ELOVL2 favorise la progression du cancer en inhibant l'apoptose cellulaire dans le carcinome à cellules rénales
Mar 20, 2022
Résumé. RénalLe carcinome cellulaire (RCC) est une tumeur maligne génito-urinaire agressive qui a été associée à un mauvais pronostic, en particulier chez les patients présentant des métastases, ses principaux sous-types étant le RCC à cellules claires (ccRCC), le PCC papillaire (pRCC) et le RCC chromophobe (chRCC). La présence de gouttelettes lipidiques intracellulaires (LD) est considérée comme une caractéristique du ccRCC. L'importance du métabolisme lipidique altéré dans le ccRCC a été largement reconnue. L'allongement de l'acide gras à très longue chaîne (ELOVL) catalyse l'allongement des acides gras (AG), modulant la composition lipidique, et est nécessaire aux fonctions corporelles normales. Cependant, l'implication des élongases dans le RCC reste incertaine. Dans la présente étude, l'expression d'ELOVL2 dans le ccRCC a été examinée ; en particulier, des niveaux élevés de sept ELOVLisozymes ont été observés dans les tumeurs primaires. Il convient de noter que des niveaux d'expression élevés d'ELOVL2 ont été observés dans le ccRCC, ainsi que dans le pRCC et le chRCC. En outre, un niveau plus élevé d'ELOVL2 était significativement associé à l'incidence accrue d'un mauvais pronostic des patients atteints de ccRCC et de pRCC. L'inactivation médiée par CRISPR/Cas9-d'ELOVL2 a entraîné la suppression de l'allongement des AG polyinsaturés à longue chaîne et une augmentation de la production de LD dansrénalcellules cancéreuses. De plus, l'ablation ELOVL2 a entraîné la suppression de la prolifération cellulaire via l'induction de l'apoptose in vitro et l'atténuation de la croissance tumorale in vivo. Dans l'ensemble, la présente étude fournit de nouvelles informations sur les mécanismes de prolifération tumorale impliquant le métabolisme des lipides et suggère qu'ELOVL2 pourrait être une nouvelle cible intéressante pour la thérapie RCC.
Mots clés:carcinome à cellules rénales, gouttelette lipidique, prolifération cellulaire, rein, rénal
Introduction
Le carcinome à cellules rénales (RCC) est une tumeur maligne courante et mortelle, représentant environ 2 % de tous les cas de cancer et des décès associés dans le monde(1), ses principaux sous-types étant le RCC à cellules claires (ccRCC), le PCC papillaire (pRCC) et le chromophobe. RCC (RCC). De tous les sous-types de RCC, le ccRCC est la manifestation histologique la plus courante et sa pathogenèse est caractérisée par l'activation constitutive des facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF) en raison de la perte de fonction du gène suppresseur de tumeur de von Hippel-Lindau (VHL). (1). Diverses thérapies ciblées contre le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) ou la cible mammifère de la signalisation de la rapamycine (mTOR) et les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires pour la maladie métastatique ont été développées. Cependant, la progression de la maladie est inévitable chez la majorité des patients (1,2).
CISTANCHE AMÉLIORERA LA DIALYSE RÉNALE/RÉNALE
Une caractéristique du ccRCC est l'abondance de gouttelettes lipidiques intracellulaires (LD), constituées d'un noyau lipidique neutre contenant des triglycérides (TG) et des esters de cholestérol (CE) entourés d'une monocouche phospholipidique (3). Les LD sont des organites dynamiques responsables de l'absorption des lipides. et le stockage et sont utilisés pour maintenir l'homéostasie, faciliter la production d'énergie et protéger contre divers types de stress ou pour soutenir la biogenèse membranaire lors de la croissance rapide des cellules tumorales dans plusieurs types de cancer (4). En fait, des études antérieures ont démontré que les LD contribuent au ccRCC progrès (5,6).
Il a été rapporté que les acides gras (FA) qui constituent le composant principal des lipides servent de substrats pour le stockage d'énergie, la synthèse membranaire et la production de molécules de signalisation. L'élongation et la désaturation sont des étapes centrales de la synthèse de Novo des AG à longue chaîne (LC-FA), la longueur et le degré d'insaturation étant des déterminants de la fonction des AG et du devenir métabolique (7). La stéaroyl-CoA désaturase 1 (SCD1), un membre de la famille des acyl désaturases grasses, a été largement étudiée dans le ccRCC (6.8.9). Il a été démontré qu'une expression accrue de SCD1 soutient la viabilité, tandis qu'un inhibiteur de petite molécule SCD1 (A939572) a été montré pour supprimer la prolifération cellulaire dans ccRCC(8.9). En outre. Yang et al (10) ont démontré que la protéine 1 de liaison à l'élément régulateur du stérol (SREBP1) favorisait la désaturation des lipides par l'intermédiaire de la FA acid désat-urase 1 (FADSI) avant l'activation de la signalisation NF-xB pour la promotion de la prolifération cellulaire dans le ccRCC. Cependant, tout rôle potentiel des élongases dans le RCC reste incertain.
