Évaluation des compositions d'acides gras, des activités antioxydantes et pharmacologiques de l'huile de graines de citrouille (Cucurbita Moschata) issue de l'extraction enzymatique aqueuse Partie 1

May 08, 2023

Abstrait:L'huile de graines de citrouille est un sous-produit riche en nutriments et en composants bioactifs qui favorisent plusieurs bienfaits pour la santé. Cette étude visait à comparer les compositions chimiques, les activités antioxydantes et pharmacologiques des huiles de pépins de courge extraites de Cucurbita moschata Duch. Ex Poiré. (PSO1) et Cucurbita moschata (potiron japonais) (PSO2) par extraction enzymatique aqueuse. Un mélange enzymatique composé de pectinase, de cellulase et de protéase (1:1:1) a été utilisé dans le processus d'extraction enzymatique. La composition en acides gras des huiles a été déterminée à l'aide d'esters méthyliques d'acides gras/chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Les dosages de l'activité antioxydante ont été mesurés en utilisant du diphénylpicrylhydrazyle radical libre stable, du cation radicalaire 2, du 20 -azinobis-(3- éthylbenzothiazoline-6-sulfonate, du pouvoir réducteur/antioxydant ferrique et du dosage du thiocyanate ferrique. Les enzymes impliquant le vieillissement de la peau et le processus de blanchiment ont été étudiées. L'acide linoléique était un composant majeur de toutes les huiles de pépins de citrouille. De plus, il y avait également une quantité importante d'acide oléique, d'acide palmitique et d'acide stéarique détecté. Le PSO2 possédait les activités antioxydantes les plus élevées par rapport à PSO1 et huiles de pépins de citrouille commerciales (COM1 et COM2). PSO1 et PSO2 ont tous deux montré des effets inhibiteurs plus élevés sur l'hyaluronidase, la collagénase et la tyrosinase que les publicités. Par conséquent, l'extraction enzymatique aqueuse pourrait produire des huiles de pépins de citrouille avec des propriétés antioxydantes, anti-âge et anti-âge plus élevées. activités de blanchiment, ce qui est bénéfique pour d'autres études pharmacologiques et peut être utilisé comme aliment fonctionnel pour les bienfaits de la peau.

Selon des études pertinentes,cistancheest une herbe commune qui est connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal estcistanoside, qui a divers effets tels queantioxydant, anti-inflammatoire, etpromotion de la fonction immunitaire. Le mécanisme entre cistanche etpeau blanchimentréside dans l'effet antioxydant du cistancheGlycosides. La mélanine de la peau humaine est produite par l'oxydation de la tyrosine catalysée parTyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, ainsiinhibant la production de mélanine.

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Mots clés:Cucurbita moschata; citrouille japonaise; huile de pépins de courge; extraction enzymatique aqueuse; Les acides gras; antioxydant; anti-âge

1. Introduction

La citrouille appartient au genre Cucurbita et à la famille des Cucurbitacées, une plante commune et célèbre cultivée dans le nord du Mexique et qui s'est propagée en Europe, en Amérique occidentale et en Asie [1]. La citrouille est considérée comme un aliment fonctionnel qui contient des nutriments abondants tels que des protéines, des glucides, des lipides, des fibres, etc., ainsi que des composés phytochimiques tels que les tocophérols, les caroténoïdes et le -sitostérol [2]. Les phytonutriments de diverses parties de la citrouille se sont avérés avoir des activités pharmacologiques [2]. L'extrait de peau de citrouille a montré des effets bénéfiques sur les brûlures dans des modèles animaux [3]. La pulpe de citrouille a démontré une activité antioxydante, anti-inflammatoire et anti-angiogenèse [2], ainsi qu'une activité anti-fatigue chez la souris [4]. De plus, la graine de courge est une bonne source naturelle d'acides gras essentiels et de phytostérols qui diminuent le risque de mortalité cardiovasculaire [5,6]. L'huile de graines de citrouille est un sous-produit de la transformation des graines de citrouille, qui sont riches en divers acides gras et composés bioactifs tels que -carotènes, -tocophérol, vitamine B, lutéine, phytostérols et autres minéraux [7,8]. L'huile exerce des effets antioxydants, anti-inflammatoires, antibactériens et cicatrisants [1,9]. De plus, il présente plusieurs avantages pour la santé contre les maladies, telles que l'hypertension, le diabète et le cancer [8,10].

