Améliorer la protéomique descendante du tissu cérébral avec FAIMS, partie 3

Une observation immédiate et apparente est que plus le centile d’abondance est élevé, plus la probabilité d’identification au TDP est élevée. En d’autres termes, le TDP identifie principalement des protéines très abondantes.

En vieillissant, de nombreuses personnes constatent que leur mémoire diminue. Il s’agit d’un phénomène courant, surtout après avoir subi un stress mental à long terme, un manque de sommeil et une alimentation déséquilibrée.

Mais saviez-vous qu’une façon de nous aider à améliorer notre mémoire est d’augmenter notre apport en protéines en grande quantité ? Les protéines en abondance sont riches en acides aminés, qui peuvent synthétiser une molécule appelée neurotransmetteur dans le cerveau et également favoriser la croissance et l'activité des neurones. Les neurones sont les unités les plus fondamentales du cerveau et sont la clé de nos capacités d’apprentissage et de mémoire. Par conséquent, une forte abondance de protéines peut améliorer notre mémoire en renforçant la fonction des neurones.

La recherche a également démontré la relation entre les protéines et la mémoire. Par exemple, une étude a révélé que, comparé à un régime riche en protéines, un régime pauvre en protéines entraînait un déclin des fonctions cérébrales, notamment de l’attention et de la mémoire.

Alors, si vous souhaitez améliorer votre mémoire, autant ajouter à votre alimentation des aliments riches en protéines, comme du poulet, du poisson, du bœuf, des œufs, du tofu, etc. Bien entendu, vous devez également faire attention à l'équilibre. et la diversité de votre alimentation, et vous ne pouvez pas vous contenter d'un seul type d'aliment.

En bref, des protéines en grande quantité peuvent contribuer à améliorer notre mémoire. Si vous souhaitez avoir une meilleure mémoire, autant commencer par votre régime et essayer de manger un maximum d’aliments riches en protéines ! Cela montre que nous devons améliorer notre mémoire, et Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car il peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme l'augmentation des niveaux d'acétylcholine et des facteurs de croissance, qui sont très importants pour la mémoire et l'apprentissage. En outre, Cistanche peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutrition et d'énergie, améliorant ainsi sa vitalité et son endurance.

Cliquez sur connaître les suppléments pour stimuler la mémoire

Environ la moitié des gènes identifiés à partir des ensembles de données descendants (avec ou sans FAIMS) étaient contenus dans les 20 % supérieurs des groupes d'abondance pour l'analyse ascendante (Figure 6A). À l’inverse, 71 gènes n’ont pu être trouvés que dans les ensembles de données descendants (bac « NA ») (Figure 6A).

Ces gènes semblent représenter des protéines relativement courtes (<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Par exemple, dans la catégorie descendante uniquement se trouvaient des protéines histones telles que H3C1, H4C1, H1–4 et H2BC12. Comme prévu, nous avons constaté que FAIMS pouvait améliorer les identifications dans les percentiles les plus faibles par rapport à « Aucun FAIMS », augmentant ainsi la profondeur. du protéome observable.

En déterminant le rapport entre FAIMS et « Pas de FAIMS » dans tous les percentiles, une augmentation appréciable des identifications en dessous du 40e percentile est apparente dans les CV compris entre -40 et -50 (Figure 6B).

Cependant, si l'on considère le nombre absolu de gènes, la principale contribution à l'avantage du FAIMS réside dans l'élargissement du spectre d'identification pour tous les centiles d'abondance.

Relation entre le CV FAIMS et la transmission des protéoformes

Avec FAIMS, nous avons également noté une tendance entre le CV FAIMS et le poids moléculaire des protéoformes (Figure 7). À -50 CV, la masse médiane des protéoformes est d'environ 5 kDa et augmente jusqu'à ∼15 kDa à -20CV.

Sur la base de ces distributions de masse (Figure 7), les CV inférieurs à -50 V semblent bien adaptés aux expériences protéomiques descendantes ou moyennes, tandis que les CV supérieurs à -50 V pourraient mieux bénéficier aux expériences peptidomiques ou ascendantes.

