Extrait aqueux de Ganoderma Lucidum induisant le PHGPx pour inhiber les hydroperoxydes lipidiques membranaires et réguler le stress oxydatif basé sur le transcriptome animal unicellulaire

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Dans cette expérience, Tetrahymena thermophila a été utilisé comme matériau expérimental. T. thermophila est un cilié libre qui existe largement dans les écosystèmes aquatiques mondiaux et est similaire aux cellules métazoaires en termes de structure et de complexité fonctionnellel5. La découverte du ribozynnel6 et du télomérasel7 dans Tetrahymena a donné une impulsion majeure à la recherche sur les mécanismes anti-âge, qui a été récompensée par deux prix Nobell8. En raison de son cycle de croissance court, de sa culture facile et de son patrimoine génétique clair, T. thermophile pourrait fournir une double recherche in vivo et in vitro dans un même design expérimental. T. thermophila a été utilisé avec succès dans le criblage de médicaments et les mécanismes pharmacologiques20. Plus important encore, des informations sur l'évolution moléculaire de la famille des glutathion peroxydase de T. thermophila ont été découvertesl9-2. Le profil d'information de T.cistanche gengis khanthermophila GPX peuvent être obtenus à partir de la base de données Tetrahymena Functional Genomics (TetraFGD) (http://tfgd.ihb.ac.cn/) et TGD (http://ww.ciliate.org)22. Dix des douze GPX putatifs ont été identifiés comme phospholipide hydroperoxyde glutathion peroxydase (PHGPx) dans la base de données comparative du génome de Tetrahymena. PHP, un GPX dépendant du sélénium, peut spécifiquement réduire l'hydroperoxyde de phospholipides pour protéger les liposomes et les biofilms de lécithine des dommages oxydatifs23.PHGPxin T. thermophila a une masse moléculaire moyenne d'environ 21,7 kDa22, ce qui est similaire à la masse moléculaire (20-22 kDa) de la protéine monomère PHGPx décrite chez les mammifères24. De plus, un grand nombre de rapports ont montré que l'expression GPX de Tthermophila était quantitativement différente et dépendante de la source de stress (oxydant, inducteur d'apoptose ou métal)2122 et du temps d'exposition20-24

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En comparant les effets de l'extrait aqueux et des principaux monomères de G.lucidum sur la courbe de croissance et la densité maximale de T. thermophila, cette étude a obtenu le meilleur extrait de G. lucidum anti-âge. Le mécanisme anti-vieillissement de G. lucidum, en particulier la détermination du type d'action de la famille GPX, a été étudié aux niveaux moléculaire, cellulaire et individuel. Les résultats de cette étude devraient contribuer à l'application clinique des produits G. lucidum.

matériaux et méthodes

Extrait aqueux de Ganoderma lucidum et monomères. Se référant au rapport de Cuong25, 20 g de G. lucidum séché (Magasin spécialisé Changbai Mountain Senbao, Jilin) ​​ont été broyés et extraits dans 1000 mL de ddHO. L'extrait aqueux a été recueilli par centrifugation, concentré à 100 ml par séchage sous vide et stocké à -20 degré jusqu'à utilisation.

Le polysaccharide G. lucidum, l'acide ganoderique A, le Ganoderal A et l'ergostérol G. lucidum ont été achetés auprès de Chengdu Must Biotechnology Co., Ltd. Ces trois étalons ont été dissous dans du méthanol selon la conception uniforme et ajoutés au milieu SPP. Culture cellulaire et traitement médicamenteux. Tetrahymenathermophila (SB210) a été fourni par l'Institut d'hydrobiologie, Académie chinoise des sciences, Wuhan, IPR Chine. T. thermophila a été cultivé dans un incubateur à 28 degrés. Le milieu SPP contenait 2 % (p/v) de peptone de protéose,0,1 % d'extrait de levure (Oxoid),0,2 % de glucose et 0,003 % de séquestrène. Selon la conception uniforme (tableaux supplémentaires S1 et S2), extrait aqueux de G. lucidum,G. polysaccharide lucidum, acide ganodérique A, Ganoderal A et ergostérol G. lucidum ont été ajoutés au milieu de culture. Le groupe témoin a été remplacé par le même volume d'eau bidistillée, avec 3 échantillons parallèles dans chaque groupe. Après l'entrée dans la phase logarithmique, des échantillons ont été prélevés toutes les 2 h jusqu'à la phase de déclin. La densité de T. thermophila a été comptée par un tableau de numération des cellules sanguines et la relation entre la densité de T. thermophila et le temps a été établie.

