Effets des glycosides de cistanche sur l'apprentissage de la cognition et de la plasticité synaptique chez des rats modèles de privation de sommeil

ABSTRAIT

Objectif : « Explorer si leglycosides de cistanchepeut améliorer laapprentissage et fonction cognitive de la privation de sommeilmodèles de rats parréguler la plasticité synaptique. Méthodes : Cinquante rats Wistar mâles ont été répartis au hasard en groupe témoin vierge (Contrôle), groupe témoin plate-forme (PC), groupe modèle (Modèle),glycosides du groupe cistanche(GC) et le groupe estazolam (Est). Le modèle de privation de sommeil des rats a été préparé par une méthode modifiée d'environnement aquatique multiplateforme. Un labyrinthe aquatique Morris et un test en plein champ ont été utilisés pour détecter les rats.fonction cognitive spatiale aet des changements émotionnels. La coloration Nissl a été utilisée pour observer les changements demorphologie et quantité de cellules nerveusesdans la zone CAl de l'hippocampe du rat. Le Western blot et le R'T - PCl ont été utilisés pour détecter les niveaux d'expression de la synaptophysine (SYN), de la substance dense membranaire post-synaptique 95 ( PSD - 95) et du facteur neurotrophique dérivé du cerveau ( BDNF). Résultats : Les résultats du labyrinthe aquatique Morris ont montré que par rapport au groupe témoin, leapprentissage et capacité cognitivedes rats dans le groupe modèle était significativement diminué ( P<0. 05 ), and thefonction d'apprentissage et de mémoire des ratsle traitement par GC a été amélioré (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Conclusion: Glycosides de cistanchepeut affecter la plasticité synaptique en régulant l'expression de marqueurs synaptiques, améliorant ainsi l'apprentissage et la fonction cognitive des rats modèles de privation de sommeil.

MOTS CLÉSGlycosides de cistanche ; Hippocampe ; Privation de sommeil ; Apprentissage et mémoire ; Anxiété; Plasticité synaptique

GLYCOSIDES DE HAUT NIVEAU DE CISTANCHE À VENDRE

Trouble du sommeil (SD)est untrouble fonctionnel du sommeilcausée par une série de facteurs complexes tels que l'insomnie, les rêves fréquents et la facilité des réveils. L'incidence du SD a progressivement augmenté ces dernières années. Des études connexes ont rapporté que le SD peut causermaladies cardiovasculaires, dysfonctionnement métabolique, maladies immunitaires, et les maladies dégénératives du système nerveux central telles que la maladie d'Alzheimer [1]. Le SD peut provoquer des dommages oxydatifs aux neurones de l'hippocampe, provoquer un dysfonctionnement cognitif et produire des changements d'humeur tels que l'anxiété et la dépression [2]. La cistanche deserticola est une matière médicinale chinoise précieuse qui peut être utilisée comme médicament et comme aliment. Il a pour effet de tonifier les reins et de reconstituer le qi, d'humidifier les intestins, de favoriser les selles et de renforcer le yang. L'extrait principal de Cistanche deserticola, les glycosides de cistanche (GC), a des effets antioxydants, anti-apoptotiques, protecteurs du foie et neuroprotecteurs [3]. Nos recherches précédentes ont montré que les GC peuvent améliorer l'apprentissage et la fonction cognitive des souris SAMP8 en jouant un rôle antioxydant et anti-apoptotique [4]. Des études connexes ont montré que le dysfonctionnement cognitif provoqué par le SD est étroitement lié à la plasticité synaptique [5]. Cependant, il existe peu de rapports sur le mécanisme par lequel les GC régulent la plasticité synaptique et améliorent les troubles de l'apprentissage et de la mémoire ainsi que le déclin cognitif chez les rats induits par la privation de sommeil. Par conséquent, cette étude vise à explorer si les GC affectent la plasticité synaptique en régulant l'expression de marqueurs synaptiques, améliorant ainsi l'apprentissage et la fonction cognitive des rats dans le modèle de privation de sommeil, et fournissant de nouvelles idées et plans de traitement pour le traitement de l'apprentissage et déficience cognitive causée par des troubles du sommeil avec les GC.

1 Matériels et méthodes

1.1 Animaux expérimentaux

Des rats Wistar mâles âgés de 6 à 8 semaines, pesant 280 à 300 g, ont été achetés à Beijing Sibeifu, avec une licence de production animale [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Tous les animaux ont été gardés au Centre d'expérimentation animale du Baotou Medical College dans les conditions suivantes : température (24 ± 1) degrés, humidité de 50 % à 55 %, 12 h de lumière et 12 h d'obscurité, et aucune restriction sur la nourriture et l'eau. Cette expérience a été approuvée par le comité d'éthique de l'école [Baoyi Lunshen 2022 n° (63)].