Il a été rapporté que, chez les mammifères, les réactions de condensation des FA initiales et de contrôle de la vitesse sont catalysées par une famille d'enzymes élongase appelée élongation des FA à très longue chaîne (ELOVL). À ce jour, sept membres ELOVL ont été identifiés, qui peuvent être généralement divisés en ceux spécifiques des AG saturés et monoinsaturés (ELOVL1, ELOVL3, ELOVL6 et ELOVL7) ou des AG polyinsaturés (PUFA ; ELOVL2, ELOVL4 et ELOVL5). Lucarelli et al (9) ont révélé une accumulation significative d'AGPI et une expression accrue de ELOVL2 et ELOVL5 dans le ccRCC. Il convient de noter qu'il a été démontré que l'acide docosahexaénoïque (DHA) systémique est produit de manière endogène et contrôle la lipogenèse de novo, tout en régulant le stockage des lipides de manière indépendante du facteur de transcription de liaison à l'élément régulateur de stérol 1 (SREBPF1), en raison de l'ablation d'ELOVL2 dans souris(11). De plus, il a été démontré que la surexpression d'ELOVL2 favorise l'accumulation de LD avec une absorption accrue de FA dans les cellules préadipocytes 3T3-LI et F442A(12). Études in vitro antérieures, avec du DHA, administré de manière exogène pour les cellules cancéreuses. ont démontré que le DHA exerce des effets anti-tumorigènes, anti-inflammatoires et pro-apoptotiques sur les cellules cancéreuses(13-15). Cependant, tout rôle potentiel d'ELOVL2 dans la progression du ccRCC par la modulation du métabolisme des lipides reste largement inexploré.
Dans la présente étude, les rôles d'ELOVL2inccRCCprogress-sion ont été explorés en effectuant le profilage transcriptionnel du ccRCC primaire et normalun reinéchantillons, révélant que ELOVL2 est surexprimé dans ccRCC et est surreprésenté parmi les isoenzymes ELOVL. Il convient de noter que ELOVL2 était également surexprimé dans le ccRCC, ainsi que dans le pRCC et le RCC, ceci étant significativement associé à un mauvais pronostic des patients atteints de CCR CCR pRCC. De plus, il a été démontré que l'inhibition d'ELOVL2 affecte le métabolisme des lipides et supprime la prolifération cellulaire via la promotion de l'apoptose, au moins en partie via la perturbation de l'homéostasie du réticulum endoplasmique (RE) chezcancer du reincellules. Les résultats de la présente étude suggèrent qu'ELOVL2 pourrait être une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement du RCC.
CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE
matériaux et méthodes
Lignées cellulaires et cultures. Les lignées cellulaires 293T (RCB2202) et OS-RC-2 (RCB0735) ont été achetées auprès du RIKEN BioResource Center, tandis que les lignées cellulaires 786-O et ACHN ont été achetées auprès de l'ATCC ; Les cellules SK‑RC‑52 étaient un aimable cadeau du Dr J.G.Old (Memorial Sloan Kettering Cancer Center). la lignée cellulaire RPTEC, dérivée de cellules épithéliales humainesrénaltubule proximal, a été acheté auprès de Lonza Group, Ltd. (CC‑2553). Les cellules ACHN, 786-O, SK-RC-52 et OS-RC-2 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 °C avec une atmosphère de CO2 humidifiée à 5 %. Les cellules 293T ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C avec une atmosphère de CO2 humidifiée à 5 %. Les cellules RPTEC ont été cultivées dansrénalmilieu de croissance épithéliale (REGM™) Bulletkit™ (CC‑3190 ; Lonza Bioscience) à 37 °C avec une atmosphère de CO2 humidifiée à 5 %.
Patients et échantillons de ccRCC. Tissus RCC et normaux adjacentsun reinles tissus de 46 patients ayant subi une néphrectomie radicale ou partielle ont été obtenus auprès de l'hôpital universitaire de Tsukuba, entre 2006 et 2015 selon les protocoles approuvés par le comité d'éthique de l'université de Tsukuba (approbation n° H28‑104). Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant de subir une intervention chirurgicale. Les stades tumoraux ont été attribués selon la classification TNM de l'Union internationale contre le cancer (16). Les grades pathologiques ont été classés selon le système de classement à quatre niveaux de Fuhrman (17). Toutes les caractéristiques des patients sont résumées dans le tableau SI Extraction d'ARN et synthèse d'ADNc. L'ARN total a été extrait des tissus congelés etrénalcellules cancéreuses à l'aide du réactif TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Après purification de l'ARN, l'ARN a ensuite été transcrit en ADNc à l'aide d'un kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (réf. 4368814 ; Thermo Fisher Scientific, Inc.), conformément aux instructions du fabricant.
Transcription inverse‑amplification en chaîne par polymérase quantitative (RT‑qPCR). Les niveaux d'expression génique ont été quantifiés à l'aide d'un appareil de PCR en temps réel rapide 7500 avec Fast SYBR-Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Les conditions de cycle étaient les suivantes : maintien initial à 95 °C pendant 20 secondes, 40 cycles à 95 °C pendant 3 secondes et 60 °C pendant 30 secondes, suivis d'une courbe de fusion allant de 95 °C pendant 15 secondes à 60 °C. C pendant 1 min. L'hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1 (HPRT1) a été utilisée comme contrôle interne. Toutes les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau SII. Afin d'évaluer les gènes liés à l'apoptose, les niveaux d'expression relatifs des gènes pro‑apoptotique, Bcl‑2‑associated X protein (BAX), Bcl‑2 homologue antagonist/killer (BAK), phorbol‑12‑myristate‑13‑ La protéine 1 induite par l'acétate (PMAIP1/NOXA) et le modulateur régulé à la hausse de p53 de l'apoptose (BBC3/PUMA) et du gène anti-apoptotique BCL2 et le gène de la protéine de différenciation des cellules de la leucémie myéloïde induite (MCL1) ont été analysés. Les niveaux d'expression relative des gènes ont été quantifiés à l'aide de la méthode 2-ΔΔCq (18).