La tendance observée du poids moléculaire s'étend probablement au-delà de −20 CV ; cependant, nous avons limité notre recherche à -20 CV en raison de la baisse des identifications de protéoformes et de gènes, ce qui a conduit à une diminution des rendements dans la couverture des séquences protéomiques par analyse.

Il convient de noter qu'un travail antérieur utilisant FAIMS a trouvé que +40 CV était la tension idéale pour transmettre une chaîne lourde de mAb NIST (∼51 kDa) et que −20 CV était la meilleure pour la chaîne légère correspondante (∼23 kDa), soutenant l'idée. que la tendance que nous observons s’étend aux CV FAIMS positifs.45

Il est intéressant de noter que même si de nombreux spectres identifiant une seule protéoforme se limitaient à être trouvés dans une plage de 10 V (3 599 sur 5 165), sept protéoformes ont été observées dans toute la plage de CV, de -50 à -20. Vraisemblablement, cela peut être attribué à leur forte abondance dans l’échantillon, en particulier dans le cas de l’ubiquitine (UBB), de la protéine basique de la myéline et de la protéine de liaison à l’acylCoA.

Cependant, il est également probable que les différents états de charge de ces protéoformes adoptent plusieurs conformations en phase gazeuse en fonction de leur isomérisation des protons, impactant ainsi leurs mobilités.42

Ces sept protéoformes nous ont permis d'étudier comment l'enveloppe de l'état de charge est transmise différentiellement via la modulation du CV. En tant que proxy de la distribution de l'état de charge à chaque CV, nous avons utilisé l'état de charge médian basé sur les correspondances de spectre protéoforme (PrSM) identifiées à chaque CV et avons suivi l'évolution de cette valeur en fonction du CV à partir de -50 CV.

Les analyses MS1 de la figure S3 montrent comment l'état de charge médian du PrSM suit la distribution de l'état de charge de l'UBB. Parmi ces sept protéoformes, quatre suivaient une relation inverse, l'état de charge médian observé augmentant à mesure que le CV diminuait (Figure 8).

Il convient de noter que cette tendance a généralement été observée avec les peptides et les petites protéines.56,62–64. Étonnamment, trois protéoformes ont montré la relation opposée où la diminution du CV diminuait les états de charge médians observés (Figure 8).

Un examen rapide de la masse moyenne des précurseurs entre les deux groupes suggère que les plus gros précurseurs sont plus susceptibles de favoriser des états de charge plus élevés à mesure que le CV diminue.

Pour valider davantage ces relations, nous avons élargi cette analyse pour inclure les protéoformes identifiées dans une plage de 20 à 30 CV plus modeste, mais toujours large (n=256 protéoformes). Ici, les protéoformes dont la charge médiane s'est déplacée de plus d'une charge à travers toute la gamme CV a été regroupée en deux groupes différents en fonction de la direction de ce changement.

Ceux qui ont déplacé moins d'une charge ont été considérés comme « neutres » en ce qui concerne le changement de CV. Semblable aux résultats précédents, les précurseurs plus gros étaient significativement plus susceptibles d'être associés à une relation inverse entre les états de charge observés et le CV (tableau S2).

Avec un CV décroissant, la majorité des protéoformes semblaient transmettre à des états de charge inférieurs (n=177) par rapport à celles qui favorisaient des états de charge plus élevés (n=39). Les autres (n=40) ont été considérés comme « neutres » concernant les changements de CV.

Les protéoformes regroupées au sein du groupe neutre ont démontré une masse de précurseur moyenne entre les groupes inverse et direct, suggérant une fois de plus que la masse de la protéoforme est intrinsèquement liée à ce comportement.

Cependant, d'autres paramètres basés sur la séquence primaire, tels que la composition en acides aminés basiques/acides et l'indice aliphatique, n'étaient pas significativement corrélés (Tableau S2).

