Effets bénéfiques de l’échinacoside sur la cardiomyopathie diabétique chez les souris diabétiques Db / Db

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Xiang Zhang et Yarong Hao

Introduction

La cardiomyopathie diabétique (DCM) est une complication majeure du diabète, avec une morbidité élevée et un risque élevé de maladie cardiovasculaire et de mortalité chez les patients diabétiques.1 L’incidence de DCM chez les patients ayant des antécédents de diabète ≥ 5 ans est supérieure à 44,4%, ce qui augmente à 56% après 8 ans.2,3 DCM est une sorte de cardiomyopathie primaire, qui se manifeste par des anomalies structurelles et fonctionnelles cardiaques causées par l’apoptose des cellules de fibrose myocardique et des lésions microvasculaires chez les patients diabétiques sans cardiopathie ischémique ou hypertensive et peut induire une arythmie cardiaque avec choc d’origine cardiaque et mort subite dans l’insuffisance cardiaque.4 En raison de la pathogenèse complexe de la DCM et de son diagnostic à des stades avancés, aucun traitement efficace n’existe.5 L’hyperglycémie est le facteur initiateur de la pathogenèse DCM. L’hyperglycémie à long terme entraîne une perturbation du métabolisme du glucose et des lipides dans les cardiomyocytes des patients diabétiques, entraînant des lésions des cellules endothéliales vasculaires et d’autres tissus, favorisant des changements pathologiques tels que l’hypertrophie, la nécrose, l’apoptose et la fibrose interstitielle myocardique.6,7 Les troubles du métabolisme du glucose et des lipides sont essentiels aux mécanismes pathologiques de la DCM. Le contrôle efficace du métabolisme énergétique dans les cardiomyocytes représente donc une stratégie thérapeutique importante pour le DCM.

cistanche tubulosa traiterCardiomyopathie diabétique

L’accumulation de lipides myocardiques dans le DCM exacerbe la progression de l’insuffisance cardiaque. PPAR-α est un régulateur clé de divers gènes apparentés dans le système d’oxydation des acides gras des peroxydases cellulaires, des mitochondries et des microsomes, et joue un rôle clé pendant le métabolisme des lipides et la régulation de l’inflammation et de l’immunité.8 PPAR-α améliore le métabolisme des lipides par la bêta-oxydation mitochondriale et peroxydase des acides gras, médiée par la carnitine palmitoyl transférase-I (CPT-I).9 L’oxydation des acides gras longs et ramifiés10 réduit la synthèse et l’assemblage des lipoprotéines et des VLDL. 11 La régulation indirecte de la synthèse des acides biliaires favorise l’excrétion du cholestérol12 et inhibe l’expression des gènes associés à l’inflammation. L’expression de PPAR-α dans le foie est significativement plus faible chez les patients atteints de stéatose hépatique non alcoolique ou dans les modèles animaux de consommation élevée en graisses à long terme.13,14 Everett et al ont montré que les niveaux d’acides gras libres associés au foie augmentaient significativement dans les modèles murins knockout PPAR-α en raison d’un métabolisme lipidique atténué, favorisant la stéatose hépatique.15 Ces résultats suggèrent que le PPAR-α joue un rôle important dans la pathogenèse du métabolisme des lipides.

L’échinoside (ECH) est un composé naturel isolé des tiges decistanche tubulosa.Le produit chimique actif de l’ECH est un phényléthanoïde, qui présente des effets antioxydants, anti-fatigue, anti-tumoraux et anti-inflammatoires, et peut améliorer la mémoire, les nerfs et la protection du foie, et renforcer la régulation immunitaire.16,17 Dans l’étude sur les souris diabétiques db / db, il a été constaté que l’ECH pourrait améliorer la résistance à l’insuline, augmenter le niveau de HDL et réduire les niveaux de TG, TC et LDL, indiquant que l’ECH pourrait améliorer efficacement le métabolisme des lipides diabétiques.18 En outre, Shimoda et al ont prouvé que l’échinacoside pouvait affecter le métabolisme des lipides en régulant l’ARNm lié au transport des stérols hépatobiliaires

et le métabolisme.19 Des études antérieures ont montré que l’ECH régule l’expression du TGF-β et de ses gènes en aval pour améliorer la fibrose rénale chez les souris db/db.20 Dans cette étude, afin de mieux comprendre les effets protecteurs de l’ECH sur les lésions des cellules myocardiques dans le DCM et d’explorer ses mécanismes moléculaires potentiels, nous avons utilisé des souris db/db comme modèle de maladie DCM et exploré le ou les mécanismes régulateurs de l’ECH sur les protéines qui contrôlent les troubles du métabolisme du glucose et des lipides, stress oxydatif et apoptose dans les cardiomyocytes. Notre objectif était de fournir une base théorique pour le traitement efficace du DCM.

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Matériaux et méthodes

Produits chimiques et réactifs

La poudre ECH (pureté de 94 % détectée par HPLC, lot n° 190906) (supplément Figure 1) a été obtenue auprès de Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Shanghai, Chine). L’ECH a été dissous dans l’eau à 2 mg/mL et stocké à 4 °C dans l’obscurité. L’ECH a été administré à une dose de 100 à 500 mg/kg·j et significativement réduit

glycémie et amélioration des taux de lipides sanguins.18 L’ECH a montré des effets hypoglycémiques et antihyperlipidémiques dose-dépendants.