Analyse Western blot. L'analyse Western blot a été effectuée comme décrit précédemment (19). Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse (Tris‑HCl 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, SDS à 1 % et inhibiteur de protéase) et soniquées sur de la glace. Les lysats ont été centrifugés à 1,000 xg pendant 20 min à 4˚C et les surnageants ont été recueillis comme échantillons. La quantification des protéines des échantillons a été réalisée à l'aide du test Quick Start Bradford Protein (réf. 5000202JA ; Bio‑Rad Laboratories, Inc.). Les échantillons ont été soumis à 10 % de SDS‑PAGE et les produits séparés ont ensuite été transférés sur des membranes en PVDF.
CISTANCHE AMÉLIORE L'INFECTION RÉNALE/RÉNALE
Les membranes ont été bloquées avec l'agent de blocage ECL Prime (réf. RPN418V ; Cytiva) pendant 60 min à température ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées pendant une nuit à 4˚C avec les anticorps suivants : Anti-serine/threonine-protein kinase/endoribonucléase inositol-requireing enzyme 1 (anti-IRE1 ; 1:200 ; #3294, Cell Signaling Technology, Inc.), IRE1 anti-phosphorylé (anti-p-IRE1 ; 1:200 ; NB100-2323, Novus Biologicals, LCC), protéine homologue anti-C/EBP (anti-CHOP ; 1:200 ; MA1-250, Thermo Fisher Scientific, Inc .). Des anticorps d'âne entier anti‑lapin ou anti‑immunoglobuline G liés à la HRP (réf. NA934V, NA931VS ; GE Healthcare ; Cytiva) ont été utilisés à 1:10,000 comme anticorps secondaires. Les transferts Western ont été visualisés avec ImmunoStar® Zeta (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) à l'aide d'un imageur Fujifilm LAS‑4000 et LAS400IR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation). ‑actine a été utilisé comme contrôle interne (1:10 000, cat. n° A5316 ; Sigma‑Aldrich).
Analyse bioinformatique de l'expression des gènes. Les données cliniques et de séquençage de l'ARN (ARN-seq) des tumeurs primaires recueillies auprès de patients atteints de RCC dans la base de données The Cancer Genome Atlas (TCGA) ont été téléchargées à partir du portail de données Genomic Data Commons (GDC) (20). Au total, 1 005 échantillons (880 malades et 125 témoins) ont été examinés, dont 530 malades et 71 témoins pour larein rénalcohorte de carcinomes à cellules claires (KIRC ; ccRCC), 286 échantillons malades et 31 échantillons sains pour le col de l'utérusrein rénalcohorte de carcinomes à cellules papillaires (KIRP ; pRCC) et 64 échantillons malades et 23 échantillons sains pour la cohorte de chromophobes rénaux (KICH ; chRCC). L'expression du gène ELOVL2 dans les échantillons de cancer génito-urinaire a été analysée à l'aide de la base de données d'expression génique des tissus normaux et tumoraux (GENT2). Les données d'expression génique ont été téléchargées à partir du référentiel public Gene Expression Omnibus (GEO) de la plate-forme U133 Plus 2 (GPL570) (http://gent2.appex.kr/gent2/) (21).
Plasmides et transduction lentivirale. De petits ARN en épingle à cheveux (shARN) pour ELOVL2 caractérisés dans des études antérieures (22, 23) ont été sous-clonés dans le vecteur lentiviral pLKO.1 (plasmide n° 8453 ; Addgene, Inc.). Les séquences oligonucléotidiques utilisées dans la construction du vecteur shRNA sont répertoriées dans le tableau SIII. Des lentivirus ont été générés dans des cellules 293T en co-transfectant quatre plasmides en trans, dont le vecteur lentiviral (pLKO-shControl ou pLKO-shELOVL2), pMDLg/pRRE (plasmide #12251 ; Addgene, Inc.), pRSV-Rev (plasmide #12253 ; Addgene, Inc.) et pMD2.G (plasmide #12259 ; Addgene, Inc.) en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine 2000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.). 48 h après la transfection, les surnageants contenant le virus ont été collectés et filtrés à travers un filtre de 0,45 µm pour l'infection. Pour les transductions virales, les lentivirus pLKO-shControl ou pLKO-shELOVL2 ont été incubés avec les cellules 786-O, ACHN et SK-RC-52 pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié. Les cellules ont été sélectionnées en présence de puromycine 24 h après l'infection. Pour stabiliser les sous-clones, les cellules ont été cultivées dans un milieu avec de la puromycine pendant 1 mois à 37°C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié et les pools survivants ont été utilisés pour les analyses d'expression et de prolifération.