1. 2 Principaux réactifs et instruments

Les glycosides totaux de Cistanche deserticola ont été achetés auprès de Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (numéro de lot : KSM20220609011) ; Les comprimés d'Estazolam ont été achetés auprès du CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (numéro de lot : 044220343) ; le tampon de chargement de protéines (P1015), le tampon de lyse RIPA (R0010), la solution chimioluminescente (PE0010), etc. ont tous été achetés auprès de Beijing Solebao ; anticorps de la substance de densité post-synaptique 95 (PSD-95) (AB192757), anticorps de la synaptophysine (SYN) (ab32127), acheté chez Abcam, États-Unis ; facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) (48503-2), -actine (52901), acheté auprès de SAB, États-Unis ; anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin (SA00001-20), acheté chez Proteintech, USA ; mélatonine de rat (MT), kit ELISA (MM-0657R1), acheté auprès de Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Trancheuse à paraffine (Leica, Allemagne) ; microscope optique (Leica, Allemagne) ; Labyrinthe aquatique Morris, boîte d'essai en champ ouvert (Shanghai Xinruan) ; instrument d'électrophorèse verticale

(Société Liuyi de Pékin); agitateur de décoloration (Beijing Liuyi Company); système d'analyse d'imagerie protéique (Shanghai Tanon Technology) ; Instrument de PCR quantitative à fluorescence (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Méthodes expérimentales

1. 3. 1 Regroupement d'animaux et administration de médicaments

50 rats Wistar mâles ont été divisés au hasard en groupe témoin vierge (groupe témoin), groupe témoin plateforme (contrôle plateforme, groupe PC), groupe modèle (groupe modèle), glycosides totaux du groupe Cistanche deserticola (groupe GC). , 50 mg/kg) et le groupe estazola (groupe Est, 0,54 mg/kg), avec 10 rats dans chaque groupe. Le groupe témoin et le groupe PC ont reçu une solution saline à 0,9 % par gavage. Tous les groupes ont été gavageés à 7 heures du matin tous les jours après le début de la modélisation, et le gavage a duré 21 jours.

1. 3. 2. Préparation d'un modèle animal en privation de sommeil

Le modèle de privation de sommeil a été établi à l'aide de la méthode modifiée de l'environnement aquatique multiplateforme [6]. L'équipement expérimental était un réservoir d'eau rectangulaire en résine de polyéthylène de 130 cm × 50 cm × 45 cm. Une petite plateforme d'un diamètre de 5 cm et d'une hauteur de 20 cm a été placée dans le réservoir d'eau. La plateforme du groupe PC avait un diamètre de 10 cm et une hauteur de 20 cm. Le réservoir d'eau a été rempli d'eau jusqu'à une profondeur d'environ 18 cm et la température de l'eau a été maintenue à (20 ± 1) degrés. Une semaine avant le début de l’expérience, les rats ont été placés quotidiennement dans la boîte de privation de sommeil pendant 60 minutes afin de se familiariser avec l’environnement. Une fois le modèle établi, à l'exception du groupe témoin, les rats de chaque groupe ont été placés sur la petite plate-forme à temps, de 8 h à 20 h, tous les jours pour une privation de sommeil pendant 21 jours consécutifs. Tous les rats ont été autorisés à manger et à boire librement et à se déplacer librement sur la plate-forme, avec 12 heures d'alternance de lumière et d'obscurité chaque jour.

1.3.3 Expérience du labyrinthe aquatique Morris

Le labyrinthe aquatique Morris a été divisé en 4 zones remplies d’eau et la plate-forme a été placée dans le 4ème quadrant. La surface de l'eau se trouvait à environ 2 cm au-dessus de la plateforme. De la mélanine comestible de qualité alimentaire a été ajoutée à l'eau et la température de l'eau a été maintenue à (25 ± 1) degrés. (1) Expérience de navigation par positionnement : le centre de chaque zone a été sélectionné et les rats ont été doucement placés dans l'eau. Ils étaient autorisés à explorer librement. Le temps nécessaire aux rats pour trouver la plate-forme cible en 60 secondes a été enregistré. Les rats qui n’ont pas trouvé la plate-forme ont été guidés vers la plate-forme et y sont restés 20 secondes. La formation s'est poursuivie pendant 5 jours. (2) Test d'exploration spatiale : Au 6ème jour, la plateforme a été retirée et les rats ont été placés dans l'eau depuis le centre du 2ème quadrant contre la paroi. Le nombre de fois où les rats ont dépassé la plate-forme en 120 s et le temps pendant lequel ils sont restés dans le 4ème quadrant ont été enregistrés.

