Améliorer la protéomique descendante du tissu cérébral avec FAIMS, partie 2

Analyse des données

L'identification des protéoformes a été réalisée avec TopPIC version 1.3.53. Les paramètres de TopPIC comprenaient une fenêtre de précurseur de 3 m/z (pour tenir compte de l'enveloppe isotopique), une tolérance d'erreur de masse de 15 ppm, un déplacement de masse inconnu max/min de 500 Da et un maximum nombre de modifications inconnues autorisées de 1.

Ces dernières années, de plus en plus d’études ont montré qu’il existe une relation étroite entre la morphologie des protéines et la mémoire. Les protéines sont les molécules les plus fondamentales des activités de la vie. Ils peuvent contrôler les activités vitales des cellules et maintenir le fonctionnement normal du corps humain. Des études ont montré que la morphologie des protéines joue non seulement un rôle important dans les activités de la vie cellulaire, mais qu'elle entretient également une relation indissociable avec la fonction de mémoire dans le cerveau. Une fois que la morphologie des protéines change, cela affectera la connexion entre les neurones, affectant ainsi la capacité de mémoire des personnes.

Aux premiers stades de la vie, les changements dans la morphologie des protéines jouent un rôle essentiel dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Si la morphologie des protéines n’est pas celle qu’elle devrait être, cela entraînera une série de problèmes neurologiques, pouvant éventuellement conduire à des pertes de mémoire, des troubles cognitifs, etc.

Cependant, il n’y a pas lieu de s’inquiéter. La technologie médicale moderne a permis aux gens d’ajuster la morphologie des protéines grâce à l’alimentation afin d’améliorer leur mémoire. Une alimentation riche et variée est riche en protéines, mais lorsque vous choisissez des protéines, essayez de choisir des aliments faibles en gras, en cholestérol et en glucides pour éviter les effets néfastes d'un apport excessif sur le corps.

Bref, morphologie des protéines et mémoire sont indissociables. Nous devons prêter attention à une alimentation saine et à un apport équilibré en protéines pour rester en bonne santé tout en préservant une bonne mémoire. On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car il a des effets antioxydants, anti-inflammatoires et anti-âge, qui peuvent aider à réduire l'oxydation et les réactions inflammatoires dans le cerveau, protégeant ainsi la santé du cerveau. système nerveux. En outre, Cistanche peut également favoriser la croissance et la réparation des cellules nerveuses, améliorant ainsi la connectivité et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces effets peuvent contribuer à améliorer la mémoire, la capacité d’apprentissage et la vitesse de réflexion, et peuvent également prévenir l’apparition de dysfonctionnements cognitifs et de maladies neurodégénératives.

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Les spectres MS2 ont été recherchés dans une base de données concaténée avec les entrées d'Homo sapiens Swiss-Prot (20 352), les variantes d'épissage Swiss-Prot (22,000) et TrEMBL (54 436), ainsi que les contaminants courants. Les protéoformes identifiées ont été filtrées à un taux de fausses découvertes (FDR) de 1 % via TopPIC.

L'analyse des données en aval a été effectuée dans l'environnement R à des fins de calcul statistique et de génération de figures.54 Dans l'analyse en aval, les protéoformes du même gène avec les mêmes acides aminés de début et de fin qui se sont avérés être à ± 5 Da ont été combinées en une seule protéoforme pour augmenter la rigueur. de nos missions.

Bien que le seuil de 5Da soit arbitraire, cette approche a compensé les pics mono-isotopiques mal attribués, l'ambiguïté des déplacements de masse inconnus et d'autres écarts artificiels. Pour déterminer l'écart type relatif (RSD) des protéoformes au sein des répétitions, nous avons utilisé la sortie « intensité caractéristique » de TopPIC.

Les cartes de couverture des séquences de fragmentation et les spectres associés ont été générés à l'aide du logiciel LCMsSpectator.55

Les paramètres spécifiques pour LCMsSpectator comprenaient une tolérance aux ions précurseurs de 10 ppm, une tolérance de production de 10 ppm, un seuil S/B minimum de 1,5, un seuil de corrélation de Pearson de 0,7, un lissage par défaut de 9 points, et un seuil d'intensité relative des isotopes précurseurs de 0,1.

RÉSULTATS ET DISCUSSION

L’ajout de FAIMS augmente considérablement la couverture protéomique

L'échantillon de tissu cortex provenant d'un patient diagnostiqué avec la maladie d'Alzheimer a été traité selon le flux de travail, comme le montre la figure 1. Nous avons d'abord cherché à analyser les performances de FAIMS sur divers CV par rapport à ceux sans FAIMS (appelés « Pas de FAIMS »).

Il convient de rappeler que l'interface FAIMS produit une légère perte de transmission des ions, probablement due au trajet plus long des ions à travers la source.56 Par conséquent, pour mieux représenter les conditions typiques et garantir des comparaisons équitables, les données « Pas de FAIMS » ont été collectées en utilisant le même échantillon sans l'unité FAIMS installée.