Pour les expériences de surexpression, les cellules OSRC‑2 ont été transfectées avec le vecteur vide pCMV6 (plasmide #PS100001 ; Origene Technologies, Inc.) ou pCMV6‑ELOVL2 (plasmide #RC209232 ;Origene Technologies, Inc.) à 37 °C dans une culture cellulaire humidifiée. incubateur, en utilisant le réactif de transfection Lipofectamine 3000® (Thermo Fisher Scientific, Inc.), conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont été utilisées pour les tests indiqués 48 h après la transfection. Conception et clonage CRISPR/Cas9. Le plasmide pX330‑U6‑Chimeric_BB‑CBh‑hSpCas9 (pX330) était un cadeau de Feng Zhang (Addgene, Inc. ; plasmide #42230) (24). Les séquences CRISPR à guide unique (sg) pour ELOVL2 ont été spécifiquement ciblées sur l'exon 2 (sgELOVL2 #1) et l'exon 3 (sgELOVL2 #2 et #3) d'ELOVL2 à l'aide de l'outil de conception CRISPR (GE Healthcare Dharmacon, Inc. ;‑discovery.com/gene‑editing/crispr‑cas9/crispr‑design‑tool/), avant le clonage dans pX330. La séquence de guidage CRISPR pour le contrôle à guide unique (sgControl) a été précédemment conçue (25). Les séquences oligonucléotidiques des ARN à guide unique (ARNsg) sont répertoriées dans le tableau SIII
Les cellules ACHN ont ensuite été ensemencées dans des plaques à 6 puits (1,4 x 105 cellules/puits) et co-transfectées 2 h plus tard avec 2 µg d'ARNsg exprimés par pX330 et 0,2 µg de vecteur pCI-neo (Promega Corporation ; n° de catalogue E1841) à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié, en utilisant FuGENE HD (Promega Corporation ; n° de catalogue E2312). 24h après la transfection, 400 µg/ml de G418 ont été appliqués pendant 7 à 10 jours et les cellules ont pu récupérer pendant 2 ou 3 jours. Lorsque les cellules approchaient de la confluence, elles ont été réensemencées de manière clairsemée dans des boîtes de 10 cm. Après 2 ou 3 semaines, des colonies discernables ont été isolées à l'aide de disques de clonage (MilliporeSigma ; cat. no. Z374431‑100EA). Les clones individuels ont été développés et évalués pour le statut knock-out par séquençage Sanger pour la zone cible.
CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE
Essais de prolifération cellulaire. La prolifération cellulaire a été évaluée à l'aide du test MTT avec un kit de comptage de cellules‑8 (CCK‑8 ; Dojindo Molecular Technologies, Inc.) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et 10 µl de WST‑8 ont été ajoutés après 72 h. La DO460 a été mesurée après une incubation de 1 h à 37 °C. Xénogreffe sous-cutanée. Des souris femelles BALB/c nude (nu/nu) (n=12 ; âgées de 6 à 8 semaines) ont été achetées chez Charles River Laboratories, Inc.. Les souris ont été hébergées dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes, sous une h cycle lumière/obscurité, avec accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Pour les essais de xénogreffe sous-cutanée, 1x107 cellules en suspension dans 100 µl de PBS ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit à l'aide d'une aiguille 24G et les volumes tumoraux ont été mesurés une fois par semaine. Le volume de la tumeur a été calculé par la formule : mm3=longueur x largeur x hauteur x 0,52 (26). Après 90 jours, tous les animaux ont été sacrifiés et les tumeurs de xénogreffe ont été excisées. Les animaux ont été anesthésiés avec 2% d'isoflurane avant d'être euthanasiés par dislocation cervicale
Des spécimens fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) des tumeurs de xénogreffe ont été coupés en sections de 4 µm d'épaisseur, avant déparaffinage et réhydratation. Pour la récupération de l'antigène, les sections ont été prétraitées par micro-ondes pendant 21 min dans un tampon d'acide citrique. Après la procédure de récupération de l'antigène, l'activité de la peroxydase endogène a été bloquée avec 3 % de H2O2 pendant 25 min et les lames ont été incubées avec l'anticorps Ki‑67 (1:200 ; Dako ; Agilent Technologies, Inc. ; M7240) à 4 °C pendant la nuit. La réaction immunohistochimique a été visualisée à l'aide de l'anticorps secondaire Histofine Simple Stain MAX PO® (Nichirei Biosciences, Inc. ; n° de catalogue 424151) en utilisant de la diaminobenzidine comme chromogène. Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité des expériences sur les animaux de l'Université de Tsukuba et toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives du Règlement sur les expériences sur les animaux de l'Université de Tsukuba (approbation n° 20‑370). Essais d'apoptose. L'apoptose a été évaluée à l'aide du système de dosage Caspase‑Glo® 3/7 (Promega Corporation ; n° cat. G8090), du kit de coloration Annexin‑V‑FLUOS (Roche Diagnostics ; n° cat. 11858777001) et du potentiel de membrane mitochondriale JC‑1 Kit de dosage (Cayman Chemical Company ; cat. n° 10009172), selon les instructions du fabricant.
Coloration des LD. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles en verre dans des boîtes de 60 mm et cultivées avec un milieu contenant de l'acide oléique (200 µM) à 37 °C pendant une nuit dans un incubateur à 5 % de CO 2 . Le milieu a ensuite été aspiré et les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS avant fixation avec du formaldéhyde à 4 % (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) pendant 5 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec 0.5 µM Lipi‑Green (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) pendant 30 min dans l'obscurité à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et les lamelles ont été montées sur des lames de verre à l'aide du milieu de montage antifade VECTASHIELD® avec DAPI (Vector Laboratories, Inc. ; cat. no. H-1200). Les images des cellules colorées ont été acquises avec un microscope à fluorescence BZ‑X710 (Keyence Corporation). Les cellules vivantes ont été incubées avec du Lipi‑Green 0,5 µM dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pendant 30 min avant de les laver deux fois dans du HBSS, remises en suspension dans 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) avec 0,5 % de BSA, et passées à travers un tamis cellulaire . Les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux Gallios (Beckman-Coulter, Inc.) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo v10 (FlowJo LLC).