1.3. 4 Expérience en plein champ

Une boîte expérimentale de 100 cm × 100 cm × 50 cm a été utilisée et le fond de la boîte a été divisé en 9 grilles. Chaque groupe de rats a été placé au préalable dans la salle expérimentale en plein champ pour s'adapter à l'environnement intérieur pendant 60 minutes. Au début de l'expérience, les rats testés ont été placés tour à tour dans les coins fixes de la boîte expérimentale en champ ouvert, et le nombre de temps debout, la distance de mouvement et le temps statique des rats dans les 5 minutes ont été enregistrés à l'aide d'un logiciel d'analyse comportementale. . L'environnement devait être calme pendant l'expérience et le dispositif expérimental était essuyé avec de l'eau propre et de l'alcool respectivement entre deux expériences pour éviter que l'odeur du rat précédent n'affecte le jugement comportemental du rat suivant.

1. 3. 5 Test immuno-enzymatique (ELISA)

Détection des taux sériques de MT chez les rats Les rats ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale et 5 ml de sang ont été prélevés dans l'aorte abdominale. Après avoir attendu 30 minutes à température ambiante, le sang a été centrifugé pour obtenir du sérum. 40 µL de diluant d’échantillon ont été ajoutés à chaque puits, puis 10 µL de l’échantillon à tester ont été ajoutés. Après avoir scellé avec le film de scellement, incuber à 37 degrés pendant 30 min. Laver 5 fois, ajouter 50 μL de solution de marquage enzymatique et incuber à 37 degrés pendant 30 minutes après avoir scellé avec le film de scellement. Laver 5 fois, puis ajouter tour à tour la solution révélatrice de couleur et la solution d'arrêt de réaction. La valeur OD de chaque puits a été mesurée par l'instrument de marquage enzymatique à une longueur d'onde de 450 nm.

１. ３. ６ Coloration Nissl

Trois rats ont été prélevés dans chaque groupe et le tissu cérébral a été prélevé par décapitation. Le tissu cérébral a été fixé avec une solution à 4 % de polyméthacrylate de méthyle, et le tissu a été déshydraté, immergé dans une solution de cire et incorporé, et le tissu a été tranché par des méthodes conventionnelles. Les tranches ont été conservées sur une épaisseur de 5 µm, rincées au PBS, colorées au 0. 1 % de bleu de toluidine pour 0. 5 h, différencié avec de l'alcool à 95 %, déshydraté avec de l'alcool à 100 %, transparentisé au xylène et scellé avec de la gomme neutre. Les changements dans la morphologie et le nombre de neurones dans la région CA1 de l'hippocampe du rat ont été observés au microscope et des images ont été collectées.

１. ３. 7 Expérience de Western Blot

Quatre rats ont été sélectionnés dans chaque groupe et l'hippocampe a été isolé par décapitation. Le tissu de l'hippocampe a été mélangé avec du tampon de lyse RIP A dans un bain de glace et centrifugé pour obtenir le surnageant. La concentration en protéines a été détectée par la méthode BCA. 20 µg de protéine ont été ajoutés avec un tampon de chargement de protéines pour l'électrophorèse. Une fois l'électrophorèse des protéines terminée, la membrane a été transférée à un débit constant de 300 mA, bloquée avec 5 % de lait écrémé en poudre, l'anticorps primaire a été incubé à 4 degrés pendant la nuit et l'anticorps secondaire a été incubé à température ambiante pendant 2 h. Après avoir utilisé la solution de développement couleur, le système d’analyse par imagerie par chimiluminescence a été utilisé pour l’analyse statistique des bandes protéiques.

1. 3. 8 Expérience RT-PCR

Trois rats ont été sélectionnés dans chaque groupe pour préparer un homogénat de tissu d'hippocampe. L'ARN total dans le fluide tissulaire a été extrait par la méthode Trizol et la concentration a été mesurée. Un kit de synthèse d'ADNc à jeun a été utilisé pour la transcription inverse et une réaction d'amplification quantitative par fluorescence a été utilisée pour détecter le niveau d'expression relatif de l'ARNm de la protéine liée à la synaptique à l'aide d'un kit quantitatif par fluorescence. Les résultats ont été analysés en utilisant 2-ΔΔCt et les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1.

1.4 Méthodes statistiques

Les résultats des données conformes à la distribution normale ont été exprimés en moyenne ± écart type (x ± s) et une analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9.5. Une analyse de variance monofactorielle a été utilisée pour la comparaison entre plusieurs échantillons, et P < 0,05 a indiqué que la différence était statistiquement significative.