Différentes méthodes d'extraction de l'huile de graines ont été développées, y compris des méthodes mécaniques telles que la pression à froid [11] et l'extraction à haute pression [12]. L'extraction par solvant de l'huile de graines à l'aide de solvants organiques tels que l'hexane, l'acétate d'éthyle, l'acétone et le méthanol a également été documentée [13,14]. L'extraction assistée par enzyme est une méthode alternative pour l'industrie des huiles végétales car il s'agit d'une technologie respectueuse de l'environnement et sûre. Le principal mécanisme de l'extraction enzymatique aqueuse est l'hydrolyse et la rupture des parois cellulaires du matériel végétal, conduisant à une plus grande perméabilité et libérant des composants bioactifs, y compris la phase huileuse [15]. Divers mélanges d'enzymes appliqués dans cette extraction sont composés de pectinases, de cellulases, d'hémicellulases, d'arabinose, de -glucanase et de xylanase [16,17]. Les conditions optimisées d'un mélange d'enzymes, par exemple, la température, le pH, le temps de réaction, la taille des particules et la concentration en enzyme, ont également amélioré l'activité enzymatique [16]. De nos jours, cette méthode a été largement utilisée pour extraire l'huile de nombreux fruits et graines de plantes [18,19]. Certaines études antérieures ont démontré l'état optimisé de l'huile de pépins de courge pour obtenir un rendement élevé et des activités pharmacologiques efficaces [20,21].

Actuellement, les gens consomment de l'huile de pépins de courge dans les desserts ou les vinaigrettes, et c'est aussi un ingrédient populaire dans les cosmétiques. Le vieillissement cutané est un processus biologique complexe qui se caractérise par des rides, une perte d'élasticité, une perte d'humidité et une texture rugueuse causées par le stress oxydatif, les dommages à l'ADN et l'accumulation avancée de produits finaux de glycation [22]. L'acide hyaluronique, le collagène et l'élastine, qui sont des composants importants de la peau, peuvent être dégradés par les enzymes hyaluronidase, collagénase et élastase, respectivement, entraînant le vieillissement cutané. Plusieurs huiles végétales, telles que l'huile d'olive, l'huile de graines de tournesol, l'huile de pépins de raisin et l'huile de jojoba, ont été utilisées pour les propriétés cosmétiques de la peau afin de retenir l'humidité, d'améliorer la fonction de barrière cutanée et de prévenir le vieillissement cutané [23]. De plus, la pigmentation de la peau est un phénotype variable et perceptible chez l'homme qui implique la mélanogénèse et est régulée par l'enzyme tyrosinase [24]. À l'heure actuelle, divers extraits de plantes ont été testés pour les cosmétiques et les produits pharmaceutiques afin de diminuer la production de mélanine, agissant comme agents blanchissants [25,26].

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Récemment, C. moschata Duch. Ex Poir est un cultivar de citrouille couramment cultivé et populaire en Thaïlande, mais il existe peu d'études portant sur ses valeurs fonctionnelles et ses propriétés pharmacologiques. De plus, l'extraction enzymatique aqueuse est une méthode intéressante pour extraire l'huile des graines de citrouille pour obtenir un rendement et une efficacité élevés. Par conséquent, cette étude s'est concentrée sur la détermination des principaux constituants, des activités antioxydantes et pharmacologiques de l'huile de pépins de courge de C. moschata Duch. Ex Poiré. (cultivar thaïlandais) et C. moschata (citrouille japonaise) en utilisant la méthode d'extraction enzymatique aqueuse.

2. Matériels et méthodes

2.1. Matières végétales

Les fruits frais de C. moschata Duch. Ex Poir et C. moschata (citrouille japonaise) ont été achetées sur un marché local à Chiang Mai, en Thaïlande, en décembre 2020. Les graines ont été collectées et tous les brins fibreux ont été retirés. Après l'élimination du tégument, les graines de citrouille décortiquées ont été lavées et séchées à température ambiante. Les graines ont été conservées dans un sac en plastique scellé jusqu'à de nouvelles expérimentations. De plus, deux échantillons commerciaux d'huile de pépins de courge (COM1 et COM2) ont été achetés dans un supermarché de Chiang Mai, en Thaïlande. Toutes les expériences ont été réalisées dans la limite de la date d'aptitude à la consommation des huiles commerciales.