Coloration du traqueur ER. Les cellules ACHN (ACHN/sgControl, ACHN/sgELOVL2‑1 et ACHN/sgELOVL2‑2) ont été ensemencées sur des lamelles en verre dans des boîtes de 6{{20}}‑mm et cultivées à 37˚C pendant 48 h dans un incubateur à 5 % de CO 2 . Le milieu a ensuite été aspiré et les cellules ont été lavées deux fois avec du HBSS avant fixation avec du formaldéhyde à 4 % (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) pendant 5 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec HBSS et incubées avec 500 nM ER Tracker Red (Thermo Fisher Scientific, Inc. ; cat. No. E34250) pendant 2 h dans l'obscurité à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et les lamelles ont été montées sur des lames de verre. Les images des cellules colorées ont été acquises avec un microscope à fluorescence BZ‑X710 (Keyence Corporation). Les cellules vivantes ont été incubées avec 500 nM ER Tracker dans HBSS pendant 30 min avant de laver deux fois dans HBSS, remises en suspension dans 1 mM EDTA/PBS (pH 8,0) avec 0,5 % de BSA et passées à travers un tamis cellulaire. Les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux Gallios et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo v10.
Chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS). L'extraction des lipides totaux des culots cellulaires a été effectuée comme décrit précédemment (27). L'hydrolyse et la dérivatisation des extraits en esters méthyliques de FA (FAME) ont été réalisées. Pour les étalons internes des AG conjugués, C20 :4 (ω‑6), C20 :5 (ω‑3), C22 :5 (ω‑6), C22 :5 (ω‑3) et C22 :6 (ω‑3) FAME ont été achetés auprès de MilliporeSigma ou Cayman Chemical Company. L'analyse GC-MS a été réalisée à l'aide d'un GCMS-TQ8040 (Shimadzu Corporation) avec une colonne GC capillaire Omegawax® (MilliporeSigma ; n° cat. 24136). Le gradient de température a été initialement augmenté de 70 à 150˚C à une vitesse de 20˚C par min et de 150 à 280˚C à une vitesse de 8˚C par min avant de diminuer de 280 à 200˚C à une vitesse de 15 ˚C par min. L'injection d'échantillon a été effectuée en mode sans division avec 1,0 µl d'échantillon injecté. Pour l'analyse MS, la source d'ions et la température d'interface ont été fixées à 200˚ et 270˚C, respectivement. Les données ont été acquises en mode balayage complet (30‑600 m/z) sous 70 eV de tension d'ionisation. Les FAME ont été identifiés en fonction du temps de rétention et du spectre d'ionisation électronique-MS (EI-MS) correspondant aux normes FAME de référence. La quantité relative de FAME a été calculée en comparant la surface de pic moyenne par masse d'échantillon. Chaque échantillon a été mesuré trois fois indépendamment.
Analyses statistiques. Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel JMP 10 (SAS Institute, Inc.), GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) ou du package R (version 4.0.2 ; RStudio, Inc.). La significativité des différences entre les deux groupes a été évaluée à l'aide du test t de Student non apparié ou du test de Mann-Whitney. La signification des différences entre les trois groupes ou plus a été évaluée à l'aide d'une ANOVA à une voie avec des comparaisons post-hoc utilisant le test de Dunnett ou le test de Kruskal-Wallis suivi d'un test post-hoc de Dunn avec correction de Bonferroni. Les courbes de survie ont été construites à l'aide de la méthode de Kaplan-Meier et la différence entre les courbes a été évaluée à l'aide du test du log-rank. Les patients ont été divisés en deux groupes, un groupe à faible expression ou un groupe à forte expression, en utilisant le seuil des valeurs d'expression médianes. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Résultats
ELOVL2 est fortement surexprimé dans le RCC. L'abondance de sept isozymes ELOVL dans les tissus normaux et tumoraux correspondants a d'abord été examinée dans la présente cohorte, révélant que les niveaux d'expression ELOVL1, ELOVL2, ELOVL5 et ELOVL7 étaient élevés dans les tissus ccRCC (Fig. 1A). Pour valider ces résultats, l'expression du gène de l'isoenzyme ELOVL dans les tissus normaux et tumoraux correspondants a été examinée à l'aide de la base de données TCGA (cohorte KIRC). Il a été confirmé que l'expression de l'ARNm d'ELOVL2 était la plus élevée et la plus significativement élevée dans les tissus ccRCC (Fig. 1B; P<0.0001). subsequently,="" elovl2="" mrna="" expression="" was="" investigated="" further="" among="" three="" major="" histological="" subtypes="" of="" rcc="" using="" tcga="" database="" (kirc,="" kirp="" and="" kich="" cohorts).="" this="" revealed="" that="" elovl2="" was="" overexpressed="" in="" the="" prcc="" and="" chrcc="" tissues;="" however,="" its="" expression="" in="" ccrcc="" tissues="" was="" the="" highest="" among="" the="" histological="" subtypes="" (fig.="" 1c).="" moreover,="" the="" elovl2="">
les niveaux d'expression étaient nettement élevés dans les lignées cellulaires ACHN, 786-O et SK-RC-52, bien que les niveaux d'expression de l'ARNm dans la lignée cellulaire OS-RC-2 aient été inférieurs à ceux de la lignée cellulaire RPTEC (Fig. 1D) . Par la suite, l'altération associée au cancer de l'expression du gène ELOVL2 dans divers types de cancer a été étudiée à l'aide de la base de données GENT2 (Fig. 1E). Par rapport aux tissus normaux, l'expression d'ELOVL2 s'est avérée significativement plus élevée dansun rein, de la prostate, du poumon et du côlon, alors que l'expression d'ELOVL2 était similaire dans les cancers de la vessie ou du sein. Ces résultats suggèrent que les rôles des isoenzymes ELOVL diffèrent selon le type de cancer et que la surexpression d'ELOVL2 peut être associée à la carcinogenèse ou à la progression de la maladie du RCC, en particulier du ccRCC.
