PARTIE Ⅰ : Effet des extraits de Cistanche Tubulosa sur la fonction de reproduction masculine chez les rats diabétiques induits par la streptozotocine-nicotinamide
Mar 04, 2022
Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com
Zwe-Ling Kong ® Athira Johnson® Fan-Chi Ko, Jia-Ling He et Shu-Chun Cheng
Résumé:Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une hyperglycémie due à une diminution des niveaux d'insuline ou à l'inefficacité des tissus à l'utiliser efficacement. L'infertilité est connue comme un résultat majeur du diabète et affecte le système reproducteur masculin en provoquant une altération du sperme et un dysfonctionnement gonadique.Cistanche tubulosaest une plante parasite qui a la capacité d'améliorer la mémoire, l'immunité et la capacité sexuelle, de réduire l'impuissance et de minimiser la constipation. Cette étude s'est concentrée sur l'investigation des effets anti-inflammatoires et protecteurs de l'échinacoside (ECH) chezExtrait de Cistanche tubulosa(CTE) sur le système reproducteur mâle de rats diabétiques. Les effets antioxydants, anti-inflammatoires et protecteurs du CTE ont été évalués par des méthodes in vitro et in vivo. Les résultats in vitro montrent que l'ECH inhibe la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et améliore l'expression des protéines StAR, CYP11A1, CYP17A1 et HSD17p3. L'analyse in vivo a été réalisée avec trois doses d'échinacoside (ECH) (80, 160 et 320 mg/kg) en CTE. Au total, 0,571 mg/kg de rosiglitazone (RSG) a été administré comme contrôle positif. Le diabète a été induit par la streptozotocine (STZ) (65 mg/kg) et le nicotinamide (230 mg/kg) en association avec un régime riche en graisses (45 pour cent). Les études in vivo ont confirmé que l'ECH améliorait la glycémie, la résistance à l'insuline, la résistance à la leptine et la peroxydation lipidique. Il peut restaurer la kisspeptine 1 (KiSS1), le récepteur couplé aux protéines G GPR 54, le suppresseur de la signalisation des cytokines 3 (SOCS-3) et l'expression de l'acide ribonucléique messager (ARNm) de la sirtuine 1 (SIRT1) dans l'hypothalamus et récupérer le sexe niveau hormonal. Ainsi, cette étude a confirmé les effets antioxydants, anti-inflammatoires et stéroïdogenèses du CTE.
Mots clés:Diabète; infertilité;Extrait de Cistanche tubulosa (CTE); l'échinacoside (ECH); activité anti-inflammatoire; activité antioxydante; effets de la stéroïdogenèse
Traitement du diabète :Extrait de Cistanche tubulosa(CTE)
1. Introduction
Le diabète sucré (DM) est une affection caractérisée par une augmentation du taux de glucose dans le sang en raison de l'inefficacité du pancréas à produire suffisamment d'insuline ou de l'incapacité de l'organisme à l'utiliser efficacement. Selon l'OMS, le nombre de personnes atteintes de diabète est passé de 108 millions en 1980 à 422 millions en 2014 [1]. Il existe quatre catégories principales : le prédiabète (un stade antérieur au diabète), le type 1 (lorsque le pancréas ne produit pas d'insuline), le type 2 (le corps ne parvient pas à utiliser l'insuline) et le diabète gestationnel (qui survient pendant la grossesse). Le stress oxydatif se produit en raison du déséquilibre entre la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et d'antioxydants [2] conduisant finalement à l'état diabétique. Les complications du diabète comprennent l'insuffisance rénale, les lésions nerveuses, la cécité, les accidents vasculaires cérébraux, les crises cardiaques, la mort fœtale et l'infertilité. [1]. Des études montrent que les noyaux des spermatozoïdes, l'acide désoxyribonucléique (ADN) et les mitochondries ont été considérablement endommagés chez les patients diabétiques de sexe masculin [3]. Le stress oxydatif pendant le transport du sperme va altérer le processus du système reproducteur masculin [4,5].
