L'assombrissement de la peau résulte de l'accumulation de mélanine, un pigment cutané. Pour lutter contre cela, de nombreux agents éclaircissants pour la peau sont disponibles dans le commerce, dont la plupart inhibent la synthèse de mélanine. La décoloration de la mélanine est une méthode alternative d'éclaircissement de la peau. Dans cette étude, nous montrons que la lignine peroxydase (LiP), une enzyme extracellulaire purifiée à partir de Phanerochaete chrysosporium NK-1 isolée du sol forestier peut dégrader et décolorer efficacement la mélanine in vitro. Les conditions de décoloration, y compris le pH, la température, le temps d'incubation, la concentration en enzyme et l'ajout de médiateurs, ont été étudiées pour optimiser les conditions de réaction. Les résultats indiquent que pH 3, 40 degrés, 15 UI/ml et 10 h d'incubation étaient les conditions optimales pour la décoloration de la mélanine. L'utilisation du médiateur, l'alcool vératrylique, s'est également avérée efficace pour améliorer l'efficacité de la décolonisation de la mélanine, avec jusqu'à 92 % de décoloration. Les résultats de la microscopie électronique à balayage ont montré des espaces vides sur les granules de mélanine traités par rapport à l'échantillon non traité, indiquant la dégradation de la mélanine. Des changements dans la région des empreintes digitales de la mélanine ont été observés. Entre les nombres d'onde 1500–500 cm−1, par exemple, la présence de nouveaux pics dans la mélanine traitée à 1513, 1464 et 1139 cm−1 CH2, CH3 bend et C–O–C stretch représentaient des changements structurels. Un nouveau pic à 2144 cm-1 (alcynyl C≡C stretch) a également été détecté dans la mélanine décolorée. L'étude de cytotoxicité a montré que la mélanine et le LiP traités ont de faibles effets cytotoxiques ; cependant, le médiateur de l'alcool vératrylique pourrait entraîner une mortalité élevée, ce qui suggère que son utilisation devrait être méticuleusement testée dans la formulation de produits de santé et de soins de la peau. Les résultats de l'étude suggèrent que le LiP produit par Phanerochaete chrysosporium a le potentiel d'être utilisé dans les industries médicales et cosmétiques, en particulier pour le développement d'agents blanchissants cosmétiques biosourcés.

Selon des études pertinentes, le cistanche est une herbe commune connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal est le cistanoside, qui a divers effets tels que la promotion de la fonction antioxydante, anti-inflammatoire et immunitaire. Le mécanisme entre le cistanche et le blanchiment de la peau réside dans l'effet antioxydant des glycosides du cistanche. La mélanine dans la peau humaine est produite par l'oxydation de la tyrosine catalysée par la tyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, inhibant ainsi la production de mélanine.

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La mélanine est un groupe de pigments cutanés biopolymères polycycliques complexes, récalcitrants et envahissants produits par des cellules cutanées spécialisées appelées mélanocytes 1,2. Sa fonction principale est de protéger la peau contre les rayons UV nocifs du soleil en formant des coiffes supranucléaires autour de l'ADN des cellules cutanées 3. En outre, il est responsable des différentes couleurs de peau en absorbant divers radicaux libres dans le cytoplasme. La plupart de ces agents éclaircissants pour la peau obtenus à partir de ressources naturelles inhibent la production de mélanine dans les cellules de la peau par inhibition des enzymes tyrosinase, suppression de la biosynthèse des pigments et par certaines voies alternatives. Divers composés tels que l'hydroquinone, les éthers monobenzyliques d'hydroquinone, le mercure, les corticostéroïdes et l'arbutine sont utilisés dans la formulation commerciale des cosmétiques de blanchiment de la peau, cependant, leurs applications ont été associées à de graves effets secondaires. Par exemple, le mercure causerait des dommages aux reins et le plomb causerait de l'anxiété, de la dépression et de la psychose 4,5. L'utilisation de corticostéroïdes peut causer le syndrome de Cushing, le diabète, l'hypertension, l'insuffisance surrénalienne, l'immunosuppression, l'amincissement de la peau, l'acné, la dermatite et l'hypertrichose 6. Tain et al. (2009) ont rapporté que l'utilisation de l'arbutine dans les cosmétiques blanchissants pour la peau était efficace pour des concentrations allant jusqu'à 3 %, mais une nouvelle augmentation de la concentration provoquait des effets cytotoxiques. Compte tenu de ces limitations, les applications de ces inhibiteurs dans les cosmétiques blanchissants pour la peau ont été largement critiquées par les autorités de santé et de sécurité. Il a été proposé que les cosmétiques de blanchiment de la peau pourraient atteindre jusqu'à 155,44 milliards de dollars américains d'ici 2021 avec un taux de croissance annuel de 4,9 %. En raison de la demande croissante d'agents de blanchiment de la peau sûrs et naturels dans le monde, la décolonisation enzymatique de la mélanine a suscité un intérêt considérable 7–9.