Analyse transcriptionnelle. L'expérience a été réalisée avec une plaque à puits 24-, et chaque puits était composé de 900 μL de SPP. Dans le groupe expérimental, 100 μL d'extrait aqueux de G. lucidum à 200 mg/mL ont été ajoutés. Le groupe témoin a été traité avec 100 μL de ddH O à la place. Trois échantillons parallèles ont été placés dans chaque groupe.prolongation de la durée de vie du cistancheLe groupe témoin et le groupe expérimental étaient tous deux en phase logarithmique (20 h), et la phase de déclin (27h) a été recueillie pour l'analyse transcriptomique. Chaque groupe a été dupliqué biologiquement et tous les échantillons ont été soumis à un test de microréseau de transcription entière (Biomarker Technologies, Pékin, Chine). Le profil d'expression génique a été détecté par un Affymetrix 3'IVT Expression ArrayAfin de réduire l'effet de l'expression des gènes de valeur, RPKM supérieur ou égal à 5 ​​et FC (Fold Change) supérieur ou égal à 2 ont été utilisés comme critère de dépistage gènes différentiellement exprimés (DEG) KOBAS a été utilisé pour réaliser l'analyse de chemin de GeneOntology (GO) et de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG). La voie d'enrichissement a été déterminée par la valeur P-adj corrigée inférieure ou égale à 0,05. Les résultats du transcriptome ont été vérifiés à l'aide d'une PCR de transcription inverse quantitative (RT-qPCR) (méthode voir fichier supplémentaire). Ensuite, le réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) a été établi sur la base de la base de données STRING, et le gène central a été criblé en utilisant le CytoHubla pour identifier le nœud central dans le logiciel Cytoscape.

Coloration à l'argent et observation par microscopie électronique à transmission (MET). La procédure de coloration sil-ver était conforme à la méthode de Foissner26. thermophila a été observée au microscope à huile. L'ultrastructure de T. thermophila a été observée par MET. Les cellules traitées avec l'extrait aqueux de G.lucidum et le groupe témoin ont été recueillis par centrifugation à 600 xg pendant 2 min. Les cellules ont été préfixées dans du glutaraldéhyde à 2,5 % et maintenues à 4 degrés pendant 8 h. Les échantillons ont été lavés trois fois avec du PBS (pH 7,5), centrifugés à 3 000 x g pendant 5 min, puis fixés avec du tétraoxyde d'osmium à 1 % (4 h). Ensuite, la déshydratation a été effectuée en utilisant un gradient d'acétone de 15 % à 100 %. Ensuite, les cellules ont été intégrées dans une résine Embed 812 (TAAB) à faible viscosité. Après durcissement, des sections ultrafines (60-80 nm) ont été coupées par une trancheuse ultrafine. L'ultrastructure a été observée au microscope électronique à transmission (JEOL JEM-1010, Japon).

Détermination des dommages cellulaires. LROS intracellulaire a été détecté par la sonde fluorescente sensible diacétate de 2',7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA)27. L'activité du malondialdéhyde (MDA) a été déterminée par des kits commerciaux fournis par le Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Jiangsu, Chine). La méthode de détermination de la capacité à éliminer les radicaux hydroxyles (·OH) était celle décrite par Takemura28. La capacité de l'extrait aqueux de G. lucidum à éliminer les radicaux libres OH a été exprimée comme la densité optique du groupe expérimental moins la densité optique du groupe témoin.