La surexpression d'ELOVL2 est associée à la progression du RCC. L'association entre l'expression génique d'ELOVL2 et les stades de métastases ganglionnaires tumorales (TNM) dans la cohorte KIRC a été examinée, afin de clarifier la signification clinique d'ELOVL2 dans le ccRCC. L'expression d'ELOVL2 était plus élevée dans les maladies localement avancées et métastatiques, bien que son expression ne soit pas associée au statut de métastase ganglionnaire (Fig. 2A-C). Collectivement, l'expression d'ELOVL2 a été augmentée en fonction du stade clinique (Fig. 2D). Par la suite, l'association entre l'expression d'ELOVL2 et le pronostic des patients atteints de RCC a été évaluée, afin d'élucider l'impact clinique du ccRCC. Selon l'analyse de Kaplan-Meier, il a été révélé que la forte expression d'ELOVL2 était significativement associée à un mauvais pronostic dans la cohorte actuelle (P=0.0015, Fig. 2E). Pour valider ces résultats, l'association entre l'expression d'ELOVL2 et le pronostic des patients atteints de ccRCC a été examinée plus en détail dans la cohorte KIRC et il a été démontré que, de même, l'expression élevée d'ELOVL2 était significativement associée à un mauvais pronostic (P<0,01, fig.="" 2f).="" moreover,="" a="" high="" expression="" of="" elovl2="" was="" significantly="" associated="" with="" a="" poor="" prognosis="" of="" patients="" with="" prcc=""><0.0001, fig.="" 2g).="" however,="" this="" was="" not="" observed="" in="" patients="" with="" chrcc="" (fig.="" 2h).="" in="" total,="" the="" aforementioned="" results="" indicated="" that="" elovl2="" may="" mediate="" ccrcc="" and="" prcc="" disease="" progression,="" at="" least="">
ELOVL2 favorise la prolifération des cellules cancéreuses rénales. Pour évaluer la fonction d'ELOVL2 dans la prolifération des cellules RCC, l'inactivation du shRNA d'ELOVL2 dans les cellules 786-O, ACHN et SK-RC-52 a été réalisée. Les effets de chaque shRNA ont été évalués par RT-qPCR et une diminution significative de l'expression d'ELOVL2 a été confirmée (Fig. 3A). Des tests MTT ont ensuite été effectués pour examiner les effets de l'inactivation d'ELOVL2 sur la prolifération cellulaire. Il a été observé que le knockdown d'ELOVL2 inhibait la prolifération de toutes les cellules par rapport aux cellules transfectées avec le shRNA contrôle (Fig. 3B).
En revanche, la surexpression d'ELOVL2 a été induite dans les cellules OS-RC-2, une lignée cellulaire avec une expression basale plus faible d'ELOVL2. L'efficacité de la transfection a été évaluée par RT‑qPCR et une expression significativement accrue d'ELOVL2 a été confirmée (Fig. 3C). Les tests MTT ont révélé que la prolifération des cellules surexprimant ELOVL2 était significativement favorisée, par rapport au groupe témoin (Fig. 3D), indiquant qu'ELOVL2 pourrait être un promoteur de la prolifération derénalcellules cancéreuses.
L'ablation d'ELOVL2 supprime la croissance tumorale in vivo, la synthèse des PUFA et la production de LD dansrénalcellules cancéreuses. Pour clarifier davantage les rôles d'ELOVL2 dans la progression du RCC, une lignée cellulaire ACHN knock-out ELOVL2 a été établie, en utilisant un système CRISPR/Cas9 (sgELOVL2-1 et sgELOVL2-2) (Fig. S1). In vitro, la prolifération cellulaire a été significativement réduite par l'ablation ELVOVL2 dans les cellules ACHN (Fig. S1). Plus important encore, l'ablation médiée par CRISPR/Cas9 d'ELOVL2 a supprimé la croissance tumorale lorsque les cellules ont été implantées par voie sous-cutanée chez des souris (Fig. 4A). Les volumes maximaux des tumeurs de xénogreffe sous-cutanée dans l'ACHN/contrôle et l'ACHN/sgELOVL2‑2 au jour du sacrifice étaient de 241 et 109 mm3, respectivement. Il convient de noter que toutes les tumeurs de xénogreffe du groupe ACHN/sgELOVL2‑1 ont spontanément régressé 14 jours après la transplantation et n'ont pas été détectées au moment de l'extirpation. L'indice Ki‑67 a également été examiné dans les tumeurs de xénogreffe transfectées avec le contrôle ou sgELOVL2 et il a été observé que les cellules ACHN/sgELOVL2‑2 présentaient un indice Ki‑67 significativement plus faible que les cellules ACHN/contrôle (Fig. 4B et C) . Ces résultats ont confirmé la possibilité qu'ELOVL2 augmente la croissance tumorale in vivo. Comme ELOVL2 est situé sur le chromosome 6p24.2 et code pour une protéine transmembranaire du réticulum endoplasmique contrôlant l'élongation des AGPI C20-C24 (7), les niveaux totaux d'AF ont ensuite été évalués dans les cellules ACHN/sgControl et ACHN/sgELOVL2 à l'aide d'une analyse GC-MS. (Fig. S2). L'altération des niveaux de LC-PUFA est démontrée sur la figure 4D. ELOVL2 est une enzyme essentielle dans la production endogène d'acide docosahexaénoïque (DHA, C22:6 n-3) (28,29) et, comme prévu, les niveaux de DHA ont été significativement diminués par l'ablation d'ELOVL2 dans lerénalcellules cancéreuses. De plus, le
les quantités d'autres espèces d'AGPI-LC, y compris l'acide arachidonique (AA, C20:4 n-6), l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide docosapentaénoïque (DPA), ont également été significativement réduites. En revanche, la production de DPA n'était pas systématiquement altérée dans les cellules ACHN/sgELOVL2. La quantité de DPA dans les cellules ACHN était très faible et n'a pas été détectée dans plusieurs échantillons (Fig. S2). Étant donné que des études antérieures ont démontré qu'ELOVL2 favorise l'accumulation de LD par la production de DHA (11, 12), le stockage des LD a été évalué plus en détail à l'aide d'une coloration lipidique neutre. Il convient de noter que l'abondance de LD dans les cellules ACHN / sgELOVL2 était significativement réduite par rapport aux cellules ACHN / sgControl (Fig. 4E-4G), ce qui suggère que l'altération du métabolisme des lipides par la surexpression d'ELOVL2 peut affecter la prolifération des cellules RCC.