Les enzymes extracellulaires microbiennes telles que la laccase, la peroxydase de manganèse et la peroxydase de lignine (LiP) ont déjà été testées pour la décoloration de la mélanine et sont considérées comme une alternative écologique potentielle aux produits chimiques toxiques 1. Parmi celles-ci, LiP s'est avérée très efficace pour la décoloration de la mélanine en raison de son potentiel redox élevé pour oxyder l'alcool vératrylique (VA) que les autres enzymes apparentées. Malgré un potentiel d'oxydation élevé et une catalyse efficace de la mélanine, la production volumétrique et les difficultés de purification sont les principales limites des applications commerciales de LiP dans les agents de blanchiment de la peau. De plus, LiP perd son activité enzymatique pour la décolonisation de la mélanine sous un excès de peroxyde d'hydrogène, qui est considéré comme critique pour l'oxydation de la mélanine. Outre son rôle important, H2O2 inactive LiP réduisant ainsi les performances catalytiques de l'enzyme.

Résultats

Décoloration de la mélanine par Phanerochaete chrysosporium NK-1.Les souches fongiques ont été testées pour la décoloration de la mélanine. Les champignons ont été inoculés en taches sur le milieu solide contenant de la mélanine et du VA comme inducteur LiP. Après sept jours d'incubation, Phanerochaete chrysosporium NK -1 a montré la capacité de décolorer la mélanine, comme le montre la figure 1.

Conditions pour une décoloration optimale de la mélanine.pH. L'enzyme purifiée a été utilisée pour la décoloration de la mélanine synthétique in vitro. Les effets de différentes conditions sur la décoloration de la mélanine ont été observés 10. Les effets du pH sur la décoloration de la mélanine par LiP ont d'abord été examinés. Pour cela, la décoloration de la mélanine a été réalisée à différentes conditions de pH variant de 2.0 à 6.0 à une température de 30 degrés à la fois en présence et en l'absence de VA pendant une période d'incubation de 6 h. Les résultats de la figure 2 montrent qu'en général, la décoloration de la mélanine en présence de VA était plus élevée dans toutes les conditions de pH. En particulier, il est plus important dans des conditions de pH plus élevé. VA peut aider à la formation de radicaux cationiques 11. Ces radicaux ont un potentiel redox beaucoup plus élevé pour attaquer les liaisons C – C de manière non spécifique dans la mélanine et entraîner une décoloration 12. En présence de VA, la décoloration la plus élevée de la mélanine de 88 pour cent a été atteint à pH 3 suivi de 71 pour cent à pH 2, alors que la décoloration de mélanine la plus faible de 39 pour cent a été observée à pH 6. En l'absence d'AV, la décoloration de mélanine la plus élevée de 86 pour cent a été observée à pH 3 alors que la plus faible une décoloration de la mélanine de 35 % et 36 % a été observée à pH 5 et 6, respectivement. La décoloration de la mélanine par LiP dans cette étude était très efficace dans des conditions de pH plus faibles, c'est-à-dire 2 et 3 (Fig. 2), bien que d'autres études aient montré une condition de pH optimale à 4 1.

