Améliorer la protéomique descendante du tissu cérébral avec FAIMS, partie 1

Abstrait

Les recherches protéomiques sur les maladies d'Alzheimer et de Parkinson ont fourni des informations précieuses sur les troubles neurodégénératifs. Jusqu'à présent, ces recherches se sont largement limitées à des approches ascendantes, ce qui entrave la mesure dans laquelle on peut caractériser l'état « intact » d'une protéine.

La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui a des effets irréversibles sur la mémoire et les capacités cognitives d'une personne. Bien que les gens ne puissent pas guérir complètement la maladie, grâce à un traitement et à une prévention minutieux, la progression de la maladie peut être ralentie autant que possible et la santé physique et mentale du patient peut être maintenue.

La mémoire est l'un des aspects les plus évidents affectés par les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Ils oublient souvent des informations importantes, comme leur nom, celui de leurs proches, des dates importantes, etc. De plus, certains vocabulaires avancés d’auto-apprentissage, tels que les concepts abstraits et les synonymes, peuvent également être oubliés. Cependant, avec un certain entraînement cognitif et un traitement, les patients atteints de la maladie d'Alzheimer peuvent encore conserver leur mémoire sous certains aspects.

Même si la maladie d'Alzheimer peut avoir des effets négatifs, nous devons la considérer de manière positive. Premièrement, en augmentant la sensibilisation et la compréhension de la maladie, nous pouvons mieux la prévenir et la traiter. Deuxièmement, les soignants et les membres de la famille des patients atteints de la maladie d'Alzheimer peuvent également apprendre à communiquer et à interagir efficacement avec eux pour aider les patients à conserver leur dignité et à vivre heureux autant que possible.

En général, même si la maladie d'Alzheimer peut avoir des effets irréversibles sur la mémoire et les capacités cognitives, nous devons maintenir une attitude optimiste et essayer de ralentir la progression de la maladie grâce à des traitements et à des mesures préventives. Dans le même temps, nous devons également apporter davantage d'aide et de soutien à ceux qui s'occupent des patients atteints de la maladie d'Alzheimer et créer ensemble une communauté plus chaleureuse et interactive. On voit que nous devons améliorer la mémoire. Le cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car il s'agit d'une matière médicinale traditionnelle chinoise ayant de nombreux effets uniques, dont l'un consiste à améliorer la mémoire. L'effet du Cistanche provient des différents ingrédients actifs qu'il contient, notamment l'acide tannique, les polysaccharides, les glycosides flavonoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent favoriser la santé cérébrale de plusieurs manières.

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La protéomique descendante (TDP) surmonte cette limitation ; cependant, elle se limite généralement à l’observation des protéoformes les plus abondantes et d’une taille relativement petite.

Par conséquent, les techniques de fractionnement sont couramment utilisées pour réduire la complexité des échantillons. Ici, nous étudions le fractionnement en phase gazeuse par spectrométrie de mobilité ionique à forme d'onde asymétrique à champ élevé (FAIMS) au sein du TDP.

En utilisant un échantillon de haute complexité dérivé du tissu cérébral de la maladie d'Alzheimer (MA), nous décrivons comment l'ajout de FAIMS au TDP peut améliorer considérablement la profondeur de la couverture protéomique.

Par exemple, la mise en œuvre de FAIMS avec une tension de compensation externe (CV) échelonnée à -50, -40 et -30 CV pourrait plus que doubler le nombre moyen de protéoformes, de gènes et de couverture de séquences protéomiques non redondantes par rapport à sans FAIMS.

Nous avons également constaté que FAIMS peut influencer la transmission des protéoformes et de leurs enveloppes de charge en fonction de leur taille. Il est important de noter que FAIMS a permis l’identification de protéoformes amyloïdes bêta (A) intactes, y compris la variante A 1–42 sujette à l’agrégation qui est fortement liée à la MA.

Les données brutes et les fichiers associés ont été déposés auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel de données MassIVE avec l'identifiant d'ensemble de données PXD023607.

INTRODUCTION

Au cours des deux dernières décennies, l'incidence des maladies neurodégénératives a plus que doublé dans le monde, la maladie d'Alzheimer (MA) étant la forme la plus répandue.1 Deux espèces de protéines, les peptides bêta-amyloïdes (A ) et la protéine tau(tau) associée aux microtubules phosphorylés, 2 à 5 sont fortement associés à la MA.