Cistanche peut anti-âge

Activité PHGPx. Le rapport nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH)/NADP* et le rapport glutathion/disulfure de glutathion (GSH/GSSG) ont été déterminés à l'aide du kit de quantification NADP*/NADPH (S0179, Beyotime), du kit de dosage GSH/GSSG (S0053, Beyotime). Les tests ont été effectués selon le protocole du fabricant.

Résultats

Les effets de l'extrait aqueux de G.lucidum et des monomères de G.lucidum sur la croissance de T. ther-mochila. Comme les études précédentes7,G. Le polysaccharide lucidum était le composant principal de l'extrait aqueux de G. lucidum dans cette expérience selon l'identification au spectrophotomètre (Fig. S1 supplémentaire). Les substances actives de l'extrait aqueux de G. lucidum ont également été analysées par GC-MS. Le diagramme ionique total de l'extrait aqueux de G. lucidum a montré que ll composants existaient dans l'extrait aqueux (Fig. S2 supplémentaire). Parmi les composés de l'extrait aqueux de G.lucidum (Tableaux complémentaires S3 et S4),G. l'acide lucidum A, le Ganoderal A et l'ergostérol G. lucidum ont été sélectionnés en fonction de leur temps de rétention et de leur degré d'appariement.

Afin de comparer les effets de l'extrait aqueux de G. lucidum et de ces principaux monomères sur la croissance de T. thermophila, l'extrait aqueux de G. lucidum et la solution de monomères de G. lucidum ont été ajoutés au milieu de culture de T. thermophila. Les résultats ont été présentés sur la figure 1. La densité maximale du groupe témoin était de 6 × 104 cellules/mL à 24 h. La densité cellulaire du groupe extrait aqueux de G. lucidum de 12 à 20 h était presque la même que celle du groupe témoin, mais de 20 à 25 h, elle était significativement supérieure à la densité cellulaire du groupe témoin.cistanche nzSimultanément, la phase logarithmique a été prolongée de 1 h, la densité maximale était de 1,15 x 105 cellules/mL. Bien que la densité maximale du groupe polysaccharide G. lucidum soit supérieure à celle du groupe témoin de 9,7 × 104 cellules/mL, elle était inférieure à celle du groupe extrait aqueux G. lucidum. La densité maximale de G. lucidum acide A, Ganoderal A et G. lucidum ergostérol n'a pas dépassé celle du groupe témoin, ce qui a montré que les solutés alcooliques de ces monomères n'étaient pas propices à la croissance de T. thermophila. On pourrait en conclure que l'extrait aqueux de G. lucidum contenant une variété de substances actives peut favoriser la croissance de T. thermophila plus que ses monomères.

Effet anti-âge de l'extrait aqueux de G. lucidum. Avec l'augmentation du temps de culture, l'intensité lumineuse des ROS dans la phase de déclin (Fig. 2b) était supérieure à celle de la phase logarithmique (Fig. 2a). Après l'ajout de l'extrait aqueux de G. lucidum, bien que l'intensité de fluorescence de la phase de déclin (Fig. 2d) soit encore améliorée par rapport à celle de la phase logarithmique (Fig. 2c), elle était significativement inférieure à celle du groupe témoin. La teneur en MDA dans le groupe témoin était également plus élevée dans la phase de déclin que dans la phase logarithmique (Fig.2e). Pendant ce temps, la capacité de piégeage de OH dans la phase de déclin était inférieure à celle de la phase logarithmique (Fig. 2e). L'équilibre entre l'oxydation et la réduction a été perdu et le corps a vieilli. Après l'ajout de l'extrait aqueux de G. lucidum, la teneur en MDA était inférieure à celle du groupe témoin (colonne de gauche sur la figure 2e), et la quantité d'OH récupérée par les cellules en phase logarithmique et en phase de déclin était supérieure à celle du groupe témoin. groupe de contrôle (colonne de droite sur la figure 2e). La croissance de T[ thermophila peut être comparée au processus de vieillissement des organismes multicellulaires par ses dommages cellulaires. Au fur et à mesure que les ROS et les MDA s'accumulaient, la croissance était inhibée et la densité de T. thermophila était réduite. L'ajout d'extrait aqueux de G. lucidum pourrait maintenir l'équilibre redox de T. thermophila et obtenir des effets anti-âge.