Température. La décoloration de la mélanine par LiP a été étudiée à différentes températures allant de 20 à 60 degrés en présence et en l'absence de VA à une période d'incubation de 6 h. En l'absence d'AV, des pourcentages similaires (19 %) de décoloration de la mélanine ont été observés à des températures de 20 et 30 degrés (Fig. 3). La décoloration la plus élevée et la plus faible de la mélanine en l'absence d'AV a été observée à 40 et 50 degrés, respectivement. Cependant, avec VA dans la solution, la décoloration de la mélanine a augmenté de 20 à 40 degrés et a diminué jusqu'à 60 degrés. En présence d'AV, la décoloration la plus élevée de la mélanine est d'environ 60 % à 40 degrés. La décoloration est généralement plus faible car l'expérience a été menée dans des conditions de pH plus doux.

concentration LiP. La décoloration de la mélanine a également été examinée avec des variations de concentrations enzymatiques. Cinq concentrations différentes, c'est-à-dire 5, 10, 15, 20 et 25 UI/mL de LiP ont été examinées pour la décoloration de la mélanine en présence et en l'absence d'AV, comme le montre la Fig. 4. Étonnamment, la concentration enzymatique la plus efficace était de 15 UI/ml pour les deux solutions avec et sans AV. Après une période d'incubation de 6 h, la décoloration de la mélanine la plus élevée était de 92 % en présence d'AV et de 70 % en l'absence du médiateur en utilisant une concentration enzymatique de 15 UI/mL, tandis que la décoloration de la mélanine la plus faible de 23 % a été observée chez l'absence d'AV en utilisant 5 UI/mL de LiP. Il n'est pas clair que la décoloration soit moins efficace avec des concentrations enzymatiques élevées, c'est-à-dire 20 et 25 UI/ml (Fig. 4).

Durée d'incubation. Les expériences de décoloration ont été réalisées à 2, 4, 6, 8 et 10 h d'incubation. Ces réactions ont également été réalisées en présence et en l'absence de VA. Les résultats ont montré que l'efficacité de la décoloration est positivement corrélée au temps d'incubation, comme prévu (Fig. 5). L'augmentation de l'étendue de la délocalisation était plus importante dans l'incubation initiale. La plus forte décoloration de la mélanine (68 pour cent) a été observée après une période d'incubation de 10 h en présence de VA et de 59 pour cent en l'absence de VA. La décoloration de la mélanine était aussi faible que 15 % après 2 h d'incubation sans VA. Par conséquent, sur la base des résultats des tests, nous avons conclu que les conditions optimales sont pH 3, 40 degrés, 15 UI/ml et 10 h d'incubation.

Analyses SEM (microscope électronique à balayage) et FTIR (spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier).Les changements morphologiques et structurels de la mélanine ont été caractérisés par SEM et FTIR, respectivement. La mélanine décolorée a été analysée par MEB pour observer tout changement de surface morphologiquement. La mélanine synthétique sans aucun traitement enzymatique a été utilisée comme témoin. Comme le montre la figure 6, il y avait un espace vide sur les granules de mélanine traités par rapport à l'échantillon non traité, ce qui suggère que les particules de mélanine ont été attaquées par l'enzyme.