Le processus de spermatogenèse est contrôlé par l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG). L'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) produite par l'hypothalamus stimule la production de l'hormone lutéinisante (LH) et de l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Les cellules de Leydig se trouvent à côté du tubule séminifère et produisent de la testostérone sous le contrôle de la LH. La FSH déclenche la production de protéine de liaison à l'antigène (ABP) qui aide à faire passer l'hormone mâle. Ainsi, l'infertilité et d'autres problèmes surviennent principalement en raison des perturbations qui se produisent dans l'axe HPG. L'administration de la combinaison de streptozotocine-nicotinamide induit le diabète chez des rats expérimentaux. La streptozotocine est un composé chimique toxique pour les cellules p productrices d'insuline dans le pancréas et le nicotinamide est une vitamine hydrosoluble qui protège les cellules p des dommages complets [6].
Cistanche tubulosa est une espèce de plante du désert également connue sous le nom de "Rou Cong-Rong" [7]. C'est une plante parasite non chlorophyllienne qui pousse principalement sur la racine de l'arbre Calotropis Procera et est largement répandue dans les terres arides du Gansu, du Qinghai, du Xinjiang, de la Mongolie, de l'Iran et de l'Inde. Le nom commun de Cistanche tubulosa est "Desert Hyacinth". Il est largement accepté dans la médecine traditionnelle chinoise et a reçu le nom de "Ginseng du désert". Il est largement utilisé dans le domaine médical pour traiter les leucorrhées morbides, les métrorragies abondantes, les maladies rénales chroniques, la constipation, l'impuissance et l'infertilité. Constituants chimiques deCistanche tubulosase composent de glycosides phényléthanoïdes non volatils (PHG), d'iridoïdes, de lignanes, d'huiles volatiles, d'alditols, d'oligosaccharides et de polysaccharides [8]. Des études montrent que l'échinacoside de cette plante protège le fibroblaste endommagé en régulant les niveaux de ROS [9]. Ce composé produit des activités antioxydantes, vasorelaxantes et anti-inflammatoires ainsi qu'une neuroprotection et une prévention de l'ostéoporose [10,11].
Cette étude visait à étudier leseffet de l'extrait de Cistanche tubulosacontenant de l'ECH sur le dysfonctionnement de la reproduction du rat diabétique induit par la streptozotocine-nicotinamide.
Cistanche tubulosa
2. Matériels et méthodes
2.1.Matériaux
ECH et CTE ont été achetés auprès de Sinopharm Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taiwan). Les produits finaux de glycation avancée (AGE) ont été achetés chez Biovision (San Francisco, CA, USA). Les lignées cellulaires LC-540 et TM3 ont été achetées auprès du Food Industry Research and Development Institute (Hsinchu, Taiwan). Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) âgés de cinq semaines ont été achetés au National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Feed Lab Diet® a été acheté auprès de PMI Nutrition International, Inc. (Taipei, Taiwan). Le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) a été obtenu auprès de Sigma (St. Louis, MO, USA). Le méthanol et l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) ont également été achetés auprès de Sigma. Le milieu Eagle modifié de Dulbecco/F12 et la trypsine-EDTA ont été obtenus auprès de GIBCO (New York, NY, USA). 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2, 5-bromure de diphényltétrazolium (MTT), diacétate de dichloro-dihydro-fluorescéine (DCFH-DA), le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le nitroblue tétrazolium (NBT) ont été achetés chez Sigma. Des kits enzymatiques de glucose ont été obtenus auprès de Kyokutoseiyaku, Tokyo, Japon. Les kits ELISA d'insuline ont été achetés auprès de Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Uppsala, Suède). Le réactif d'extraction de protéines tissulaires T-PER a été acquis auprès de Thermo Scientific (Chicago, IL, États-Unis). Des anticorps polyclonaux anti-facteur nucléaire humain/souris/rat-kappa B NF-kB ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis. Les anticorps polyclonaux anti-récepteur de souris/rat pour les produits finaux de glycation avancée (RAGE), les anticorps polyclonaux anti-humain/souris/rat StAR et les anticorps monoclonaux anti-humain/souris/rat Cytochrome P450 17A1 ont été achetés auprès de Gene Tex (Irvine, Californie, États-Unis). Les anticorps polyclonaux anti-humain/souris/rat CYP11A1 ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, PA, USA). Le réactif easy-Blue a été acheté chez Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA). L'agarose et le marqueur ADN de 100 pb ont été obtenus auprès de Promega, Corporation (Madison, WI, USA). RNeasy Lipid Tissue Mini Kit a été acheté auprès de QIAGEN, Hilden, Allemagne.