Animaux d’expérimentation et traitement

Les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH Pub. N° 85-23, révisé en 1996). Les protocoles ont été approuvés par le comité d’éthique des animaux expérimentaux et le Centre d’alimentation animale de l’hôpital Renmin de l’Université de Wuhan (Wuhan, Chine, n ° 20190517). Des souris mâles adultes C57BLKS/J db/db et des souris db/m (grade SPF) ont été achetées auprès de l’Institut de recherche biomédicale de l’Université de Nanjing à Nanjing (Nanjing, République populaire de Chine, numéro : SCXK (Sue) 2018-0001). Les animaux ont été mis en cage dans le centre animalier de l’hôpital Renmin (Wuhan, République populaire de Chine) à température ambiante (20 ° C), humidité relative de 50% à 60% et soumis à un cycle lumière/obscurité de 12 heures. L’alimentation adaptative a été effectuée pendant 1 h et aucun médicament hypoglycémiant n’a été administré.

Après la quarantaine, les souris db/db ont été assignées au hasard au groupe modèle de diabète (groupe db/db, n = 10), au groupe de traitement ECH (groupe db/db+ ECH, n = 11) ou au groupe témoin db/m (db/m, n = 9). À 8 semaines, les souris des groupes db/db et db/m ont reçu une solution saline orale de 0,05 mL/ 10 g de poids corporel pendant 10 semaines, tandis que les souris du groupe db/db+ECH ont reçu 300 mg/(kg/j) par voie orale.

ECH selon le poids corporel pendant 10 semaines. Le poids corporel des trois groupes de souris a été surveillé chaque semaine et l’alimentation, la consommation d’alcool et l’activité ont été évaluées. Une fois que les souris ont jeûné pendant 8 h, des échantillons de sang (~ 50ul) ont été prélevés à l’extrémité de la queue toutes les 2 semaines avec un glucomètre et un papier de test (Johnson & Johnson, Nouveau-Brunswick, NJ, États-Unis) pour déterminer les niveaux de glucose dans le sang. Après 10 semaines d’intervention, les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale avec 2% de pentobarbital sodique (Shanghai Harvest company, Shanghai, République populaire de Chine) (100 mg / kg). Le sang a été prélevé après l’insertion de l’aiguille capillaire et le sérum a été rapidement séparé et stocké à −80 °C pour analyse. Après une perfusion cardiaque avec du PBS froid pour éliminer le sang, le PBS libre a été retiré avec du papier filtre. Le tissu cardiaque a été séparé et pesé, et le poids sec du cœur a été mesuré. L’abdomen des souris a été rasé, l’abdomen a été ouvert après une désinfection à l’alcool (70%) et le tissu adipeux sous-cutané de l’abdomen a été rapidement retiré et pesé humide. Le tibia des souris a été isolé et mesuré. L’hypertrophie cardiaque a été évaluée en fonction du rapport entre le poids cardiaque et la longueur du tibia (HW/TL) (mg/mm). Les tissus cardiaques ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde (Google biotechnology, Wuhan, République populaire de Chine) et des biopsies ont été effectuées pour surveiller la morphologie du tissu myocardique. Le tissu cardiaque restant a été placé dans de l’azote liquide pendant 1 h et stocké à −80 °C avant la RT-PCR et l’analyse par transfert Western.

Échocardiographie

L’échographie (VisualSonics, Toronto, ON, Canada) a été réalisée pour des mesures échocardiographiques à la fin de l’expérience. Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale d’hydrate de chloral à 4% à 30 mg / kg pendant une demi-heure, rasées pour exposer la poitrine et fixées sur une plaque plate. Le diamètre systolique ventriculaire gauche (DVD), le diamètre diastolique LV (LVD), la fraction d’éjection LV (EF) et le raccourcissement fractionnaire LV (FS) ont été déterminés.

Paramètres métaboliques et biochimiques

À l’âge de 18 semaines, les échantillons de sang ont été centrifugés à 4 °C pendant 20 min pour la collecte de sérum. Un analyseur biochimique automatisé total (ADVID2400, Tokyo, Japon) a été utilisé pour détecter le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), les acides gras libres (FFA), le lipoprotéine-cholestérol de haute densité (HDL-c) et le lipoprotéine-cholestérol de basse densité (LDL-c) dans le sérum.

Anti-oxydation: cistanche tubulosa

Indice d’oxydation et niveaux d’antioxydants

Des tissus myocardiques ventriculaires gauches frais (50 mg) de chaque groupe ont été obtenus. Les niveaux de SOD, GSH-px et MDA dans les cellules myocardiques ont été déterminés à l’aide de kits commerciaux (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, Chine).