La mélanine décolorée a également été analysée par FTIR avec la mélanine non traitée comme témoin (Fig. 7). Les empreintes moléculaires de la mélanine décolorée et non traitée ont été obtenues et comparées pour confirmer tout changement structurel dans la mélanine traitée 13. Les spectres FTIR de la mélanine (C18H10N2O4) ont montré un large spectre d'absorption à 3272 cm-1 qui pourrait être attribué à la caractéristique O Vibrations d'étirement –H ou d'étirement N–H de l'acide carboxylique et des groupes phénoliques. Les changements dans le spectre FTIR de la mélanine traitée étaient perceptibles. La large bande à des nombres d'onde de 3 000 à 3 500 cm-1 indique la présence de groupes -NH et -OH dans les échantillons témoins et traités. Cependant, l'intensité de l'échantillon traité est significativement plus élevée que l'échantillon témoin, suggérant que le traitement a eu des ajouts de ces groupes fonctionnels à la structure par des attaques enzymatiques. Les pics à 2884,4 cm-1 et 2822 cm-1 indiquaient la présence de groupes alkyles dans le contrôle tandis que dans la mélanine décolorée, le pic au nombre d'onde 2884,4 cm-1 était absent. Le pic à 2822 cm-1 a dévié à la longueur d'onde 2835,92 cm-1 qui représentait également les changements structurels de la mélanine traitée dans cette région. Le pic au nombre d'onde 1710 cm-1 dans le contrôle a été attribué à la présence d'acide carboxylique. Ce pic était également absent ou réduit dans une large mesure dans la mélanine décolorée, confirmant à nouveau les changements structurels de la mélanine traitée. Il y a également eu quelques changements dans la région des empreintes digitales. Entre les nombres d'onde 1500–500 cm−1, par exemple, la présence de nouveaux pics dans la mélanine traitée à 1513, 1464 et 1139 cm−1 représentait des changements structurels. Un nouveau pic à 2144 cm-1 a également été détecté dans la mélanine décolorée.

Effets de cytotoxicité.La cytotoxicité de la mélanine dégradée et de LiP a été étudiée en utilisant la méthode de cytotoxicité des artémias 14,15. Dans la présente étude, les effets cytotoxiques de la mélanine et du LiP traités étaient faibles avec des taux viables de larves de crevettes supérieurs ou égaux à 90 % (tableau 1). L'augmentation de la concentration de LiP n'a eu aucun impact sur la viabilité des larves de crevettes jusqu'à 80 ul/mL (~ 80 UI/ml), suggérant sa faible activité cytotoxique. Chez les témoins positifs avec VA, le taux de mortalité était de 100 %, ce qui suggère que des précautions doivent être prises lors de l'application de LiP en présence de VA en tant que médiateur dans les domaines médical et cosmétique.

Discussion

Dans le cas de la température, la croissance fongique et la production d'enzymes les plus élevées ont été atteintes à 40 degrés, ce qui correspond à l'habitat naturel de P. chrysosporium. La capacité de LiP à dégrader la mélanine est basée sur la similitude structurelle entre la mélanine et la lignine 18. L'efficacité de la dégradation de la mélanine par LiP in vitro a été corrélée à plusieurs facteurs tels que le pH, la température, la concentration en enzyme et le temps d'incubation. que l'existence de VA. Un liP peut oxyder VA en ses radicaux cationiques (VA∙ plus) et servir de médiateur redox qui décolore davantage la mélanine, comme le montre la figure 8.

H2O2 est un substrat essentiel en tant qu'accepteur final d'électrons lors de la décoloration de la mélanine. Les LiP sont facilement inactivés dans leur excès de concentration qui induit la rupture de la structure de l'hème ou la formation du composé III inactif. Il est rapporté que cet effet inhibiteur peut être atténué par l'oxydation de VA en radical cationique VA 1 . LiP oxyde les radicaux cationiques VA en VA, qui agissent comme un médiateur redox pour décolorer la mélanine. VA est un composé naturel produit à partir de champignons de la pourriture blanche qui devraient avoir moins d'effets secondaires. Cependant, la présence du médiateur VA a entraîné une mortalité élevée des organismes testés, par rapport aux faibles effets cytotoxiques de la mélanine et du LiP traités. Il doit être soigneusement testé dans la formulation de produits de santé et de soins de la peau.