2.2.Méthodes
2.2.1. Analyse in vitro
Culture cellulaire LC{{0} et TM3 : les lignées cellulaires LC-540 ont été cultivées à 37 OC dans le milieu Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) additionné de bicarbonate de sodium (1,5 g/L), L -glutamine (2 mM), acides aminés non essentiels (0.1 mM), pyruvate de sodium (1.0 mM) et sérum de veau fœtal (FBS) (10 %) dans un 5 incubateur à CO2 (incubateur à CO2, Napco 5410, Taïwan). La lignée cellulaire TM3 a été cultivée dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de glucose (4,5 g/L), de pyruvate de sodium (0,5 mM), de L-glutamine (2,5 mM), de bicarbonate de sodium (1,2 g/L), 4-(2-hydroxyéthyl)-1-acide pipérazineéthanesulfonique (HEPES, 15 mM) et sérum de veau fœtal (FCS, 10 %) ou sérum de cheval (5 %) à 37 OC dans un cycle de 5 incubateur à pourcentage de CO2.
Détermination de la viabilité cellulaire de l'échinacoside (ECH) : le réactif 3-(4, 5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- bromure de diphényltétrazolium (MTT) a été utilisé pour le test de viabilité cellulaire. La concentration cellulaire a été ajustée à 2 x 105 cellules/mL dans une plaque à puits 96-. Ensuite, 20 µl d'ECH (dilué dans 2 % de milieu) ont été ajoutés et incubés pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Plus tard, 100 µl de réactif MTT ont été ajoutés et incubés pendant 4hat37 OC dans des conditions d'obscurité. L'absorbance a été mesurée à 570 nm (lecteur ELISA, Dynatech MR5000, Kloten, Suisse).
CeH viabiHiy rétif (pourcentage)=[(Échantillon à 570 nm – Blanc à 570 nm)]/[(Acontrôle à 570 – Blanc à 570)] x 100.
Essai de réduction du Nitroblue Tetrazolium (NBT) et essai du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) : le nombre de cellules a été ajusté à 1x 1{{10}}6 cellules/mL . Ensuite, 5 0 mg/mL d'ECH, de resvératrol (RES) et de produits finaux de glycation avancée (AGE) (contrôle) ont été ajoutés et co-cultivés pendant 18 h à 37 OC. Ensuite, 0,3 mL de solution de NBT (0,1 mg/mL de NBT, 5 % de FBS et 3 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dissous dans 10 mL de DMEM) ont été ajoutés et incubés à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 1 h. Après centrifugation (à 800 xg pendant 3 min), le surnageant a été éliminé et 200 µL de DMSO ont été ajoutés et secoués pendant 5 min dans un oscillateur à ultrasons (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Taiwan). L'absorbance a été mesurée à 630 nm. Pour le dosage des radicaux DPPH, le Trolox (dans de l'alcool à 95 %) a été pris comme étalon. Ensuite, 75 µl de solution DPPH 0,5 mM ont été mélangés avec 25 µl d'échantillons et laissés réagir à température ambiante dans un endroit sombre pendant 30 min. Le mélange a été secoué et l'absorbance a été mesurée à 517 nm.
Analyse de la teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) : le nombre de cellules a été ajusté à 2 x 105 cellules/mL dans une plaque à puits 12- contenant 2 % de FBS. Ensuite, 50 μL/mL d'ECH, RES et AGE ont été ajoutés à la plaque et incubés à 37 OC pendant 24 h. Après 24 h, du 2Z,7Z-dichlorofluorescéine-diacétate (DCFH-DA) a été ajouté et incubé à 37 °C pendant 30 min. Après centrifugation (400 x g, 5 min), le surnageant a été retiré et les cellules lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après que les cellules ont été mises en suspension dans 1 ml de PBS et que les niveaux de ROS ont été déterminés à l'aide d'un cytomètre en flux (Flow Cytometer, Becton Dickinson, CA, USA).