Ces données « No FAIMS » ont été collectées en triple et analysées selon le flux de travail, comme le montre la figure 1 avec une analyse des 6 principales analyses DDA MS2. Les ensembles de données « No FAIMS » ont identifié en moyenne 754 ± 35 protéoformes (Figure 2A et Tableau S1) et identifié collectivement 1 073 protéoformes uniques (non redondantes) (Figure 2B) dérivées de 293 gènes uniques (Figure 2C), couvrant 29 359 acides aminés à travers le protéome (Figure 2D).

La « couverture protéomique » métrique (Figure 2D) est définie comme les acides aminés non redondants couverts par la séquence de chaque protéoforme. Essentiellement, cette métrique tient compte à la fois de la longueur et de la diversité des protéoformes identifiées.

Nous considérons qu'il s'agit d'une mesure plus équilibrée par rapport au nombre brut de protéoformes et de gènes, car elle évite les biais en faveur de protéoformes plus petites. Bien que de simples décomptes de protéoformes ou de gènes soient intuitifs, ces mesures semblent être fortement influencées par de courts fragments protéolytiques. Les ensembles de données FAIMS ont été collectés de −50 à −20 CV scannés par pas de 5 V.

Chacun des 7 CV résultants a été collecté en triple. En ce qui concerne les protéoformes et les gènes, FAIMS a surpassé « No FAIMS » pour tous les CV testés dans la plage de -50 à -30 CV (Figure 2A – C).

Par exemple, les trois ensembles de données à -50 CV ont identifié 1 833 ± 17 protéoformes, soit une augmentation moyenne d'environ 140 % par analyse par rapport à "No FAIMS". Collectivement, ces trois ensembles de données à -50 CV ont identifié 2 564 protéoformes uniques provenant de 530 gènes uniques, couvrant un total de 43 437 acides aminés, soit une augmentation de 95, 69 et 69 % par rapport aux trois ensembles de données « NoFAIMS », respectivement (Figure 2B – D). et tableau S1).

De plus, bien que FAIMS à −25 V observe moins de protéoformes et de gènes uniques par rapport à « No FAIMS », les protéoformes elles-mêmes sont en moyenne beaucoup plus longues. Ainsi, lorsque l’on considère la longueur des protéoformes (Figure 2D), les ensembles de données de −25 V couvrent presque autant d’acides aminés du protéome (28 398) par rapport à « No FAIMS » (29 359), et ce avec seulement deux fois moins de protéoformes (Figure 2B). ).

Nous avons également étudié si FAIMS pouvait fournir une analyse aussi robuste et reproductible que sans FAIMS. Nous avons évalué la reproductibilité de la quantification en calculant le RSD (équivalent au coefficient de variation) de l'intensité des caractéristiques de chaque protéoforme, à condition que la protéoforme réponde au critère d'observation dans les trois ensembles de données répliquées pour chaque paramètre de CV.

Étant donné que les ensembles de données FAIMS et « No FAIMS » ont tous été collectés à partir d'un seul échantillon biologique, la variance entre les répétitions doit être exclusivement attribuée à des facteurs instrumentaux.

Le diagramme en boîte de la figure 3 (ainsi que les histogrammes individuels de la figure S1) montre comment les distributions des RSD se comparent entre les ensembles de données FAIMS et « No FAIMS ».

Sur la base de la RSD médiane, l'ajout de FAIMS a abouti à une qualité de quantification similaire ou légèrement améliorée par rapport à « Pas de FAIMS ». L'amélioration des RSD parmi les tensions inférieures (-20 à -30 CV) peut être liée à l'observation selon laquelle moins de protéoformes sont transmises dans cette plage, fournissant des spectres MS1 de meilleure qualité et donc de meilleures estimations de l'intensité des caractéristiques.

En outre, il convient de noter que les RSD déterminés à partir de ces répétitions sont similaires aux précédentes expériences descendantes55 et ascendantes57,58 réalisées avec une instrumentation similaire.

Prises ensemble, ces données démontrent que l’ajout de FAIMS au TDP augmente de manière robuste les identifications de protéoformes, sans aucun sacrifice sur la qualité de la quantification.

Nous avons ensuite étudié le chevauchement des identifications entre les CV, ce qui pourrait fournir le plus grand ensemble d'observations non redondantes.

En utilisant des coefficients de chevauchement, définis comme l'intersection entre deux ensembles divisé par le plus petit des deux ensembles, nous avons déterminé la similarité entre chaque ensemble de données. Le coefficient de chevauchement moyen global pour les identifications des gènes protéoformand et dans chaque CV FAIMS était de 0,76.

Ceci est comparable au coefficient de chevauchement des ensembles de données « No FAIMS » (0,77), ce qui suggère que les répliques techniques présentent une reproductibilité similaire. Une carte thermique affichant les coefficients de chevauchement FAIMS des protéoformes et des gènes est présentée respectivement aux figures 4 et S2.