2.2. Produits chimiques et réactifs 

Collagénase de Clostridium histolyticum (ChC—EC.3.4.23.3), élastase de pancréas de porc (PE—EC 3.4.21.36), N-succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide, sulfate ferrique (FeSO4), sel de sodium d'acide hyaluronique de Streptococcus equi, hyaluronidase de tests bovins, pectinase d'Aspergillus niger (EC 3.2.1.15, supérieur ou égal à 5 ​​unités/mg de protéine, pH optimal=4.{{20}}, température optimale=61 ◦C), cellulase d'Aspergillus niger (EC 3.2.1.4, supérieur ou égal à 0.3 unités/mg solide, pH optimal=6.5, température optimale {{ 30}}–55 ◦C), protéase d'Aspergillus Saito (EC 3.4.21.112, supérieure ou égale à 0,6 unités/mg solide, pH optimal=5.1, température optimale=57.2 ◦ C), 2,20 -azinobis 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate (ABTS), 2,2-diphényl-1-picrylhydrazylhydrate (DPPH), 2,4,6 tripyridyl-s-triazine (TPTZ), acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox), albumine de sérum bovin, acide kojique, L -tyrosine, L-DOPA, acide linoléique, phosphate de sodium monobasique (NaH2PO4·2H2O), phosphate de sodium dibasique et tyrosinase de champignon ont été achetés chez Sigma-Aldrrich (St. Louis, Missouri, États-Unis). De plus, 37 % d'acide chlorhydrique, 95 % d'éthanol, de l'eau distillée (DI), du diméthylsulfoxyde (DMSO) et du méthanol ont été achetés auprès de RCI Labscan Co., Ltd. (Bangkok, Thaïlande). Le thiocyanate d'ammonium (NH4SCN) et le chlorure ferreux (FeCl2) ont été achetés chez Loba Chemie Pvt. Ltd. (Mumbai, Inde). Le tris (hydroxyméthyl) aminométhane a été acheté chez Merck (Darmstadt, Allemagne).

2.3. Extraction Enzymatique Aqueuse

Les huiles de pépins de courge de C. moschata Duch. Ex Poir et C. moschata (citrouille japonaise) ont été extraits par une méthode d'extraction enzymatique aqueuse en utilisant les paramètres d'hydrolyse enzymatique d'une étude précédente de Kanopka et al. (2016), y compris la concentration enzymatique, le rapport enzyme-substrat, la température de réaction, le pH et le temps de réaction [21]. Trois types d'enzymes différents, dont la pectinase, la cellulase et la protéase, ont été combinés dans un rapport pondéral de 1:1:1 pour générer un cocktail concentré d'enzymes. Ensuite, le cocktail de concentré résultant a été dilué dans de l'eau DI pour générer un mélange enzymatique aqueux à 2 % en poids/poids. Les graines de citrouille sans coque ont ensuite été ajoutées au mélange enzymatique aqueux résultant dans un rapport pondéral de 1:1. Le mélange a ensuite été finement broyé à l'aide d'un mélangeur Moulinex DB81 à température ambiante jusqu'à homogénéité. Le pH de la bouillie résultante a ensuite été ajusté à 4,7 en utilisant du HCl 0,1 M et incubé à 54 °C pendant 15 h. Une fois la bouillie refroidie à température ambiante, elle a été centrifugée à 11 500 × g pendant 10 min. La couche supérieure de surnageants, qui était la phase huileuse, a été recueillie. La crème produite lors du processus d'extraction n'a pas été émulsionnée mais éliminée par siphonnage à l'aide d'une micropipette. Le résidu de graines de citrouille a été éliminé par filtration à travers du papier filtre Whatman n° 1 sous vide [21]. Huile de pépins de courge de C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) et C. moschata (citrouille japonaise) (PSO2) ont été conservés dans des récipients bien fermés et résistants à la lumière à température ambiante jusqu'à nouvelle expérimentation.

2.4. Détermination de la composition chimique de l'huile de graines de citrouille à l'aide de la méthode ester méthylique d'acide gras/chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (FAME/GC/MS)