Identification et analyse quantitative des protéines : les protéines ont été extraites à l'aide d'un réactif d'extraction de protéines (T-PER). La densité cellulaire a été ajustée à 2 x 105 cellules/ml dans une plaque à puits 12- et 50 μL/mL d'ECH, de RES et d'un récepteur pour l'antagoniste du produit final de glycation avancée (RAGE), et des AGE ont été ajoutés et incubé à 37°C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 24 h. Ensuite, 400 μL de T-PER ont été ajoutés, grattés des cellules et centrifugés à 125 000xg pendant 20 min (4 OC). Le surnageant a été collecté et stocké à -80 OC (-80 congélateur OC, Nuaire, Plymouth, MN, USA) pour une analyse plus approfondie. Le kit d'acide bicinchoninique (BCA) a été utilisé pour la quantification des protéines. Ensuite, 10 µL de solution cellulaire standard et 200 RL de réactif BCA ont été ajoutés à des plaques à puits 8- et incubés à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 30 min. L'absorbance a été mesurée à 562 nm. L'analyse d'identification des protéines a été réalisée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium (SDS)-polyacrylamide (SDS-PAGE). Des échantillons ont été préparés en ajoutant du lysat de protéines au tampon de chargement de protéines et une analyse Western blot a été effectuée pour détecter les protéines spécifiques.
2.2.2.Analyse in vivo
Conception du modèle animal : soixante {{0}} rats mâles Sprague-Dawley (SD) âgés d'une semaine ont été achetés au National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Chaque rat a été logé individuellement dans des cages désinfectantes en acier inoxydable sous température contrôlée (23 土 1 degré) et humidité (40-60 pour cent) avec un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité. La nourriture et l'eau étaient fournies ad libitum. Chaque rat a été domestiqué au cours de la première semaine et a reçu le régime 5001 pour rongeurs de laboratoire comme régime principal. Toutes les procédures ont suivi la norme du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC Approval No. 101026) de l'Université nationale de l'océan de Taiwan, Taiwan. Après domestication, les rats ont été divisés en deux groupes : le groupe témoin (Con) qui a été nourri avec le régime de laboratoire 5001 et le groupe diabétique qui a été nourri avec un régime riche en graisses (HFD, 40 %) pendant toute l'expérience. Après avoir été nourris avec le HFD pendant 4 semaines, les rats du groupe diabétique ont reçu une injection de streptozotocine (65 mg/kg) (STZ) pour induire le diabète sucré (DM). Dans les 15 minutes suivant l'injection de STZ, du nicotinamide (230 mg/kg de poids corporel) a été injecté. Une semaine après l'injection, un test oral de tolérance au glucose (OGTT) a été effectué pour déterminer l'induction réussie du diabète sucré (DM). Après cela, les animaux ont été divisés en six groupes : le contrôle (nourri avec le régime de laboratoire 5001) ; Groupe DM (DM plus 45 % HFD) ; Groupe DMR (DM plus rosiglitazone : 0,571 mg/kg de poids corporel) plus 45 % de HFD ; groupe DME1 (DM plus CTE : 80 mg/kg de poids corporel) plus 45 % de HFD ; groupe DME2 (DM plus CTE : 160 mg/kg de poids corporel) plus 45 % de HFD ; et groupe DME4 (DM plus CTE : 320 mg/kg de poids corporel) plus 45 % de HFD. La rosiglitazone (RSG) a été prise comme témoin positif. Trois doses de CTE (80, 160 et 320 mg/kg) ont été utilisées conformément aux recommandations des directives d'évaluation fonctionnelle des aliments santé de la Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Les traitements ont été donnés jusqu'à la fin de l'expérience. Tous les rats expérimentaux ont été sacrifiés après 6 semaines. Le sang prélevé sur les rats a été centrifugé à 3000 tr/min pendant 15 min à 4 degrés.
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Le surnageant a été examiné pour l'analyse suivante
Détermination du glucose total, des triglycérides et du cholestérol : La détermination du glucose a été effectuée par des kits enzymatiques de glucose. Ensuite, 20 ug d'échantillons de plasma sanguin ont été ajoutés aux réactifs et maintenus à 37 degrés pendant 5 min. Les concentrations de triglycérides totaux et de cholestérol total ont été déterminées en utilisant des kits enzymatiques de triglycérides et de cholestérol. Ensuite, 10 ^L de plasma sanguin ont été ajoutés aux réactifs et l'expérience a été menée selon les instructions du fabricant. L'absorbance a été mesurée à 510 nm.
Glucose/triglycérides/cholestérol plasmatiques totaux (mg/dL)=(-ABlank)/(Astandard - ABlank) x 200.
Un échantillon : Absorbance des échantillons de sang, A Blanc : Valeur d'absorbance des kits sans échantillon, A standard : Valeur d'absorbance du réactif standard, 200 : réactifs standard à une concentration de 200 mg/dL.