Analyse des gènes différentiellement exprimés et vérification par RT-qPCR. Par rapport au groupe témoin, l'expression de 11 519 gènes dans la phase logarithmique de T. thermophila a changé de manière significative après l'ajout d'extrait aqueux de G. lucidum au SPP. Parmi eux, 6201 gènes étaient régulés positivement et 5318 gènes étaient régulés négativement.taille du pénis cistancheL'expression de 8772 gènes a changé de manière significative au cours de la phase de déclin, parmi lesquels 4721 gènes ont été régulés à la hausse et 4051 gènes ont été régulés à la baisse. Dans des études antérieures dans notre laboratoire, la

L'effet anti-âge de G.lucidum sur Stylonychia se reflétait dans l'indice antioxydant, donc 10 gènes (tableau supplémentaire S5) liés aux antioxydants ont été sélectionnés au hasard parmi les DEG, et l'exactitude des données ARN-seq a été vérifiée par RT- qPCR. Les modèles d'expression de ces 10 gènes dans la phase logarithmique et la phase de déclin étaient cohérents avec la tendance des données d'ARN-seq (Fig. S3 supplémentaire). Le résultat a indiqué que les données RNA-seq étaient fiables et pouvaient être utilisées pour une analyse ultérieure.

Enrichissement GO et analyses de la voie KEGG. Les DEG en phase logarithmique étaient impliqués dans 14 processus biologiques (BP) avec 6 types de fonctions moléculaires (MF) et ils existaient dans tous les composants cellulaires (CC) (Fig. 3a). Les DEG en phase de déclin étaient impliqués dans 12 BP avec 4 types de MF et ils existaient dans 12 CC. Le BP le plus impliqué dans les deux phases était le processus métabolique, le MF était la liaison et le CC était la membrane. Parmi le processus métabolique, la liaison et la membrane, les gènes régulés à la hausse représentaient 70 % dans la phase logarithmique (Fig. 3b) et 75 % dans la phase de déclin (Fig. 3c). Ces résultats montrent que l'extrait aqueux de G. lucidum pourrait favoriser le maintien de l'intégrité de la membrane cellulaire dans les deux phases.

Une analyse d'enrichissement de la voie KEGG a été effectuée pour analyser plus en détail les DEG entre les deux phases. Dans la phase logarithmique, 94 voies étaient concentrées, parmi lesquelles 68 % du total des gènes étaient impliqués dans le métabolisme. Dans la phase de déclin, 91 voies ont été enrichies, parmi lesquelles le métabolisme était toujours la voie la plus importante, représentant 68 % . Les 20 principales voies de la phase logarithmique (Fig. 3d) et de la phase de déclin (Fig. 3e) ont été utilisées pour dessiner un graphique à bulles et ont montré que, quelle que soit l'importance ou le nombre de gènes impliqués, l'effet de G.poudre de cistancheextrait aqueux de lucidum principalement axé sur la voie métabolique du glutathion. Dans la phase logarithmique, 38 gènes différentiellement exprimés ont été enrichis dans cette voie, ce qui représente 45 % . Dans la phase de déclin,43 gènes exprimés de manière différentielle ont été enrichis dans cette voie, représentant 50 % .

