Expression de synthase d'oxyde nitrique neuronal et de rénine dans les reins dysplasiques de jeunes chiens

ABSTRAIT:

La rénine et la synthase de l'oxyde nitrique neuronal dans le rein contrôlent les systèmes de rétroaction rénine-angiotensine et tubuloglomérulaire. La présente étude a examiné l'expression de la rénine et de l'oxyde nitrique synthase neuronale dans lereins dysplasiquesde trois jeunes chiens. L'immunoréactivité à la rénine, qui se produit dans les cellules juxtaglomérulaires et tubulaires dereins dysplasiques, ne différait pas de celle des reins normaux de jeunes chiens. Les cellules de la macula densa dans les reins normaux ont montré une immunoréactivité neuronale à l'oxyde nitrique synthase, mais celles des reins dysplasiques n'ont montré aucun signal apparent. Cette observation peut être corrélée avec les mécanismes pathologiques deinsuffisance rénalechez les jeunes chiens.

MOTS CLÉS: maladie rénale chronique, rein dysplasique, immunohistochimie, monoxyde d'azote synthase neuronale, rénine

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cistanche pour améliorer la fonction rénale

Insuffisance rénalese produit parfois chez les jeunes chiens. Dans de tels cas, l'examen histologique montre fréquemmentrein dysplasiquelésions. Cependant, les mécanismes physiopathologiques qui interviennent dansreins dysplasiquesdes chiens restent floues. Récemment, nous avons démontré l'atténuation de la cyclooxygénase (COX)-2 dansmaladies rénales chroniqueschez les jeunes chiens avecreins dysplasiquespar analyse immunohistochimique [19].

La COX-2 est une enzyme inflammatoire inductible qui est essentielle au développement normal des reins aux stades fœtal et néonatal [12, 15]. Après la naissance, la COX-2 est exprimée de manière constitutive dans le rein et se concentre dans la zone restreinte de la macula densa (MD) des membres épais ascendants [1, 4, 22]. Le MD est une région spécialisée adjacente au pôle vasculaire du glomérule. Il contrôle la sécrétion de rénine et le système de rétroaction tubuloglomérulaire (TGF). La COX-2 exprimée dans les cellules MD régule ces mécanismes [6, 8]. Outre la COX-2, la synthase neuronale de l'oxyde nitrique (nNOS), également exprimée dans les cellules MD, est connue pour être le principal régulateur du système TGF [3, 18]. Ces deux molécules, co-exprimées dans MD, sont connues pour interagir entre elles [2, 5, 9]. Dans la présente étude, nous avons étudié l'expression de la rénine et de la nNOS dansreins dysplasiquespar immunohistochimie pour déterminer si l'atténuation de COX-2 dansreins dysplasiquesinduit la perturbation du système rénine-angiotensine et du système TGF chez les jeunes chiens.

Les blocs de paraffine fixés au formol dereins dysplasiquesde jeunes chiens (n{{{{10}}}}), des reins normaux de jeunes chiens (n=3) et des reins normaux de chiens adultes (n=4) ont été les mêmes que celles utilisées dans notre étude précédente, dans laquelle l'histoire clinique et la préparation tissulaire ont été décrites précédemment [19]. L'étude a été approuvée par le Comité pour l'expérimentation animale de l'Université de Kagoshima, au Japon (VM15020). Des coupes ont été préparées avec une épaisseur de 3- µm et une analyse immunohistochimique de la rénine et de la nNOS a été réalisée selon les protocoles suivants : (1) déparaffinage ; (2) récupération d'antigène par chauffage par micro-ondes dans 10 mM de tampon citrate (pH 6,0) pour nNOS ; (3) incubation avec 3 % de H2O2 pendant 30 min ; (4) blocage avec 3 % d'albumine de sérum bovin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pour la rénine ou 0,25 % de caséine (Sigma-Aldrich) pour la nNOS, diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate, pendant 30 min ; (5) incubation pendant une nuit à 4 degrés avec une dilution 1:3,000 d'antisérum polyclonal de rénine anti-recombinant de lapin (fourni par le Dr Murakami, Université de Tsukuba, Japon) ou une dilution 1:3,{{31 }} dilution d'antisérum polyclonal de lapin anti-nNOS (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), dans une solution de blocage ; (6) incubation pendant 30 min à température ambiante avec un anticorps universel conjugué à la peroxydase (immunoglobuline (Ig) G anti-souris et IgG anti-lapin ; coloration simple MAX-PO [MULTI] ; Nichirei Biosciences, Tokyo, Japon) ; et (7) détection d'immunosignaux à l'aide du système 3,3'-diaminobenzidine (comprimé tampon 3,3'-diaminobenzidine ; Merck, Darmstadt, Allemagne). Pour les sections de contrôle négatif, une IgG de lapin normale (Lab Vision, Fremont, CA, USA) a été utilisée à la place de l'anticorps primaire.