Détermination de l'insuline, de la leptine et du modèle homéostatique d'évaluation de la résistance à l'insuline (HOMA-IR): Le niveau d'insuline a été déterminé par des kits ELISA d'insuline. Ici, 25 pg de plasma sanguin ont été ajoutés aux réactifs et l'absorbance a été mesurée à 450 nm. La teneur totale en leptine a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage immunométrique enzymatique de la leptine. Ensuite, 100 plasmas ont été analysés et l'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur ELISA. Toute l'expérience a été menée selon les instructions du fabricant. La valeur HOMA-IR a été déterminée à partir de l'équation d'évaluation du modèle d'homéostasie=Concentration d'insuline plasmatique à jeun (mU/mL) x concentrations de glucose plasmatique à jeun (mmol/L)/22,5.
Peroxydation des lipides plasmatiques : ici, {{0}} 0,5 mL de plasma sanguin ont été mélangés avec 1 mL de réactif (15 %, p/v d'acide trichloroacétique dans 0 0,25 N d'acides chlorhydriques (HCl ) et 0.375 %, p/v d'acide thiobarbiturique dans HCl 0,25 N) et placé dans un bain-marie (Bain-marie, BUCHI461, Zurich, Suisse) à 100 °C pendant 15 min. Après refroidissement, 1 ml de n-butanol a été ajouté, secoué vigoureusement et centrifugé à 1500 xg pendant 10 min. Le surnageant a été recueilli et l'absorbance a été mesurée à 532 nm [12].
Concentration de malondialdéhyde (MDA) (nM/mL)=[(Échantillon à 532 nm - Blanc à 532 nm)/ (Étalon à 532 nm - Blanc à 532 nm)] x 5.
Détermination des taux plasmatiques de testostérone et d'hormone lutéinisante (LH) : Le kit ELISA de testostérone a été utilisé pour mesurer le taux de testostérone dans le plasma sanguin. Le kit RIA a été utilisé pour déterminer la concentration de LH. Ensuite, 50 μL de plasma ont été ajoutés et les calculs ont été basés sur la concentration de l'hormone LH-RP-3 (standard). Les étapes suivantes ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant.
Détermination du facteur de nécrose tumorale (TNF)-a et de la concentration d'interleukine-6 (IL-6) : l'anticorps capturé a été dilué 250 fois dans un tampon de revêtement, ajouté à un {{4} } plaque à puits (100 μL/puits) et conservée à 4 degrés C pendant la nuit. Le surnageant a été aspiré et lavé cinq fois avec un tampon de lavage (1 fois PBS, 0,05 % de Tween 20). Après incubation (1 h) avec 200 μg de diluant de test, les cellules ont été lavées 5 fois avec du tampon de lavage et 100 μl de solution standard de TNF-a ou d'échantillons de test ont été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 2 h. Après lavage, 100 RL d'anticorps détectés par IL-6 ont été ajoutés et incubés pendant 1 h à température ambiante. Le surnageant a été aspiré et lavé 5 fois. Ensuite, 480 RL d'enzyme avidine-peroxydase de raifort (HRP) ont été ajoutés et incubés pendant 30 min à température ambiante. Le surnageant a été aspiré et lavé cinq fois avec un tampon de lavage. Ensuite, 100 RL de solution de substrat ont été ajoutés et incubés pendant 15 min à température ambiante. Plus tard, 50 RL de solution d'arrêt (acide phosphorique 1M) ont été ajoutés à chaque puits et l'absorbance a été mesurée à 450 nm.
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Analyse des paramètres du sperme et des testicules
Collecte d'échantillons de sperme : La collecte d'échantillons de sperme a été réalisée selon la méthode précédemment rapportée dans [13]. Les spermatozoïdes ont été prélevés du surnageant et utilisés pour une analyse plus approfondie.
Le nombre de spermatozoïdes, la motilité des spermatozoïdes et les spermatozoïdes anormaux : le nombre de spermatozoïdes a été calculé à l'aide de l'hémocytomètre et de la solution de bleu trypan. Ensuite, 100 RL de liquide de sperme ont été mélangés avec une solution de bleu trypan, et le nombre de spermatozoïdes, la motilité et les spermatozoïdes anormaux ont été calculés à l'aide d'un hémocytomètre et d'un microscope [14].
