ECH, la MTC largement utilisée, peut être une stratégie chimiothérapeutique importante non seulement pour le traitement des maladies neurodégénératives mais aussi des carcinomes malins.

Récemment, l'utilisation de la MTC dans le traitement du cancer a attiré de plus en plus d'attention. Le potentiel des produits naturels à base de plantes médicinales utilisées en MTC a été reconnu par la communauté scientifique même dans le monde occidental (9). Des efforts sont nécessaires pour élucider les mécanismes d'action sous-jacents de ces produits naturels, ce qui pourrait éventuellement conduire au développement de médicaments efficaces et sûrs pour le traitement du cancer.

En conclusion, la présente étude a démontré la fonction inhibitrice de la tumeur de l'ECH et élabore également la base moléculaire de la suppression tumorale médiée par l'ECH, suggérant ainsi l'application clinique potentielle de l'ECH dans le traitement du cancer.

Remerciements

Cette étude a été financée et soutenue par le programme clé de recherche scientifique de la FMU (subvention n° 09ZD014). Les auteurs tiennent à remercier Biomedworld (Shanghai, Chine) pour leur aide à la rédaction du manuscrit.

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