Par conséquent, la protéomécaractérisation détaillée de la maladie d’Alzheimer revêt une importance particulière.6,7 La spectrométrie de masse a joué un rôle central dans ces recherches,8 principalement par des approches ascendantes.9–16

Cependant, la digestion par la protéase requise pour les analyses ascendantes empêche la capture de l'état complet d'une protéine, qui peut varier en raison des allèles génétiques, de l'épissage alternatif, du traitement protéolytique et des modifications post-traductionnelles (appelées « protéoformes »).17– 20

Étant donné que les approches protéomiques descendantes (TDP) analysent les protéines dans un état intact, la probabilité de capturer des protéoformes associées à certaines pathologies est plus grande et permet une connexion plus forte et plus directe entre le génotype et le phénotype.20–22

Par exemple, le TDP est particulièrement bien adapté à la capture de fragments protéolytiques endogènes dérivés de protéines telles que la protéine tau, qui ont été associées à la pathologie d'Alzheimer.23–26 Plusieurs applications antérieures du TDP se sont révélées très prometteuses en révélant l'hétérogénéité régionale des protéines cérébrales et les changements neuronaux en réponse à divers stimuli. .27-30

Cependant, le TDP d'échantillons complexes nécessite généralement des techniques de fractionnement hors ligne pour réduire la complexité de l'échantillon, car le protéome humain s'étend sur plusieurs ordres de grandeur en taille et en abondance, et les protéines ne sont généralement pas bien résolues avec la chromatographie liquide haute performance (LC) en phase inverse.31

Ce fractionnement hors ligne peut être réalisé par électrophorèse de piégeage de fraction liquide éluée sur gel, chromatographie d'exclusion stérique, chromatographie par échange d'ions ou purification par affinité, pour n'en nommer que quelques-unes.22,32-35.

Malheureusement, le fractionnement hors ligne réduit généralement le rendement et le débit en nécessitant une manipulation prolongée des échantillons.36 La séparation par mobilité ionique en phase gazeuse est une alternative de fractionnement intéressante qui peut être introduite entre les dimensions LC et MS sans nécessiter d'étapes supplémentaires de manipulation des échantillons.

La spectrométrie de mobilité ionique à forme d'onde asymétrique à champ élevé (FAIMS) est particulièrement bien adaptée à cette tâche avec l'introduction récente du dispositif FAIMS Pro, dont la conception modulaire permet une incorporation facile de la mobilité ionique sur plusieurs instruments Orbitrap actuels.37

Le FAIMS, également appelé spectrométrie de mobilité différentielle, sépare les ions dans un gaz porteur en fonction de combinaisons de facteurs tels que la taille, la charge ou la forme, grâce à l'introduction d'une forme d'onde asymétrique avec des champs électriques élevés et faibles.38 Pour éviter la collision des ions avec le électrode, une déviation dans le trajet de l'ion est introduite par l'application d'une tension de compensation continue (CV), 39 permettant une transmission sélective de cet ion.38

L'application du FAIMS à l'analyse des protéines intactes s'est largement limitée à la séparation des conformères de protéines individuelles ou de petites combinaisons de protéines ; 40–45

cependant, FAIMS a récemment été appliqué aux analyses de protéines intactes et natives en utilisant l'analyse de surface par extraction liquide.46–50Ici, nous appliquons l'analyse FAIMS-TDP à un échantillon de tissu entier provenant du cortex frontal médial (MFC) d'un patient atteint d'Alzheimer.

L'analyse d'une plage CV de -50 à -20 CV avec un pas externe nous a permis de déterminer comment la modulation du CV FAIMS influence les caractéristiques des ions transmis à travers l'unité cylindrique FAIMS, et comment cette relation peut être exploitée pour cibler des protéoformes en fonction de leur taille.

FAIMS-TDP a plus que doublé les identifications de protéoformes avec un seul CV par rapport à sans FAIMS et a permis un interrogatoire plus approfondi des protéoformes pertinentes pour les maladies neurodégénératives, notamment les -, - et -synucléines, PARK7, les isoformes d'épissage tau et plusieurs protéoformes A intactes.