Les réseaux d'interaction protéine-protéine (PPI) des DEG. L'élucidation des DEG dans la voie du métabolisme du glutathion et la compréhension de leurs interactions avec d'autres protéines aideront à explorer davantage le mécanisme de régulation potentiel de l'extrait aqueux de G. lucidum. La phase logarithmique (Fig.4a) et les phases de déclin (Fig.4b) ont eu les effets les plus importants sur GPX1, GPX2, GPX7 et GPX11. Grâce à l'interrogation de la base de données TetraFGD, ces enzymes GPX appartenaient à PHGPx (tableau supplémentaire S6). Par conséquent, les enzymes antioxydantes, en particulier PHGPx, jouent un rôle important dans la promotion de la croissance de T. thermophila via l'induction de l'extrait aqueux de G. lucidum.

Vérification de l'activité et du fonctionnement du GPS. L'activité de PHGPx fait référence au taux de diminution de l'absorption du NADPH2". La valeur NADPH/NADP* dans la phase de déclin du groupe témoin était inférieure à celle de la phase logarithmique (Fig. 5a). Le résultat suggère que l'activité de PHGPx a diminué avec l'augmentation du temps de culture.Après l'ajout de l'extrait aqueux de G. lucidum, la valeur NADPH/NADP plus dans la phase de déclin était encore inférieure à celle de la phase logarithmique, mais supérieure aux deux phases du groupe témoin.Ce résultat indique que l'extrait aqueux de G.lucidum pourrait favoriser l'activité de PHGPx.

Le PHP peut spécifiquement catalyser la réduction de l'hydroperoxyde de phospholipides par le glutathion réduit (GSH), de manière à convertir efficacement le peroxyde de lipide toxique (PL-PUFA-OOH) en acides gras polyinsaturés non toxiques (PL-PUFA-OH)30. Le changement du rapport GSH/GSSH peut refléter le changement de PL-PUFA-OOH et PL-PUFA-OH En raison de la diminution de l'activité PHGPx (Fig. 5a), le rapport GSH/GSSH dans le groupe témoin a également diminué avec l'augmentation du temps de culture (Fig. 5b). Cependant, après l'ajout de l'extrait aqueux de G.lucidum, le rapport GSH/GSSH a augmenté dans la phase logarithmique et la phase de déclin. Le PL-PUFA-OOH toxique intracellulaire dans le groupe expérimental a été transformé en PL-PUFA-OH non toxique, qui était supérieur à celui du groupe témoin. L'observation de la morphologie microscopique et de l'ultrastructure. L'effet protecteur de l'extrait aqueux de G. Luci-dum sur la membrane a été visualisé par coloration à l'argent ammoniacal et TEM. En comparant la phase logarithmique du groupe témoin (Fig. 6a) et la phase de déclin du groupe témoin (Fig. 6c), il a été constaté que la morphologie cellulaire de T. thermophila était sérieusement déformée avec l'allongement du temps de culture, et le noyau était flou, indiquant que les cellules semblaient vieillir. Cependant, dans le groupe d'extraits aqueux de G.lucidum, la morphologie et l'intégrité des cellules étaient bien protégées dans la phase logarithmique (Fig. 6e) et la phase de déclin (Fig. 6g). Des changements ultrastructuraux dans les cellules ont été observés par TEM. La crête et le contour des mitochondries étaient flous dans la phase de déclin (Fig. 6d) par rapport à la phase logarithmique (Fig.6b) dans le groupe témoin. La dégradation des mitochondries a augmenté avec l'extension du temps de culture. L'ajout d'extrait aqueux de G. lucidum a amélioré la morphologie des mitochondries en phase logarithmique (Fig. 6f) et en phase de déclin (Fig. 6h). L'extrait aqueux de G. lucidum garantissait la fonction des mitochondries, étroitement liée à l'intégrité de la membrane. Il convient de noter que dans la phase logarithmique, les mitochondries du groupe expérimental ont montré des changements morphologiques (Fig. 6f, h), mais l'intégrité de la membrane n'a pas été affectée.