Bien que les protéines introduites dans la phase gazeuse soient vraisemblablement dénaturées, des facteurs généralement associés aux protéines natives, tels que le moment dipolaire ou la section efficace de collision, pourraient avoir une meilleure valeur prédictive de ce phénomène.64–66 Nos résultats démontrent comment le CV peut être utilisé pour filtrer des protéines de différentes natures. masses, et comment l'enveloppe d'état de charge d'une protéine peut également être transmise différentiellement via FAIMS.

Utilité des fragments de protéines dans les expériences TDP

Étonnamment, un nombre important de protéoformes que nous avons identifiées étaient des fragments de protéines plus grosses. Nous avons constaté que seulement 25 % des protéoformes uniques identifiées couvraient plus de la moitié de la séquence protéique dont elles étaient dérivées.

Ces 25 % avaient une masse moyenne de 11,4 kDa contre les 75 % restants qui avaient une masse moyenne de 5,7 kDa. Plusieurs facteurs peuvent contribuer à cette observation, dont certains sont indépendants du FAIMS.

Par exemple, ces fragments eux-mêmes peuvent être des produits de clivage protéolytique produits dans des conditions homéostatiques normales dans le cadre du « dégradome » cellulaire67 ou malgré les diverses précautions prises, introduites pendant l'intervalle post-mortem et la manipulation des échantillons.

Les tissus du système nerveux central sont une riche source de peptides de signalisation appelés « neuropeptides » qui sont également généralement dérivés de protéines précurseurs beaucoup plus grosses.68

En croisant nos identifications de protéoformes avec une base de données de neuropeptides établie (NeuroPedia), nous avons pu identifier plusieurs de ces neuropeptides, notamment la vasostatine -1, la sécrétoneurine, la cholécystokinine -58 desnonopeptide et le neuropeptide y ainsi que de nombreuses variantes de séquence non canoniques. dérivé des gènes producteurs de neuropeptides connus.

Au-delà des facteurs biologiques, certains paramètres de l'instrument peuvent également influencer l'observation des fragments de protéines. Par exemple, de faibles tensions de « fragmentation » dans la source (entre 10 et 20 V) peuvent généralement être utilisées pour éliminer les adduits et désolvater les ions protéines, tandis que des tensions plus élevées peuvent produire une dissociation induite par la source.

Cependant, la susceptibilité des liaisons amide à la dissociation peut varier considérablement et, à mesure que la taille d'une protéine augmente, la probabilité qu'elle contienne des liaisons amide labiles telles que Xaa-Pro.70–73. Comme les ions b et y peuvent être produits par inadvertance à travers cela. mécanisme, même à de faibles tensions de source, nous avons décidé d'éviter d'appliquer une tension de source pour réduire le risque d'introduction d'ions fragments dans l'instrument.

Il est également possible que les protéines soient sensibles aux événements de fragmentation lorsqu'elles traversent les champs électriques créés dans FAIMS. Cependant, on ne s'attendrait pas à ce que ces fragments aient la même mobilité que l'ion parent, avec la réserve que cela dépend probablement également de la taille du fragment par rapport à l'ion précurseur.

Enfin, il convient de souligner quelques facteurs qui peuvent biaiser l’observation de protéoformes plus petites (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

Cette propagation du signal peut être largement attribuée à l’enveloppe de l’état de charge et aux distributions isotopiques de chaque état de charge. L'utilisation d'un filtre MWCO de taille 3K comme étape de filtration finale dans notre préparation d'échantillons était spécifique à notre configuration expérimentale, qui dans ce cas a été choisie pour garantir que les protéoformes bêta amyloïdes plus petites pourraient être efficacement capturées si elles étaient présentes.

Des facteurs instrumentaux généraux peuvent également créer un biais en faveur des petites protéoformes, notamment le réglage du quadripôle, la capture électrodynamique et les collisions avec des molécules de gaz résiduelles dans la cellule Orbitrap, qui conduisent à une désintégration plus rapide du transitoire pour les molécules plus grosses.75 Indépendamment de ces biais ou de l'origine exacte des fragments, ils peuvent encore fournir des informations sur le protéome.