Pris ensemble, ces travaux décrivent comment de meilleures identifications de protéoformes et de protéomecouverture peuvent être obtenues de manière reproductible via le fractionnement en phase gazeuse avec FAIMS dans TDP.

MÉTHODES

Préparation des échantillons

L'échantillon MFC a été reçu du Rush University Alzheimer's Disease Center. Les participants étaient des personnes âgées en clinique qui se sont inscrites avec des troubles de la mémoire et/ou une démence de 1992 à 2005.

Ils ont été évalués à la Rush Memory Clinic pour une éventuelle démence et ont accepté de faire un don de cerveau dans le cadre du noyau clinique du Rush Alzheimer's Disease Core Center. L'étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel du centre médical de l'université Rush.

Après le décès, le plus proche parent a donné son consentement à une autopsie. La catégorie diagnostique globale du patient était la démence d'Alzheimer sans autre cause de déficience cognitive51, tandis que l'intervalle post-mortem était de 230 minutes.

Toutes les étapes de manipulation des échantillons ont été effectuées avec les précautions BSL{{0}}. 33 mg de tissu MFC stocké à -80 degrés ont été transférés dans des tubes LoBind Eppendorf de 1,5 ml (Eppendorf, Cat# 022431081) avec l'ajout de 0,5 ml de tampon d'homogénéisation composé de 8 M d'urée, 10 mM de bicarbonate d'ammonium (ABC) et 10 mM. tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) à pH7,5.

L'homogénéisation a été obtenue par perturbation physique en appliquant un pilon à granulés actionné par un moteur portatif pendant 3 0 s (BioVortexer avec SpiralPestle ; Biospec 1083 et 1017), avant l'ajout de 0,5 ml de tampon d'homogénéisation à température ambiante.

L'échantillon a ensuite été incubé à 37 degrés pendant 60 min à 1 200 tr/min à l'aide d'un ThermoMixer pour permettre l'extraction et la dénaturation des protéines cellulaires. La granulation du matériau insoluble dans l'urée a été réalisée par centrifugation à 18,000g pendant 20 min à 22 degrés, et le surnageant résultant a ensuite été ajouté à 3 ml de tampon de lavage (WB ; urée 8 M, ABC 10 mM, pH7 .5) dans un filtre de coupure de poids moléculaire (MWCO) de 4 ml et 100 kDa pour éliminer les grandes espèces de MW.

Après 1 h de centrifugation à 22 degrés et 5 000 g, le volume du rétentat était de 200 µL et le volume du filtrat était de 3,8 mL. 3,8 ml du filtrat ont été transférés dans un filtre MWCO de 3 kDa pour éliminer les contaminants à petites molécules et les peptides de faible poids moléculaire.

Le filtre MWCO de 3 kDa a été centrifugé à 22 degrés et à 7 300 g pendant 1 h, donnant un volume de rétentat de 200 μL. 200 µL de rétentat du filtre MWCO de 100 kDa ont été lavés une fois de plus en le diluant à 4 ml avec du WB et en le filtrant à nouveau à travers le même filtre.

Ce flux a été ajouté au même filtre MWCO de 3 kDa comme mentionné ci-dessus et concentré une fois de plus.

Les 2 00 μL finaux de rétentat provenant du lavage du filtre MWCO de 3 kDa ont été transférés dans un tube LoBindEppendorf de 1,5 mL. Pour acidifier l'échantillon, 10 µL d'acide formique (AF) à 10 % ont été ajoutés, ce qui a donné une concentration de 0,5 % d'AF dans l'échantillon final.

L'échantillon a été centrifugé à 18,000g pendant 15 min pour éliminer le matériau précipité avant de mesurer la concentration en protéines à l'aide du test de l'acide bicinchoninique (BCA).

Des standards d'albumine sérique bovine ont été préparés dans 8 M d'urée, 10 mM ABC et 0,5 % de FA pour tenir compte de toute contribution potentielle au tampon au test BCA. La concentration en protéines par le test BCA a été déterminée à 1,1 mg/mL, ce qui correspond au rendement final de 0,22 mg de protéine totale récupérée dans l'échantillon d'environ 200 μL. L'échantillon a été dilué à 0,5 mg/mL avec WB contenant 0,5 % d’AF et stocké à -80 degrés jusqu’à l’analyse LC-MS.