L'huile de pépins de citrouille a été déterminée pour la composition en acides gras en utilisant la méthode ester méthylique d'acide gras/chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (FAME/GC/MS). Le FAME est un type d'ester d'acide gras dérivé de la transestérification catalysée par un acide des graisses avec du méthanol. Dans cette étude, les huiles de pépins de citrouille (PSO1, PSO2, COM1 et COM2) ont été saponifiées en ajoutant 0.5 M solution de NaOH dans du méthanol à 100 ◦C pendant 15 min . Après refroidissement, les échantillons d'huile ont été dérivés avec du trifluorure de bore (BF3) dans une solution de méthanol à 100 ◦C pendant 1 min pour former des produits FAME. Après refroidissement et addition de NaCl saturé et d'hexane, les FAME ont été partagés en phase hexane et ont été recueillis dans des flacons pour injection. Les extraits de FAME ont été analysés à l'aide de la technique GC/MS dans les conditions suivantes : dimension de la colonne capillaire (TR-FAME, taille 60 m × 0,25 mm, taille des particules 0,25-µm), programme de température de fonctionnement de 50 ◦C ; maintien 2 min avec rampe 1 vitesse de 10 ◦C/min jusqu'à 180 ◦C, maintien 15 min ; rampe 2 cadence de 4 ◦C/min, température finale 230 ◦C, maintien 22.50 min. L'hélium a été utilisé comme gaz porteur à un débit de 1,0 mL/min. Les échantillons d'huile ont été injectés en mode splitless (split ratio 1:20 et split fellow 20 mL/min) à 235 ◦C par un échantillonneur automatique. Un détecteur MS équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI) fonctionnant à 70 eV avec les températures de la source d'ions et de la ligne de transfert réglées respectivement à 200 ◦C et 220 ◦C, a enregistré des spectres de masse dans la gamme m/z de 38–600. Les composés analysés ont été attribués en comparant leurs spectres de masse aux données publiées (National Institute of Standards and Technology, 2008). La composition en pourcentage a été calculée en intégrant les pics dans les chromatogrammes d'ions totaux (TIC). Toutes les mesures ont été effectuées par le Research and Service Laboratory, The Halal Science Center, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand sous Halal GMP/HACCP et Halal-QHS/ISO 22000.

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2.5. Détermination des activités antioxydantes

2.5.1. Essai de piégeage des radicaux 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

L'activité de piégeage des radicaux DPPH (DPPH•) a été déterminée en utilisant la méthode établie par Chaiyana et al. (2017) [27]. En bref, 20 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) et d'acide linoléique dissous dans du DMSO ont été mélangés à 180 µL de solution éthanolique DPPH 167 µM dans une plaque 96-puits, puis incubés pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. L'acide ascorbique (1 mg/mL) a été utilisé comme témoin positif. La densité optique (DO) a été mesurée à 520 nm en utilisant un lecteur de microplaque (lecteurs de microplaque EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. Le pourcentage d'inhibition du DPPH a été calculé à l'aide de l'équation (1) :

Inhibition du DPPH (pourcentage)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (1)

où ODA est la DO d'un mélange contenant de l'eau DI et une solution de DPPH•; B est l'ODB d'un mélange contenant de l'eau DI et du DMSO ; C est l'ODC d'un mélange contenant des échantillons d'huile et une solution de DPPH•; et ODD est la DO d'un mélange contenant des échantillons d'huile et du DMSO.

2.5.2. Dosage de l'acide 2,20 -azino-bis-3-éthylbenzthiazoline-6-acide sulfonique (ABTS)

L'activité de piégeage des radicaux cationiques ABTS (ABTS• plus) a été mesurée par la méthode colorimétrique selon Chaiyana et al. (2017) et Paradee et al. (2019) [27,28] avec une légère modification. ABTS• plus a été généré en ajoutant 2 ml d'ABTS 7 mM avec 3 ml de persulfate de potassium 2,45 mM et incubé pendant 16 à 24 h à température ambiante dans l'obscurité. L'ABTS• plus résultant a ensuite été dilué avec de l'éthanol pour obtenir une DO de 0,7 ± 0,1 à 750 nm. En bref, 20 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) et d'acide linoléique dissous dans du DMSO ont été mélangés avec 180 µL d'ABTS• plus une solution éthanolique dans une plaque à puits 96- et incubés pendant 5 min à température ambiante . La DO a été mesurée à 750 nm en utilisant un lecteur de microplaques (lecteurs de microplaques EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). L'acide ascorbique (1 mg/mL) a été utilisé comme témoin positif. La courbe standard a été produite en traçant l'absorbance à 750 nm par rapport à différentes concentrations de Trolox allant de 2,5 à 30 µg/mL. L'activité de piégeage de l'ABTS• plus a été calculée à partir de la courbe standard du Trolox (R2=0.9922) et exprimée en capacité antioxydante équivalente du Trolox (TEAC). Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants.