L'analyse morphométrique randomisée de l'immunoréactivité de la rénine a été réalisée selon une méthode décrite précédemment [20]. En bref, l'indice de rénine a été défini comme le rapport du nombre total d'artérioles positives à la rénine sur le nombre total de glomérules et exprimé pour 100 glomérules. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide de la méthode de comparaison multiple de Bonferroni avec SPSS version 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Le diagnostic histopathologique a été réalisé selon les critères microscopiques de la dysplasie rénale canine par Picut et Lewis [14]. Les coupes histologiques des trois cas présentaient une différenciation asynchrone, ce qui indique la présence de lésions avec des glomérules fœtaux/immatures. Des modifications secondaires de sévérité variable telles que des lésions tubulaires, une fibrose interstitielle et des glomérules sclérosés ont été observées dans les tissus rénaux matures.

Dans lereins dysplasiques, des signaux d'immunoréactivité rénine ont été observés dans les cellules juxtaglomérulaires (JGC) (Fig. 1A) et des cellules tubulaires étaient situées dans les néphrons distaux (Fig. 1B). Dans certains glomérules, quelques cellules ont montré des signaux rénine-positifs près des pôles vasculaires (Fig. 1A). Dans les jeunes reins témoins, des signaux de rénine ont également été détectés dans les JGC et les tubules distaux, y compris les cellules MD. Dans les reins témoins adultes, les signaux rénine-positifs étaient limités aux JGC. Statistiquement, le nombre de zones rénine positives dans les reins dysplasiques n'a montré aucune différence significative par rapport à ceux des reins jeunes et adultes.

La stimulation de la production de rénine est connue pour jouer un rôle dans la signalisation COX-2, et des études antérieures ont démontré que l'activité et la concentration plasmatiques de la rénine étaient diminuées après l'administration de l'inhibiteur COX-2 ou dans l'inactivation de la COX -2 gène [10, 11]. Comme lereins dysplasiquesexaminés dans la présente étude n'ont montré aucune expression de la COX rénale -2 [19], une réduction des immunosignaux de la rénine dans les JGC a été initialement suspectée comme une possible anomalie physiologique des reins dysplasiques. Cependant, la présente analyse immunohistochimique n'a pas pu confirmer cette hypothèse et aucune réduction apparente de la rénine n'a été suggérée dans les JGC. Bien qu'un rôle physiologique de la rénine tubulaire n'ait pas été clarifié auparavant, la manipulation rénale du sodium pourrait être un rôle possible de la rénine tubulaire, puisque l'amélioration de l'expression de la rénine a été induite dans le néphron distal après une alimentation pauvre en sel chez le rat. [16], et les reins dysplasiques des chiens examinés dans la présente étude pourraient avoir conservé cette fonction tubulaire.

COX-2 est également important dans la régulation du système TGF, qui est important pour maintenir le taux de filtration glomérulaire. Une étude chez le rat utilisant la méthode de microponction a démontré la suppression de la réponse TGF après traitement avec un inhibiteur de la COX-2 [2]. Réponse TGF dansreins dysplasiquespourrait être atténuée en raison du manque d'expression rénale de COX-2. Cependant, aucune découverte pertinente n'a été rapportée auparavant. Dans le rein, la nNOS est exprimée dans les cellules MD et aide à réguler le système TGF [18].