Notamment, le chevauchement des identifications de gènes dans l’espace CV est beaucoup plus important par rapport aux toprotéoformes, bien qu’il soit particulièrement visible lorsque l’on compare les distances CV les plus longues.

Par exemple, le chevauchement entre −50 et −20 CV est de 0,64 au niveau du gène et de 0,06 au niveau des protéoformes. Cela était attendu puisque chaque gène peut potentiellement être représenté par plusieurs protéoformes.

La figure 4 démontre que même si une différence de CV de 5−10 V produit des coefficients de chevauchement généralement supérieurs à 0,5, les distances supérieures à 15 V produisent des degrés de dissimilarité plus importants et sont donc mieux espacées pour capturer des ensembles de protéoformes suffisamment différents.

Avec ces ensembles de données, nous avons ensuite cherché à déterminer quelles combinaisons de CV sont optimales pour obtenir une identification maximale des gènes, des identifications de protéoformes et une couverture de séquences avec des contraintes sur le nombre de CV pour chaque combinaison.

Tout d’abord, nous avons établi les combinaisons optimales pour un nombre quelconque de CV de 1 à 7 en utilisant les métriques de protéoformes uniques, de gènes et de couverture de séquences protéomiques (Figure 5).

En utilisant des combinaisons limitées à trois CV à titre d'exemple, les figures 5A, B détaillent comment −35, −40 et −50 V sont idéales si l'on souhaite maximiser le nombre de protéoformes ou de gènes.

Les protéoformes et gènes identifiés dans ces trois CV (neuf ensembles de données) couvrent 84 % du total des protéoformes uniques et 92 % du total des gènes sur l'ensemble des 21 ensembles de données.

Lors de la pesée de la longueur d'une protéoforme avec la couverture des séquences comme métrique, la combinaison idéale est de -30, -40 et -50 CV, couvrant 88 % des acides aminés uniques des 21 ensembles de données FAIMS avec seulement une perte modeste d'identifications de protéoformes et de gènes ( 4221 protéoformes et 723 gènes, figure 5C). Cependant, ces combinaisons incluent toutes les répétitions et représentent le nombre maximal d'identifications pouvant être obtenues pour une combinaison donnée de CV. Par conséquent, pour démontrer l'avantage de la progression du CV externe, nous avons décidé d'étudier quels nombres pourraient raisonnablement être obtenus en moyenne avec seulement trois exécutions, chaque exécution étant un CV différent.

En utilisant les ensembles de données −50, −40 et −30 V comme exemple, nous avons déterminé les protéoformes uniques moyennes, les gènes uniques et les couvertures de séquences protéomiques sur la base des 27 combinaisons uniques des trois répétitions différentes dans chaque CV.

Sur la base de cette analyse, nous avons pu obtenir 2 986 (± 46) protéoformes uniques et 618 (± 12) gènes uniques couvrant en moyenne 64 534 (± 1 089) acides aminés. Comparé aux ensembles de données triples « No FAIMS », qui ont identifié 1 073 protéoformes uniques et 293 gènes uniques couvrant 29 359 acides aminés, le CV externe s'échelonnant à -50, -40 et -30 V pourrait plus que doubler chaque métrique.

Néanmoins, la combinaison optimale de CV dépendra probablement également de l'organisme et du tissu dont l'échantillon est issu, des étapes de préparation de l'échantillon appliquées, ainsi que de tout fractionnement hors ligne supplémentaire mis en œuvre avant l'analyse LC-MS.

Dans l'ensemble, lorsqu'ils sont combinés à l'analyse de chevauchement (Figure 4), cela suggère que des distances de 15 V ou plus entre les CV fournissent le moins de chevauchement entre les protéoformes, tandis qu'une séparation de 5 à 10 V au sein du CV de -50 à -30 maximise les gènes, les protéoformes et le protéome. couverture de séquence.

Pour déterminer davantage l'impact de FAIMS sur la profondeur de la couverture protéomique, nous avons comparé les gènes identifiés à partir de nos ensembles de données descendantes à une analyse ascendante typique du cerveau humain.

Des ensembles complets de données ascendantes sur les tissus cérébraux humains nous ont permis d'estimer les abondances de 8 528 protéines à l'aide d'un comptage spectral pondéré.59–61 Les protéines ont été regroupées en 10 percentiles d'abondance différents sur la base de comptages spectraux compilés à partir de plusieurs ensembles de données ascendantes du cerveau humain.

En croisant nos ensembles de données descendants, nous avons pu déterminer d'où proviennent les gènes et les protéoformes et les classer en termes d'abondance estimée des protéines (à l'aide de décomptes spectraux normalisés par les ensembles de données) dans le cerveau humain (Figure 6).

Les gènes trouvés dans notre analyse descendante, mais pas dans l'ensemble de référence ascendant, ont été regroupés comme « NA ».

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