2.5.3. Dosage du pouvoir antioxydant réducteur ferrique (FRAP)

Le pouvoir antioxydant réducteur ferrique (FRAP) de chacun des échantillons a été déterminé à l'aide du test FRAP comme décrit dans une étude précédente de Chaiyana et al. (2017) qui avait été légèrement modifié par Saeio et al. (2011) [27,29]. Le réactif FRAP a été fraîchement généré en mélangeant 300 mM de tampon acétate (pH 3,6), 10 mM de 2,4,6 tripyridyl-s-triazine (TPTZ) dans 40 mM de HCl et 20 mM de FeCl3 dans la proportion de 10: 1: 1. Dans cette étude, 20 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) et d'acide linoléique ont été mélangés avec 180 µL de réactif FRAP dans une plaque à puits 96- et incubés pendant 5 min à température ambiante dans l'obscurité. La DO a été mesurée à 595 nm en utilisant un lecteur de microplaques (lecteurs de microplaques EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). L'acide ascorbique (1 mg/mL) a été utilisé comme témoin positif. La courbe standard a été produite en traçant l'absorbance à 595 nm par rapport à différentes concentrations de sulfate ferrique (FeSO4) allant de 0,003 à 0,5 mM. La valeur FRAP a été calculée à partir de la courbe standard de FeSO4 (R2=0.9965) et exprimée en capacité équivalente (EC1). Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants.

2.5.4. Dosage du thiocyanate ferrique (FTC)

L'inhibition de la peroxydation lipidique a été étudiée par la méthode au thiocyanate ferrique (FTC). Cette méthode a été réalisée selon les étapes décrites par Osawa et al. (1981) [30] avec une légère modification. Le mélange était composé de 50 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) et d'acide linoléique, 50 µL d'acide linoléique à 50 % dans du DMSO, 50 µL de solution aqueuse de thiocyanate d'ammonium à 10 % (NH4SCN) , et 50 µL de chlorure ferreux 2 mM (FeCl2). Ensuite, le mélange a été incubé à 37 ± 2 °C pendant 1 h et la DO a été mesurée à 500 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (lecteurs de microplaques EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). - Le tocophérol (0,025–0,1 mg/mL) a été utilisé comme contrôle positif. Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. L'activité d'inhibition de la peroxydation des lipides a été calculée à l'aide de l'équation (2) :
Inhibition de la peroxydation lipidique (pourcentage)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA−ODB)} × 100, (2)
où ODA est la DO du mélange contenant l'acide linoléique, NH4SCN et FeCl2 ; ODB est l'OD du DMSO ; ODC est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, de l'acide linoléique, du NH4SCN et du FeCl2 ; et ODD est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile et du DMSO.

2.6. Détermination des activités anti-âge

2.6.1. Activité anti-hyaluronidase

La mesure de l'activité anti-hyaluronidase a été effectuée comme décrit précédemment par Chaiyana et al. (2020) [31]. Tout d'abord, 20 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ont été mélangés avec 100 µL de solution d'hyaluronidase à 15 U/mL et incubés à 37 ◦C pendant 10 min. Après l'incubation, 100 µL d'acide hyaluronique à 0,03 % p/v dissous dans un tampon phosphate 20 mM (pH 5,35) ont été ajoutés, puis incubés à 37 °C pendant 45 min. Après cela, 1 ml d'albumine de sérum bovin à 0,1% a été ajouté et incubé à température ambiante pendant 10 min. La DO a été déterminée à 600 nm à l'aide d'un détecteur multimode (Beckman Coulter DTX880, Fullerton, CA, USA). L'acide oléanolique (0,25 % p/v) a été utilisé comme témoin positif. Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. Le pourcentage d'inhibition de la hyaluronidase a été calculé à l'aide de l'équation (3) :

Inhibition de la hyaluronidase (pourcentage)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (3)
où ODA est la DO du mélange contenant de l'eau DI, une solution de hyaluronidase et de l'acide hyaluronique ; ODB est la DO du mélange contenant de l'eau DI et du tampon phosphate (pH 5,35) ; ODC est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, une solution de hyaluronidase et de l'acide hyaluronique ; et ODD est la DO du mélange contenant les échantillons d'huile et le tampon phosphate (pH 5,35).