Coloration trichrome, Tunel et Soudan II La région ventriculaire gauche du tissu myocardique de chaque groupe de souris a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24h, incrustée de paraffine, sectionnée et colorée HE. Des changements pathologiques et morphologiques des fibres myocardiques de chaque groupe de souris ont été observés en microscopie optique (JEOL, Tokyo, Japon). L’apoptose des myocytes cardiaques a été détectée par des tests Tunel (numéro11684817910, Roche, États-Unis). Le tissu cardiaque a été prétraité avec du paraformaldéhyde, incorporé et tranché. Les sections ont été lavées avec du xylène I (Shanghai, République populaire de Chine) (20 min) -xylène II (20 min) -éthanol anhydre I (10 min) -éthanol anhydre II (10 min) -95% d’alcool (5 min)-90% d’alcool (5 min)-80% d’alcool (5 min) -70% d’alcool (5 min) et de l’eau distillée. Les sections ont été séchées par agitation et des anneaux de brosse histochimiques ont été utilisés pour prévenir la perte de liquide. La protéase K a été ajoutée aux anneaux pour couvrir le tissu. Après incubation à 37°C pendant 15 min, les lames ont été placées dans du PBS (pH 7,4) et lavées dans un shaker décolorant (trois fois pendant 5 min). Les réactifs 1 (TdT) et 2 (dUTP) ont été mélangés dans un rapport de 1:9 et ajoutés à la couverture interne du tissu. Les mélanges ont été incubés au bain-marie à 37°C pendant 60 min. Un petit volume d’eau a été ajouté pour maintenir l’humidité. Les lames ont été rincées dans du PBS et du DAPI taché (Aspen biologique, Wuhan, République populaire de Chine) dans l’obscurité pendant 5 min. Les lames ont été rincées dans du PBS et montées à l’aide d’un agent de trempe anti-fluorescence. Les sections ont été visualisées par microscopie fluorescente et photographiées. La coloration Sudan II a été utilisée pour observer l’accumulation de lipides dans les myocytes cardiaques. Les tissus ventriculaires gauches ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 10 % pendant 30 min, colorés avec du rouge Soudan II (Gefen, Shanghai, République populaire de Chine) à température ambiante pendant 10 min, décolorés avec 75 % d’alcool et recolorés dans du PBS pendant 15 min. Le rapport de la fibrose myocardique à la surface totale dans les sections trichromes colorées de Masson a été déterminé à l’aide du logiciel quantitatif Image-Pro Plus. Les lames ont été montées à l’aide de gélatine de glycérine et imagées par microscopie.

Résultats

Effets de l’ECH sur les souris Db/Db

Les souris des groupes db/db présentaient une polyphagie et une polyurie évidentes. La taille du corps était également significativement plus grande que celle des souris db / m. Le poids corporel dans le groupe db/db a significativement augmenté par rapport au groupe db/m (Figure 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

La glycémie à jeun a été évaluée sur une base hebdomadaire. Comme le montre la figure 1B, par rapport aux souris db/m, les taux de glucose dans le sang à jeun des souris db/db ont significativement augmenté avec l’âge et ont montré une hyperglycémie évidente (Figure 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Discussion

La cardiomyopathie diabétique est généralement divisée en quatre étapes. Au premier stade, la masse ventriculaire gauche a augmenté, le dysfonctionnement diastolique et la fraction d’éjection (FE) sont normaux. Même cliniquement asymptomatique, la fibrose myocardique a augmenté, le remplissage diastolique précoce a diminué et la pression diastolique terminale ventriculaire gauche a augmenté.22 La deuxième étape est caractérisée par une augmentation de la masse ventriculaire gauche, une épaississement des parois ventriculaires, un dysfonctionnement systolique et diastolique (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson’s="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

L’ATP est la source d’énergie de base pour le cœur. L’énergie cardiaque est fournie par l’oxydation et la décomposition de l’AF, qui représente environ 70% de l’apport énergétique cardiaque.29 Le reste est fourni par des glucides tels que le glucose et l’acide lactique.30 Les cœurs diabétiques sont soumis à une consommation d’énergie accrue et à des déséquilibres de la capacité myocardique, représentant la principale cause de troubles métaboliques myocardiques, y compris une diminution du métabolisme du glucose et une augmentation du métabolisme de l’AF. Cela conduit à une augmentation de l’absorption et de l’oxydation de l’AF conduisant à une accumulation adipeuse et à la formation de substances grasses toxiques, conduisant directement à des lésions DCM.31

Conclusions

Chez les souris db / db avec myocarde diabétique, le métabolisme du glucose et des lipides est dérégulé, ce qui entraîne une augmentation des niveaux de stress oxydatif et d’apoptose. Cette étude a confirmé que l’ECH peut réduire considérablement l’hyperglycémie à long terme chez les souris db / db grâce à la signalisation PPAR / M-CPT-1 / GLUT-4. Pendant ce temps, ECH a amélioré le stress oxydatif et inhibé l’apoptose myocardique chez les souris db / db DCM, ce qui peut être lié à une amélioration du métabolisme énergétique. Bien que les mécanismes sous-jacents régissant ces effets n’aient pas été découverts, ces résultats fournissent une nouvelle orientation pour le traitement du DCM et le rôle protecteur de l’ECH dans l’amélioration des lésions myocardiques.

Références

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