Dans la présente analyse nNOS, aucun signal apparent n'a été détecté dans les régions MD de tous les cas (Fig. 2). Cette réduction de la nNOS a été considérée comme un événement étiopathogénique dans lereins dysplasiquesplutôt qu'un acquis après lainsuffisance rénaledes cas. En fait, notre étude précédente utilisant des rats OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty), comme modèle de diabète de type 2, a démontré que la nNOS était surexprimée dans le MD et ses cellules tubulaires environnantes au stade avancé de la néphropathie diabétique [21]. Dans la régulation du système TGF, la fonction de nNOS est similaire et interagit avec celle de COX-2. Certaines études ont suggéré que la nNOS se positionne en amont de la voie de signalisation et stimule l'expression de COX-2 [5, 9]. En revanche, d'autres études ont suggéré à l'inverse que COX-2 se positionne en amont de puis NOS [2, 13]. Indépendamment de la différence dans la voie de signalisation, l'absence d'immunosignaux nNOS dans les cellules MD peut déclencher la régulation à la baisse de l'expression rénale de COX -2 dansreins dysplasiques.

Quelques tubules ont montré des signaux positifs pour la nNOS dans deux cas. Dans le cas restant, de nombreux tubules dilatés et aplatis, probablement dans le néphron distal, affichaient des signaux positifs clairs (Fig. 3). Dans ce cas, avec des tubules nNOS-positifs proéminents,

le développement des tissus rénaux était le plus immature. Dans les reins normaux jeunes et adultes, des signaux nNOS-positifs ont été observés dans les membres ascendants épais, en particulier dans les cellules MD (Fig. 4). La distribution de la nNOS change au cours du développement du rein. Dans les reins en développement des porcs, la nNOS se distribue largement et est observée dans des parties du membre ascendant épais menant à la macula densa [17]. Chez le rat, la présence de nNOS dans le tubule distal en développement se rencontre déjà dans le corps en forme de S dès les premiers stades de la néphrogénèse [7]. Bien que la distribution de la nNOS dans les reins en développement des chiens n'ait pas été étudiée auparavant, il est possible que les signaux importants de la nNOS dans les tubules témoignent des tubules hautement immatures dans lerein dysplasiqueplutôt que les tubules matures endommagés.

En conclusion, l'expression de la rénine et de la nNOS dans lereins dysplasiquesde trois jeunes chiens ont fait l'objet d'une étude immunohistochimique dans la présente étude. Cela a démontré la détérioration de la nNOS dans les cellules MD avec une expression constante de la rénine. La réduction de l'expression de nNOS dans les cellules MD pourrait atténuer le système TGF des reins, et cela pourrait être l'un des mécanismes pathologiques sous-jacentsinsuffisance rénalechez les jeunes chiens avecreins dysplasiques.

CONFLITS D'INTÉRÊTS POTENTIELS

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

RECONNAISSANCE

Une partie de ce travail a été soutenue par une subvention d'aide à la recherche scientifique (numéro de subvention 19K06385) de la Japan Society for the Promotion of Science

Auteur

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4)et Osamu YAMATO1)

1)Laboratoire de pathologie clinique vétérinaire, Faculté mixte de médecine vétérinaire, Université de Kagoshima, Kagoshima 890-0065, Japon

2) Hôpital d'enseignement vétérinaire de l'Université de Kagoshima, Faculté mixte de médecine vétérinaire, Université de Kagoshima, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japon

3) Laboratoire d'histopathologie vétérinaire, Faculté mixte de médecine vétérinaire, Université de Kagoshima, Kagoshima 890-0065, Japon

4)Laboratoire d'anatomie vétérinaire, Faculté d'agriculture, Université d'Iwate, Morioka 020-8550, Japon

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