Ces fragments sont particulièrement utiles dans le contexte des maladies neurodégénératives où les perturbations de la protéostasie sont généralement liées à la pathologie.76,77

En effet, les fragments de tau s'avèrent souvent neurotoxiques et jouent un rôle dans la progression des tauopathies telles que la MA.23–26En général, les fragments que nous observons sont beaucoup plus gros que les peptides trypsiques, et dans plusieurs cas où il existe de nombreux fragments pour une protéine particulière. , nous observons une couverture de séquence considérable.

Ceci est illustré par l'examen des fragments fournissant une couverture pour la chaîne tubulinalpha-1B de ∼50 kDa (TUBA1B) et la synapsine de ∼70 kDa-1 (SYN1), comme le montre la figure 9A, B, toutes deux de grande taille. des protéines qui seraient autrement difficiles à observer sous leur forme complète dans le TDP d'un échantillon complexe.

Identification des protéoformes pertinentes pour les maladies neurodégénératives

L'utilisation de FAIMS avec notre analyse descendante a permis l'identification de plusieurs variantes d'épissage Swiss-Prot et entrées TrEMBL uniques, avec 267 variantes d'épissage uniques et 96 entrées TrEMBL (Tableau S3).

Notamment, nous observons plusieurs PrSM identifiant sans ambiguïté une isoforme ORF alternative (A{{0}}A0D9SF30) pour la molécule d'adhésion des cellules neurales1 (NCAM1). Nous avons également observé des protéoformes dérivées de gènes ayant un rôle connu dans plusieurs maladies neurodégénératives, en particulier la -synucléine et PARK7.

Dans ces deux cas, les protéoformes prédominantes contiennent la séquence complète. Il est intéressant de noter que la majorité des PrSM -synucléine, synucléine et (dans une moindre mesure) -synucléine contiennent un déplacement de masse inconnu d'environ 177 Da près de l'extrémité C (spectre -synucléine complet avec modification inconnue, comme le montre la figure S4A). .

Ce déplacement de masse a déjà été observé dans des recherches dans des bases de données ouvertes et se trouve généralement dans Asp ou Gluresidues.78 Une explication potentielle qui correspond étroitement à la masse moyenne et monoisotopique de la modification consiste en un oxygène avec trois atomes de fer ainsi que la perte de sept atomes d'hydrogène ( basé sur l'acquisition Unimod #1971).

La comparaison des pics isotopiques de l'ion fragment ay242+ de la -synucléine (Figure S4B) avec un spectre simulé contenant les éléments susmentionnés qui appartiendraient à la modification inconnue (FigureS4C) démontre la similitude entre les deux distributions isotopiques, avec de nombreux pics isotopiques alignés à moins de 2 ppm les uns des autres.

Il convient également de souligner que les pics isotopiques les plus à gauche sont uniques aux isotopes du fer naturels, et que l'absence de ces pics est facilement apparente lorsque le spectre est simulé sans contenir les trois atomes de fer (Figure S4D), ce qui suggère fortement que cette modification inconnue est très probablement composée. des éléments proposés.

Des études antérieures ont également décrit la forte affinité de la -synucléine pour divers ions métalliques, et la région que nous observons contenant cette modification chevauche des résidus connus pour être impliqués dans la liaison, en particulier le motif 119DPDNEA124 (Figure S5).79-81.

Nos données suggèrent également que les régions C-terminales de -synucléine et -synucléine jouent des rôles similaires dans la liaison aux métaux, car plusieurs spectres présentant le même déplacement de masse inconnu ont été adaptés à des séquences similaires au sein de ces protéines.

À propos de la protéine mitochondriale PARK7, nous avons noté un déplacement de masse d'environ 116, 0 Da sur son résidu Cys à site actif unique, C106 (Figure S6). Une explication potentielle avec une succinylation delta massis similaire, une modification attribuée au stress mitochondrial et aux formes dues à l'ajout par Michael de fumarate sur un groupe Cys thiol.82

For more information:1950477648nn@gmail.com