Réduction de NBT de tétrazolium bleu nitré et peroxydation lipidique du sperme et des testicules : La peroxydation lipidique et la réduction de NBT ont été analysées selon la même procédure d'analyse plasmatique.
Détermination de l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase : L'activité de la superoxyde dismutase (SOD) a été analysée en utilisant le kit RANSEL. Ici, {{0}}.05 mL d'homogénats testiculaires ont été ajoutés à 1,7 mL de solution de réaction (0.05 mM xanthine, 0,025 mM 2-({ {9}}iodophényl)- 3-(4-nitrophénol)-5-chlorure de phényltétrazolium (INT)). Après mélange, 0,25 ml de xanthine oxydase (80 U/L) ont été ajoutés et mis à réagir à température ambiante pendant 30 s à température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 505 nm. La concentration en protéines de l'homogénat testiculaire a été déterminée par le kit d'analyse de protéines Bio-Rad DC et son activité spécifique (U/mg de protéine) a été calculée. L'activité catalase (CAT) a été déterminée selon une méthode précédemment rapportée [15].
Coloration H&E (hématoxyline et éosine)
Le testicule a été trempé dans 10 % de formol pendant 24 h et stocké à 4 °C. Tranché les tissus en taille micro et attaché à la lame. Après fixation (95 % de méthanol plus 5 % d'acide acétique), les lames ont été immergées dans de l'hématoxyline pendant 3 minutes, lavées à l'eau courante pendant 5 minutes, puis trempées dans de l'alcool à 50 %, 70 % et 90 % pendant une minute. Après cela, les lames ont été colorées avec de l'éosine pendant 10 s et trempées dans de l'alcool à 100 % pendant une minute jusqu'à ce qu'elles s'estompent. Enfin, la lame a été trempée dans du xylène pendant une minute. Plus tard, la lame a été séchée à l'air et scellée. Le tube coloré a été placé dans un microscope à contraste de phase inversé (microscope à différence de phase inversée, Olympus CK-2, Tokyo, Japon) pour observer la morphologie.
Analyse de l'hypothalamus
Les séquences du gène KISS1, du récepteur couplé aux protéines G (GPR) 54, du suppresseur de la signalisation des cytokines 3 (SOCS-3) et de la sirtuine 1 (SIRT1) de la souris ont été identifiées à partir de la base de données génétiques du NCBI (National Center for Biotechnology Information) et une amorce spécifique a été conçue à l'aide de Primer 5.0 PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA, USA.). Les amorces utilisées dans l'expérience sont répertoriées dans le tableau 1.
Extraction de l'acide ribonucléique (ARN) de l'hypothalamus. L'extraction de l'ARN de l'hypothalamus du cerveau a été réalisée à l'aide du RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Les ARNm obtenus ont été mesurés quantitativement par transcription inverse (RT) et réaction en chaîne par polymérase (PCR). L'ADN complémentaire obtenu à partir de l'analyse RT a été stocké à -20 degré pour une utilisation ultérieure. L'ADN extrait a été soumis à une analyse par réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l'aide de la polymérase Taq. Ensuite, 5 à 10 ^L du produit de PCR ont été prélevés et analysés par électrophorèse sur un colloïde d'agar à 1,5 %. L'image a été prise dans un système d'imagerie UVP BioDoc-It. L'acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) transcrit inversement a été prélevé et la PCR a été réalisée à l'aide du kit IQ SYBR Green Supermix. Plus tard, il a été analysé avec le logiciel de système optique iQTM 5. Les protéines ont été extraites en utilisant un réactif d'extraction de protéines (T-PER). Ensuite, 20 mg d'homogénat testiculaire ont été ajoutés à 400 ^L de T-PER et centrifugés (centrifugeuse à grande vitesse, Hettich CR-12, Tuttlingen, Allemagne) à 4 degrés (125,000 xg) pour 20 min. La méthode suivante était similaire à "l'analyse d'identification et de quantification des protéines" par analyse in vitro.
2.3.Analyse statistique
Les résultats expérimentaux ont été exprimés sous forme de moyenne 土 écart type (Moyenne 土 SD) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Armonk, New York, NY, USA. Les différences entre les groupes ont été analysées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Des comparaisons multiples de différents groupes ont été analysées par le test de Duncan à la valeur de p < 0.05="" comme="" niveau="">