Matériels et méthodes

Isolement et identification de souches fongiques.L'isolement fongique a été réalisé à partir d'un site contaminé utilisé pendant longtemps comme dépotoir de matériaux ligneux. L'échantillon a été prélevé dans des bouteilles stériles et transféré au laboratoire pour purification. La purification a été effectuée sur un milieu gélosé au dextrose Seaboard. Quatre colonies fongiques différentes ont été isolées et purifiées à partir de l'échantillon. Le criblage de la meilleure souche a été effectué sur la base de la décoloration de la mélanine et de la production de biomasse en présence de mélanine comme seule source de carbone dans le milieu salin minéral (MSM). Sur la base du criblage, l'organisme sélectionné a été identifié en séquençant l'ADN de l'ARNr 5,8S et de l'ARNr 18S à l'aide des amorces universelles ITS-1 et ITS-4 10. Leur ADN génomique a été extrait selon la méthode d'Anderson et al. 19. Après purification, le séquençage des produits de PCR a été réalisé. Les séquences ont été alignées à l'aide de l'outil BLAST au NCBI et les homologues ont été analysés pour la phylogénie à l'aide de l'analyse génétique évolutive moléculaire (MEGA). Sur la base d'un maximum de vraisemblance, un arbre voisin a été construit pour l'identification de la souche fongique isolée. Les séquences ont été soumises au NCBI GenBank avec un numéro d'accession KX064682.1. L'analyse phylogénétique a révélé que l'isolat KX064682.1 était une souche de Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Dosage sur plaque pour la décoloration de la mélanine.Le champignon de la pourriture blanche, Phanerochaete chrysosporium NK-1, a été utilisé pour la décoloration de la mélanine. Phanerochaete chrysosporium est connu pour produire LiP. La mélanine synthétique (B049-97–6) a été utilisée comme mélanine modèle dans toutes les expériences de décoloration de la mélanine. Un milieu modifié avec VA 2 comme inducteur LiP a été utilisé pour tester la capacité de décoloration de la mélanine du champignon. Des boîtes de Pétri ont été utilisées pour la culture de Phanerochaete chrysosporium NK-1. Le milieu a été préparé en dissolvant 10 g de glucose, 2 g d'extrait de malt, 4 g de MgSO4·7H2O, 1 g de KH2PO4, 0.01 g de FeSO4, 0,005 g de ZnSO4, 0,2 g de mélanine synthétique et 15 g d'agar dans 1-L d'eau distillée. Les boîtes de Pétri inoculées ont été incubées à température ambiante dans l'obscurité. Le degré de décoloration de la mélanine sous et autour de la colonie du champignon a été observé. Il a été constaté que le champignon est capable de décolorer la mélanine et est en outre utilisé pour préparer des solutions enzymatiques.

Préparation d'enzyme pour la décoloration de la mélanine.Le milieu liquide de la culture contenait 10 g de glucose, 0.2 g d'extrait de levure, 0.07 g de VA, 3.{{13 }} g d'acide tartrique, 1 g de tween 80, 0.2 g de KH2PO4, 0.146 g de CaCl2·2H2O, 0.157 g de K2HPO4, 0.05 g de MgSO4·7H2O, 42,5 mg de ZnSO4·7H2O, 7,0 mg de CoCl2·6H2O, 7,0 mg de CuCl2.2H2O, 0,54 mg de FeCl3, 0,9 mg de NaCl et 0,2 mg de mélanine synthétique par litre d'eau distillée 20. Le pH du milieu a été ajusté à 4,0 avec des solutions de NaOH et HCl. Des flacons de 250 ml contenant des aliquotes de 100 ml de milieu de culture ont été autoclavés et inoculés avec un inoculum de 5 ml. Les flacons ont ensuite été incubés sur un agitateur rotatif à 30 degrés pendant 15 jours. Des échantillons en double ont été prélevés pour les dosages d'activité LiP à un intervalle de 24 h.

Dosage enzymatique.Les réactifs pour le test LiP comprenaient un tampon de tartrate de sodium 250 mM pH 5,5, VA 10 mM et H2O2 4 mM (30 %). Le dosage enzymatique a été effectué dans une cuvette de silice et l'absorbance a été mesurée à 310 nm par un spectrophotomètre UV-visible (Shimadzu, Kyoto, Japon). L'absorbance a été contrôlée à des temps de 0 à 30 s dans des conditions ambiantes. L'activité de l'enzyme a été calculée selon la loi de Beer, Eq. (1) 21.

où c, est la concentration de l'espèce d'atténuation ; A est l'absorptivité optique; ε est le coefficient d'atténuation molaire ; d est la longueur du chemin optique. La mesure de l'activité enzymatique implique la détermination du changement de concentration dans le temps, Eq. (2).