2.6.2. Activité anti-collagénase

La mesure de l'activité anti-collagénase a été réalisée selon le processus établi par Chaiyana et al. (2019) et Thring et al. (2009) avec de légères modifications [32,33]. En bref, 20 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ont été mélangés avec 20 µL de solution de collagénase à 0,1 U/mL de Clostridium histolyticum et incubés à 37 ◦C pendant 15 min. Après l'incubation, 80 µL de tampon tricine 50 mM (400 mM NaCl et 10 mM CaCl2, pH 7,5) et 40 µL de N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly- Une solution de substrat Pro-Ala (FALGPA) a été ajoutée. La DO a été immédiatement détectée à 340 nm puis mesurée en continu pendant 20 min à l'aide d'un lecteur de microplaque (Microplate reader EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). L'acide oléanolique (1 % p/v) a été utilisé comme témoin positif. Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. Le pourcentage d'inhibition de la collagénase a été calculé à l'aide de l'équation (4) :

Inhibition de la collagénase (pourcentage)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (4)
où ODA est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, une solution de collagénase, un tampon tricine et un substrat FALGPA ; et ODB est la DO du mélange contenant du DMSO, une solution de collagénase, un tampon tricine et un substrat FALGPA.

2.6.3. Activité anti-élastase

La mesure de l'activité anti-élastase a été réalisée selon le processus établi par Chaiyana et al. (2019) et Thring et al. (2009) avec de légères modifications [32,33]. Brièvement, 10 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ont été mélangés avec 40 µL de solution d'élastase à 0,03 U/mL de pancréas porcin, puis 50 µL de tampon Tris-HCL 200 mM (pH 8,0) et 100 µL de Une solution de substrat N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (AAAPVN) 0,8 mM a été ajoutée. La DO a été immédiatement détectée à 410 nm puis mesurée en continu pendant 20 min à l'aide d'un lecteur de microplaques (Microplate reader EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). L'acide oléanolique (1 % p/v) a été utilisé comme témoin positif. Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. Le pourcentage d'inhibition de l'élastase a été calculé à l'aide de l'équation (5) :

Inhibition de l'élastase (pourcentage)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (5)
où ODA est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, une solution d'élastase, un tampon Tris-HCl et un substrat AAAPVN ; et ODB est la DO du mélange contenant du DMSO, une solution d'élastase, un tampon Tris-HCl et un substrat AAAPVN.

2.7. Détermination des activités anti-tyrosinase

L'effet blanchissant d'un extrait naturel a été établi par la mesure de l'activité anti-tyrosinase qui a été réalisée selon Saeio et al. (2011) et Laosirisathian et al. (2020) [29,34]. La L-tyrosine et la L-DOPA étaient les substrats de l'enzyme tyrosinase dans cette étude. En bref, 10 µL d'échantillons d'huile (PSO1, PSO2, COM1, COM2) ont été mélangés avec 30 µL de tyrosinase dans une plaque à puits 96-, puis incubés à température ambiante pendant 10 min. Après incubation, 100 µL du substrat, qui est 2,5 mM de L-tyrosine ou L-DOPA, ont été ajoutés et incubés pendant 30 min. La DO a été déterminée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (lecteurs de microplaques EZ Read 2000, Biochrome, Angleterre). L'acide kojique (20 µg/mL) a été utilisé comme témoin positif. Les expériences ont été faites en triple et réalisées en trois indépendants. Le pourcentage d'inhibition de la tyrosinase a été calculé à l'aide de l'équation (6) :

Inhibition de la tyrosinase (pourcentage)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (6)
où ODA est la DO du mélange contenant du DMSO, l'enzyme tyrosinase et la L-tyrosine ; ODB est la DO du mélange contenant l'enzyme tyrosinase et le PBS avec un pH de 6,8 ; ODC est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, l'enzyme tyrosinase et la L-tyrosine ; et ODD est la DO du mélange contenant des échantillons d'huile, l'enzyme tyrosinase et du PBS avec un pH de 6,8.

2.8. Analyses statistiques

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (ET). La signification statistique a été analysée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post-hoc de Tukey à l'aide de GraphPad Prism (version 8.0, GraphPad Software), et p <0.05 a été considéré statistiquement significatif.