L'ablation d'ELOVL2 induit l'apoptose derénalcellules cancéreuses. Des études antérieures ont révélé que la production de LD intracellulaires favorise l'apoptose dans des microenvironnements tumoraux stressants (4). Par conséquent, dans la présente étude, l'apoptose a été évaluée dans les cellules ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2 et une activité significativement élevée de la caspase 3/7 a été détectée dans les cellules ACHN/sgELOVL2 (Fig. 5A). De même, un plus grand nombre de cellules ACHN/sgELOVL2 apoptotiques par rapport aux cellules ACHN/sgControl a été identifié, comme en témoigne la coloration à l'annexine V/PI (Fig. 5B). Selon le stress cellulaire, l'apoptose intrinsèque (30) entraîne la perte du potentiel membranaire mitochondrial ; ainsi, la présente étude a évalué plus en détail le potentiel électrique transmembranaire mitochondrial des cellules ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2 à l'aide de JC-1 fluorescent. Le rapport agrégat / monomère était significativement diminué dans les cellules ACHN / sgELOVL2 (Fig. 5C), indiquant la promotion de la polarisation transmembranaire mitochondriale et l'activation de la voie apoptotique intrinsèque par ablation ELOVL2. Plus précisément, les niveaux d'expression des gènes pro-apoptotique (BAX, BAK, PUMA et NOXA) ont été significativement augmentés, tandis que les niveaux d'expression des gènes anti-apoptotique (BCL2 et MCL1) ont été significativement diminués en raison de l'ablation d'ELOVL2 (Fig. 5D). Ces résultats indiquent qu'ELOVL2 contribue à la survie cellulaire par l'inhibition de l'apoptose des cellules cancéreuses rénales
La dégradation de la capacité de stockage des lipides sous forme LD peut entraîner l'effondrement de l'homéostasie du RE, déclenchant la réponse protéique dépliée (UPR) et l'apoptose cellulaire (4,5). Par conséquent, afin de soutenir l'hypothèse de l'implication de l'expression d'ELOVL2 dans l'homéostasie du RE, une coloration du tracker ER a été réalisée dans des cellules ACHN/sgControl ou ACHN/sgELOVL2. L'imagerie ER ultérieure (Fig. 5E) et la quantification par cytométrie en flux (Fig. 5F et G) ont indiqué une expansion ER dans les cellules ACHN / sgELOVL2, en raison du stress ER. De plus, l'ablation ELOVL2 a favorisé la phosphorylation de IRE1 , un activateur des capteurs UPR (Fig. 5H), tandis que l'expression deCHOP, qui joue un rôle principal dans l'apoptose induite par le stress du RE, a été régulé positivement par l'ablation d'ELOVL2 (Fig. 5H). Ensemble, ces résultats ont démontré que le métabolisme lipidique médié par ELOVL2 supprime l'apoptose cellulaire dansrénalcellules cancéreuses et ont suggéré que la perturbation de l'homéostasie du RE pourrait être un mécanisme potentiel d'induction.
Discussion
La présente étude a démontré que ELVOL2 peut modifier le métabolisme des lipides et favoriser la croissance tumorale via l'inhibition de l'apoptose des cellules cancéreuses rénales. De plus, il a été observé que l'expression d'ELOVL2 dans les tissus RCC était élevée et que
l'expression plus élevée d'ELOVL2 était significativement associée à un mauvais pronostic des patients atteints de RCC. Il existe peu d'études disponibles sur les rôles d'ELOVL2 dans la progression du cancer (22,31,32) et leurs résultats sont controversés. Simple et al (22) ont démontré qu'ELOVL2 favorisait la synthèse des LC-PUFA, soutenant une signalisation efficace de l'EGFR et la prolifération des cellules souches du glioblastome. En revanche, Kang et al (31) ont rapporté que l'ablation d'ELOVL2 peut favoriser la migration cellulaire et la formation de colonies de cellules cancéreuses du sein et ont révélé qu'une diminution de l'expression d'ELOVL2 était associée à un pronostic plus sombre des patientes atteintes d'un cancer du sein. De plus, Ding et al (32) ont rapporté qu'ELOVL2 supprime la prolifération des cellules de neuroblastome et était associé à des taux de survie favorables. Selon les résultats contradictoires rapportés dans des études antérieures, une fonction multi-rôle pour ELOVL2 dans la progression du cancer a été démontrée, qui varie clairement selon le type de cancer.