Optimisation pour une production accrue de LiP et une décoloration de la mélanine in vitro.L'optimisation de la production améliorée de LiP à partir de Phanerochaete chrysosporium NK -1 en utilisant la mélanine comme substrat a été réalisée à l'aide d'une conception Placket Burman. Un Placket complet était basé sur le fait qu'il sape les effets interactifs entre différentes variables alors qu'il ne considère que les tendances linéaires, Eq. (3) 22.

où Y représente la réponse et les symboles indiquent le coefficient de régression et k est le nombre de facteurs étudiés. Un total de 9 facteurs ont été étudiés pour atteindre la concentration la plus élevée de LiP de Phanerochaete chrysosporium NK-1 pour la décoloration de la mélanine présente dans le milieu. La conception Placket – Burman a été construite avec 12 essais expérimentaux au total, comme indiqué dans le tableau 2. Les expériences ont été menées pendant un total de 35 jours et la réponse a été mesurée (activité LiP UI/mL). Les données expérimentales ont été analysées à l'aide du logiciel statistique « Design Expert 9 ». Le milieu optimisé a été utilisé pour la production améliorée de LiP et purifié par précipitation à l'ammonium.

Optimisation de la production et de la purification d'enzymes.Un milieu immergé a été utilisé pour déterminer le temps d'incubation optimal en termes d'activités LiP. Comme le montre la figure 1 supplémentaire, la solution de culture a une activité enzymatique maximale au 8ème jour, soit 140 UI/ml. Par conséquent, un temps d'incubation de 8 jours a été utilisé pour produire la solution enzymatique.

Un total de 12 expérimentations ont été menées pour déterminer les facteurs (9) qui ont des impacts sur les activités LiP. Parmi les tests, les valeurs de réponse de l'activité LiP vont de 171 UI/ml à 576 UI/ml, comme le montre la Fig. 2 supplémentaire. 10 (547 UI/ml). Selon l'analyse de régression, la température, le temps, la concentration de glucose, la concentration de substrat et le médiateur ont des effets positifs sur l'activité LiP. L'effet de l'extrait de levure s'est avéré négligeable. D'autres facteurs ont des effets négatifs. Les conditions optimales pour la production de LiP sont temps : 35 jours, température : 40 degrés, glucose (par litre) : 20 g, fructose : 10 g, extrait de levure : 2 g, peptone : 2 g, inoculum : 10 ml, substrat médiateur : 0,1 ml. Ces conditions ont ensuite été utilisées pour la production accrue de LiP qui a été purifiée par des méthodes de précipitation à l'ammonium et de chromatographie sur gel (Sephadex G-75).

L'extraction enzymatique à un pH, une température et une durée d'incubation optimisés a été effectuée. La colonne de filtration sur gel Sephadex G75 a été utilisée pour séparer la fraction de la teneur en protéines du lysat cellulaire concernant le gradient de densité selon les instructions du fabricant. L'abondance de protéines dans l'extrait brut a également été indiquée par le nombre de bandes apparues lors d'une analyse sur gel de sodium dodécyl polyacrylamide (SDS-PAGE). Le poids moléculaire de l'enzyme purifiée était de 46, 0 kDa tel que calculé à partir de l'analyse SDS-PAGE (Figure 3 supplémentaire). Les activités enzymatiques après précipitation à l'ammonium et purification par chromatographie sur gel sont respectivement de 684,0 et 957,6 UI/ml.

L'enzyme purifiée a été utilisée pour la décoloration de la mélanine dans différentes conditions physiochimiques, notamment le pH, la température, le temps d'incubation et la concentration en enzyme. La mélanine synthétique (B049-97-6) a été utilisée comme mélanine modèle dans toutes les expériences de décoloration de la mélanine selon 23.