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3. Résultats et discussion

3.1. Caractère de l'huile de graines de citrouille

Dans cette étude, nous avons utilisé l'extraction enzymatique aqueuse au lieu de l'extraction par solvant organique pour extraire l'huile de pépins de courge de C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) et C. moschata (PSO2) car c'est un procédé simple, efficace et productif [15,21]. PSO1 était un liquide brun foncé à faible viscosité, tandis que PSO2 était un liquide brun verdâtre à faible viscosité. Les deux huiles de pépins de courge avaient leur odeur caractéristique. Les rendements en PSO1 et PSO2 étaient de 17,7 % v/w et 15,6 % v/w, respectivement. Outre l'huile, il a été rapporté que les graines de citrouille contiennent une variété de composés nutritionnels. Les compositions immédiates de C. moschata étaient principalement des glucides (39,51 %), suivis des lipides (28,49 %), des protéines (19,23 %), de l'eau (7,67 %) et des cendres (5,18 %), respectivement [35]. Cependant, par rapport aux études précédentes utilisant un solvant et un pressage mécanique, la présente étude a révélé des rendements inférieurs en huile de C. moschata. Bien que l'extraction par solvant ait été décrite comme la méthode d'extraction d'huile la plus efficace, extrayant jusqu'à 98 % des huiles des graines, il existe certains problèmes concernant les résidus de solvant et la pureté de l'huile produite [36]. De plus, le solvant utilisé dans le processus d'extraction a affecté le rendement de l'huile générée. L'extraction avec de l'hexane, de l'éther de pétrole, du benzène de pétrole, du cyclohexane, de l'éther isopropylique, de l'acétate d'éthyle, du tétrahydrofurane, du propane-2-ol et de l'acétone a donné 43,4 à 64,4 % [37,38]. Par conséquent, la pression à froid était préférable à l'extraction par solvant. Cependant, une presse à froid peut entraîner certaines complexités dans la phase initiale d'utilisation d'une presse à vis [39]. Par conséquent, l'extraction enzymatique aqueuse pourrait être une méthode d'extraction alternative car elle a donné une teneur plus élevée en huile de pépins de citrouille (36,0 pour cent) par rapport à l'huile pressée à froid (33,5 pour cent) [21]. Bien que le processus d'extraction enzymatique aqueuse soit plus compliqué que la presse à froid, il comprend un coût d'investissement relativement moins cher, une diminution continue du coût des préparations enzymatiques commerciales, un potentiel pour isoler simultanément des composants phytochimiques uniques et précieux, ainsi que le traitement la volonté généralisée de mise en œuvre de technologies vertes [21]. Des études préliminaires ont décrit que plusieurs enzymes telles que les cellulases, les pectinases, l'hémicellulase et la protéase ont souvent été utilisées pour détruire la structure de la paroi cellulaire des plantes afin d'améliorer l'extraction bioactive des plantes [16,17]. Par conséquent, nous avons conçu cette étude pour extraire l'huile de graines en utilisant un mélange d'enzymes contenant de la pectinase, de la cellulase et de la protéase (1:1:1) comme décrit précédemment par Kanopka et al. (2016), qui ont optimisé les conditions d'hydrolyse enzymatique pour obtenir le rendement le plus élevé en huile de pépins de courge [21]. En outre, cette méthode présente des alternatives plus sûres et plus respectueuses de l'environnement à l'extraction par solvant, appelée ici "extraction verte".

3.2. Composition chimique de l'huile de graines de citrouille

Pour l'analyse de la composition en acides gras, l'huile de pépins de courge utilisant l'extraction enzymatique aqueuse (PSO1 et PSO2) a été comparée et analysée avec l'huile de pépins de courge commerciale (COM1 et COM2) produite par extraction à froid. Les compositions en acides gras de PSO1, PSO2, COM1 et COM2 sont présentées dans le tableau 1. Tous les échantillons d'huile de pépins de citrouille étaient constitués d'acides gras polyinsaturés (PUFA), monoinsaturés (MUFA) et saturés. L'acide cis-linoléique (C18:2) était le composant principal de tous les échantillons d'huile. COM2 contenait la teneur la plus élevée en acides gras (51,74 %), suivi de COM1 (48,00 %), PSO1 (39,09 %) et PSO2 (37,63 %), respectivement. De même, l'acide cis-oléique (C18:1) était présent en pourcentage élevé, en particulier dans PSO2 (37,45 %), suivi de COM1 (33,39 %), PSO1 (31,22 %) et COM2 (28,64 %). Des acides gras saturés tels que l'acide palmitique (C16 :0) et l'acide stéarique (C18 :0) n'ont été trouvés qu'en petites quantités dans chacun des échantillons d'huile. Des traces d'autres AGPI, AGMI et acides gras saturés ont également été observées et identifiées.