Il convient de noter que les premières expériences (données non publiées) utilisant un cocktail traditionnel d'inhibiteurs de protéase/phosphatase au sein de notre tampon d'homogénéisation ont conduit à des résultats trompeurs du BCAassay et de la LC-MS en raison de la rétention de plusieurs composants du cocktail par le filtre 3KMWCO.

En outre, de nombreux inhibiteurs de phosphatase et de protéase couramment utilisés sont chimiquement incompatibles avec des agents réducteurs tels que le TCEP. Compte tenu de ces incompatibilités et du fait que les conditions fortement dénaturantes de l'urée 8 M avec du TCEP 10 mM devraient inactiver la plupart des protéases, nous avons pensé que la dégradation protéolytique serait toujours minimisée dans ces conditions.

Analyses LC-MS/MS et paramètres FAIMS

Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un système Waters NanoACQUITY UPLC avec des phases mobiles composées de {{0}},2 % de FA dans H2O (phase mobile A) et 0,2 % de FA dans ACN (phase mobile B).

La précolonne de piégeage (100 μm de diamètre intérieur, 5 cm de longueur) et la colonne analytique (75 μm de diamètre intérieur, 50 cm de longueur) étaient des boues remplies avec le matériau de remplissage C2 (5 et 3 μm pour piège/analyse, respectivement, 300 Å, technologie des méthodes de séparation) . Les échantillons ont été chargés dans une boucle de 5 µL, correspondant à 2,5 µg de la quantité de matériau chargé, et injectés dans la colonne de piégeage avec un flux isocratique de 5 % b à 3 µL/min pendant 20 min.

La séparation a été réalisée avec un gradient de 5 à 50 % b sur 180 min à 300 nL/min. Pour l’analyse MS/MS des protéines, le système NanoACQUITY a été couplé à un spectromètre de masse Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid équipé de l’interface FAIMS Pro.

Les paramètres de la source comprenaient une tension d'électropulvérisation de 2,2 kV, une température capillaire de transfert de 275 degrés et une amplitude de radiofréquence d'entonnoir ionique de 60 %. FAIMS a été réglé sur une résolution standard sans débit de gaz vecteur supplémentaire contrôlé par l'utilisateur et avec une tension de dispersion de −5 kV (équivalent à un champ de dispersion de −33,3 kV/cm),50 tandis que le CV variait en fonction de l'expérience (appelé « pas à pas externe). ").

Le Fusion Lumos a été réglé sur le mode d’application « protéine intacte », qui abaisse la pression de la cellule N2 de dissociation du piège C (HCD) à 2 mTorr, et les données ont été collectées sous forme de profil complet. Les données MS1 et MS2 ont été acquises à une résolution de 120k et 60k, des micro-balayages de 3 et 2, sur une plage de 500–2,000 m/z et de 400–2,000 m/z, et avec Cibles AGC de 5 × 106 et 5 × 105, respectivement.

MS1 et MS2 ont également été acquis avec un temps d'injection maximum de 400 ms. Les paramètres dépendants des données comprenaient une sélection des 6 ions les plus intenses, l'exclusion des ions inférieurs à l'état de charge 5+, l'inclusion des états de charge indéterminés et l'exclusion dynamique après une observation pendant 30 s.

Les ions sélectionnés pour MS2 ont été isolés sur une fenêtre de ± 1,5 m/z et fragmentés par dissociation induite par collision (CID) avec une énergie de collision de 35 %. Nous avons utilisé CID au lieu de HCD en raison de la moindre dépendance de l'énergie de collision normalisée pour obtenir des spectres de fragmentation protéique interprétables, donnant ainsi la priorité à l'étendue de nos observations protéoformes par rapport à la couverture des séquences.

Les ensembles de données pour chaque CV FAIMS ont été collectés en triple. Tous les fichiers bruts ont été déposés dans le référentiel de données MassIVE et sont accessibles via l'adhésion MSV000086696, ou avec PXD023607 sur ProteomeXchange.

For more information:1950477648nn@gmail.com