Un métabolisme lipidique altéré affecte grandement la progression du cancer, un effet observé dans les résultats de la présente étude, étant conforme aux recherches décrivant le rôle d'ELOVL2 en tant que contrôleur principal du processus d'élongation des LC-PUFA et une enzyme critique dans la biosynthèse du DHA ( sept). Dans la présente étude, il a été démontré que les AGPI-LC endogènes,
y compris l'AA et le DHA, ont diminué en raison de l'ablation d'ELOVL2 dans les cellules cancéreuses rénales. À cet égard, il a déjà été rapporté que l'inhibition de la voie AA par les inhibiteurs de la lipoxygénase (LOX) induit l'apoptose et réduit la viabilité derénalcellules cancéreuses in vitro (33,34). Bien que les résultats de surexpression d'ELOVL2 de la présente étude soient conformes à ces découvertes mécanistes, il a cependant été rapporté précédemment que l'administration de DHA peut inhiber la prolifération et l'invasion des cellules cancéreuses rénales in vitro (35,36). Cependant, les LC-PUFA sont connus pour avoir des effets distincts et contrastés sur la progression du cancer. Par conséquent, l'altération d'un équilibre délicat entre une variété d'AGPI-LC, en raison de l'inhibition d'ELOVL2, peut être associée aux différents phénotypes observés dans divers types de cancer. Des études antérieures ont démontré que les LD sont augmentées par la production endogène de DHA par ELOVL2 chez la souris (11,12). De même, il a été révélé que l'ablation d'ELOVL2 peut supprimer la production de DHA et de LD dans les cellules cancéreuses rénales, ce qui suggère que la surexpression d'ELOVL2 peut favoriser la production de LD par la production endogène de DHA dans le RCC. Les cellules cancéreuses se trouvent souvent dans des conditions environnementales plus difficiles (macro et micro), y compris l'hypoxie et la privation de nutriments, mais se développent néanmoins rapidement sous des facteurs de stress aussi graves. Les fonctions des LD dans des conditions de stress cellulaire, telles que le maintien de l'homéostasie énergétique et redox, la régulation de l'autophagie, le maintien de l'homéostasie du RE et la protection contre la lipotoxicité, ont été démontrées (4).
Ackerman et al (6) ont révélé que les LD préviennent l'accumulation de lipides saturés toxiques pendant l'hypoxie en tamponnant la saturation des lipides cellulaires par l'échange d'AG insaturés résidents de TG dans le ccRCC. La lipotoxicité cellulaire due aux AG saturés (AGS), y compris le palmitate (C16 :0), peut provoquer l'apoptose, entraînant la mort des cellules cancéreuses (37,38). Récemment, ELOVL2 a été désignée comme une enzyme pro-survie essentielle, aidant à la prévention de l'apoptose cellulaire induite par la glucolipotoxicité (39). Il convient de noter que la partition des lipides modifiée par l'axe ELOVL2/DHA entraîne une utilisation non toxique du palmitate d'AFS en favorisant son transport dans les mitochondries pour l'oxydation des FA (FAO) via un mécanisme dépendant de CPT1. De plus, Balaban et al ont démontré que les cellules cancéreuses de la prostate C4-2B et les cellules cancéreuses du sein MCF-7 sont protégées de l'apoptose induite par le palmitate par la FAO mitochondriale (37,38). Au cours de la lipotoxicité induite par le palmitate, les niveaux cellulaires de protéines anti-apoptotiques, y compris BCL-2 ou MCL-1, ont été signalés comme étant diminués (40,41) tandis que les niveaux de protéines pro-apoptotiques, y compris PUMA ou NOXA, ont été signalés à augmenter (42,43). Il a été révélé dans la présente étude que l'ablation ELOVL2 peut favoriserrénall'apoptose des cellules cancéreuses par l'altération des gènes pro- et anti-apoptotique de manière similaire. Ces résultats suggèrent qu'ELOVL2 pourrait protéger les cellules contre l'apoptose induite par la lipotoxicité pour favoriser la croissance tumorale dans le RCC.
De plus, il a été démontré que l'ablation d'ELOVL2 dans le RCC peut favoriser le stress ER et la régulation à la hausse de CHOP, régulant à la baisse BCL-2 et MCL-1, tout en régulant à la hausse BAK et BAX, via une voie dépendante des mitochondries (44). En effet, les résultats de la présente étude ont démontré que les gènes pro- et anti-apoptotiques étaient également altérés par l'ablation d'ELOVL2. Conformément aux résultats de l'étude de Qui et al (5), qui ont rapporté que les LD dépendantes de HIF2 / PLIN2 favorisent la résistance au stress ER et la survie cellulaire dans le ccRCC, ces résultats collectifs appuient le stress ER favorisant l'apoptose cellulaire par ELOVL2 ablation dansrénalcellules cancéreuses, en diminuant les DL et en éliminant le tampon cellulaire contre les lipides toxiques.
En conclusion, la présente étude a démontré pour la première fois, à notre connaissance, qu'ELOVL2 favorise la croissance tumorale par l'inhibition de l'apoptose via l'allongement des AGPI, au moins en partie en maintenant l'homéostasie du RE dansrénalcellules cancéreuses. Pris ensemble, il a été suggéré que les LD induites par ELOVL2 pourraient contribuer à la progression du cancer en raison de multiples effets protecteurs contre le stress cellulaire dans le RCC. De plus, il a été suggéré qu'ELOVL2 pourrait être une cible thérapeutique potentielle intéressante pour les patients atteints de RCC.