Dans la littérature, l'acide linoléique est également connu sous le nom d'oméga-6, un acide gras essentiel qui ne peut pas être synthétisé par le corps humain, uniquement reçu par la consommation alimentaire. L'acide linoléique est un nutriment important pour les fonctions de santé chez l'homme, impliquant un précurseur des céramides qui est un composant majeur des membranes cellulaires, de la vitamine D et de diverses hormones [40,41]. Des études animales ont montré qu'une carence en acide linoléique peut provoquer une peau squameuse et des démangeaisons [23]. De plus, l'acide linoléique issu de l'huile végétale a favorisé la cicatrisation des plaies cutanées, tout en prévenant l'inflammation cutanée et l'acné [23]. De plus, l'acide oléique, ou oméga-9, a été bénéfique dans la prévention du cancer, des maladies auto-immunes et inflammatoires [42]. En effet, l'acide oléique a considérablement réduit la production d'oxyde nitrique au site de la plaie, ce qui a entraîné une fermeture plus rapide de la plaie [43]. Ces données confirment que l'huile de pépins de courge, qui enrichit l'acide linoléique (oméga-6) ​​et l'acide oléique (oméga-9), présente des avantages potentiels pour la santé.

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D'après nos découvertes, l'huile de pépins de courge (PSO1, PSO2, COM1 et COM2) était composée de nombreux acides gras, dont l'acide linoléique (C18 :2), l'acide oléique (C18 :2), l'acide palmitique (C16 :0) et l'acide stéarique (C18 :0) qui sont des composants communs trouvés dans l'huile de graines de citrouille [44]. L'acide linoléique (oméga-6) et les acides oléiques (oméga-9) dominaient dans tous les échantillons d'huile. La quantité la plus élevée d'acide linoléique était COM2, suivie de COM1, PSO1 et PSO2, respectivement. De plus, la quantité la plus élevée d'acide oléique était PSO2, suivie de COM1, PSO1 et COM2. Ces résultats expliquent que l'extraction enzymatique aqueuse de l'huile de pépins de courge avait un acide linoléique légèrement inférieur, mais pas d'acide oléique, à l'extraction par pression à froid. La raison de la plus faible teneur en acide linoléique dans les graines de citrouille issues de l'extraction enzymatique aqueuse que dans les échantillons d'huile commerciale était due à une différence dans le processus d'extraction. Des études antérieures ont trouvé des incohérences dans la quantité d'acides gras insaturés, en particulier l'acide oléique et l'acide linoléique, dans les huiles de graines de citrouille provenant d'extractions distinctes [39]. La teneur en acide oléique variait de 28,19 % dans l'huile de pépins de citrouille pressée à froid à 30,56 % dans l'huile de pépins de citrouille extraite au pentane, tandis que la teneur en acide linoléique variait de 43,86 % dans l'huile de pépins de citrouille extraite au pentane. à 46,67 pour cent dans l'huile de graines de citrouille pressée à froid [39]. Outre les différentes méthodes d'extraction, les solvants utilisés dans le processus d'extraction et la température pendant la maturation des graines ont également affecté la teneur en acide linoléique des graines de plantes. Une étude précédente a souligné que l'éther de pétrole produisait de l'huile de lin à faible teneur en linoléique (26,2 pour cent), tandis que le n-hexane donnait des résultats contradictoires avec une teneur en acide linoléique de 46,5 pour cent [45]. De plus, l'acide linoléique est inversement proportionnel à la température pendant la maturation des graines de tournesol [46].

De plus, une étude relative a découvert que la composition chimique en termes de composition en acides gras a révélé que les acides linoléique et oléique étaient présents à 47,45 % et 35 %, respectivement, dans l'huile de pépins de courge (C. maxima) extraite à l'aide d'éther diéthylique [47] . Selon Akin et al. [48] ]. Par conséquent, l'extraction enzymatique aqueuse dans cette étude a également obtenu des rendements inférieurs en acides gras que l'extraction par solvant et l'extraction par pression à froid mentionnées dans les études précédentes. Dans la comparaison des cultivars, nous avons constaté que PSO1 (C. moschata Duch. Ex Poir) présentait une quantité plus élevée d'acide linoléique que PSO2 (C. moschata ou citrouille japonaise). Diversement, PSO2 présentait une plus grande quantité d'acide oléique que PSO1. Il est important de noter que les variations des profils d'acides gras et des quantités d'huile de graines de citrouille dépendaient de l'origine de cultivars particuliers, des conditions climatiques et de la gestion post-récolte [49]. Outre les différences dans les profils d'acides gras des huiles de pépins de courge obtenues à partir de différentes méthodes d'extraction, les huiles issues de la technologie enzymatique aqueuse se sont révélées riches en phytostérols et en tocophérols [50]. Par conséquent, PSO1 et PSO2, qui ont été produits à partir de la méthode d'extraction verte, sont suggérés comme huiles de graines de citrouille alternatives pour d'autres applications.


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