Expériences de décoloration.Effets du pH sur la décoloration de la mélanine. Pour observer les effets du pH sur la décoloration de la mélanine par LiP, des réactions de décoloration de la mélanine ont été réalisées à des pH allant de 2.0– 6.0. Le mélange réactionnel contenait 10 µl de l'enzyme brute dissoute dans un tampon TE et 1990 µl de 0,02 % p/v de mélanine. Ces réactions ont été réalisées à la fois en présence et en l'absence de VA. Les mélanges réactionnels ont été incubés à une température de 30 degrés pendant 6 h. Des expériences de contrôle ont été menées en parallèle en remplaçant la LiP active par l'enzyme dénaturée qui a été bouillie à 95 degrés. Les mélanges réactionnels ont été contrôlés pour la décoloration de la mélanine à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 540 nm avant et après incubation. L'efficacité de décoloration de l'enzyme a été exprimée en pourcentage (%). La décoloration de la mélanine a été calculée par Eq. (4) 11.

Effets du temps d'incubation sur la décoloration de la mélanine. Pour optimiser le temps d'incubation, des réactions de décoloration de la mélanine ont été effectuées à des temps d'incubation allant de 2 à 10 h. Le mélange réactionnel contenait 10 ul de l'enzyme brute dissoute dans un tampon et 1990 ul de 0,02 % p/v de mélanine à pH 4 en présence et en l'absence de VA. Les mélanges réactionnels ont ensuite été incubés à une température de 30 degrés et le pourcentage de décoloration de la mélanine a été obtenu.

Analyse SEM de la mélanine dégradée. Les changements morphologiques de surface de la mélanine ont été analysés par microscopie électronique à balayage (JEOL JSM-5910, Peabody, MA, USA) 24. La mélanine non traitée a été utilisée comme témoin. Les échantillons ont été séchés et fixés sur des stubs en cuivre (10x10mm2) avec du ruban carbone double face (collant des deux côtés). Les talons ont été lavés avec un détergent et séchés avec un séchoir à pistolet thermique (KADA 85U/SMD) à 200 degrés pendant 2 min avant la fixation de l'échantillon. La conduction de la pâte d'argent (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA) a été utilisée pour assurer la conduction du faisceau d'électrons. L'or a été déposé sur l'échantillon avec un plasma créé dans des conditions de haute tension (courant de 25 mA pendant 50 s) et de vide (10-2 ATM). La morphologie de surface des échantillons a été examinée à un grossissement de 3000.

Analyse FTIR de la mélanine décolorée.Les réactions ou les échantillons qui ont montré la décoloration la plus élevée de la mélanine dans l'expérience d'optimisation ont ensuite été analysés par spectroscopie FTIR (modèle n° 56, Merlin, Allemagne). Les échantillons ont été centrifugés (10,000 rpm pendant 1 min) et séchés à l'air comme étape de préparation pour l'analyse FTIR 20. Une analyse qualitative des échantillons de mélanine a été réalisée à l'aide d'un spectromètre UV-Vis proche infrarouge (NIR). Instruments Lambda 900/Perkin Elmer. Les spectres ont été enregistrés dans la gamme de 1000 à 3500 cm-1. Les échantillons ont été préparés dans des pastilles de KBr avec une dispersion de poudre. La mélanine synthétique non traitée a été utilisée comme témoin dans cette analyse.

Cytotoxicité de la mélanine dégradée et LiP.Des tests de létalité des crevettes de saumure ont été effectués pour vérifier la cytotoxicité de la mélanine dégradée 14,15. Les œufs des crevettes de saumure ont été éclos dans un plat rectangulaire contenant de l'eau de mer artificielle. Le plat contenait un séparateur en plastique avec de petits trous et divisait le plat en deux compartiments inégaux. Les œufs étaient tachetés dans le plus grand compartiment et recouverts pour éviter toute pénétration de lumière, tandis que le plus petit compartiment était éclairé par une lampe au-dessus. Les larves écloses ont été attirées par la lumière vers le petit compartiment. Après 48 h d'incubation, les nauplii matures ont été prélevés du compartiment éclairé à l'aide d'une pipette pasteurisée.

Analyses statistiques.Les données expérimentales ont été analysées à l'aide du logiciel statistique « Design Expert 9 ». Des images graphiques ont été dessinées au moyen de trois essais expérimentaux avec un écart type calculé. La signification statistique de l'essai expérimental a été calculée par ANOVA.

Disponibilité des données

Les références

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