Discussion

L'application d'extraits de G.lucidum a une longue histoire à la fois dans la médecine traditionnelle chinoise et en Asie de l'Est. Un grand nombre d'études ont montré leur efficacité. Des rapports antérieurs ont révélé que l'extrait aqueux de G.lucidum contenait non seulement des polysaccharides de G. lucidum, mais également des triterpénoïdes de Glucidum. Selon des rapports antérieurs, l'acide de Ganoderma, l'aldéhyde de Ganoderma et l'ergostérol de Ganoderma sont les principaux ingrédients du triterpène 3 de G. lucidum. Ils agissent avec différentes fonctions de réparation pour les cellules (tableau 1). L'extrait aqueux de Ganoderma lucidum contient une variété de substances actives, intégrant les fonctions des quatre autres substances actives, qui peuvent non seulement résister à l'oxydation mais aussi maintenir l'intégrité de la membrane. Dans cette étude,

la promotion de la croissance de l'extrait aqueux de G. lucidum sur T. thermophila a vérifié cette relation d'inclusion. Grâce à l'analyse de l'extrait aqueux de G. lucidum par chromatographie en flux ionique total (Fig. S2 supplémentaire), il a été constaté que le temps de dissolution de diverses substances actives était différent. Ainsi, l'extrait aqueux de G. lucidum devient un solvant organique complexe avec l'allongement du temps d'ébullition. Nous pensons que les substances actives de l'extrait aqueux de G.lucidum peuvent agir à des moments différents, résultant en une synergie. Cela devrait faire l'objet d'une étude plus approfondie à l'avenir.

L'analyse du transcriptome de T. thermophila a exploré l'effet de l'extrait aqueux de G. lucidum sur l'expression des gènes pendant la croissance. Après traitement avec l'extrait aqueux de G. lucidum, la PHGPx est apparue comme une influence clé sur la densité cellulaire et le temps de génération. Ce résultat a confirmé que l'extrait aqueux de G.lucidum agissait sur le type dépendant du sélénium de la famille GPX. La PHP est une séléno-protéine multifonctionnelle largement distribuée dans l'organisme qui peut non seulement participer aux réactions antioxydantes mais également réduire directement les lipides de la membrane pour protéger l'intégrité du système membranaire40. Comparé aux autres GPX, PHGPx a un volume plus petit et une plus grande hydrophobicité. De nombreux rapports ont démontré que la surexpression de PHGPx dans les cellules peut résister à la réponse cellulaire aux dommages de peroxydation fl endogènes (par exemple, le vieillissement) et exogènes (par exemple, environnementaux) 2-45. PHP est la seule enzyme capable de réduire directement le PL-PUFA- OOH de la membrane en composés hydroxylés correspondants, permettant ainsi l'arrêt de la peroxydation et protégeant la membrane biologique des dommages de la peroxydation4647. L'augmentation de la teneur en PL-PUFA-OOH était à l'origine de l'endommagement de la membrane cellulaire dans le groupe témoin pendant la phase de déclin, qui est devenue un cercle vicieux et une sénescence cellulaire accélérée. Dans cette étude, la teneur en ROS et MDA (Fig.2) de T.thermophila dans le groupe témoin a augmenté avec l'augmentation du temps de culture. La membrane est apparue déformation grave dans la phase de déclin grâce à l'observation morphologique. Cependant, lorsque l'extrait aqueux de G. lucidun a été ajouté, l'expression de PHGPx a été régulée à la hausse. Ainsi, le PL-PUFA-OOH sur la membrane a été transformé en PL-PUFA-OH non toxique, et la stabilité de la structure de la membrane est améliorée à la fois dans la phase logarithmique et la phase de déclin. D'après l'observation de la membrane par coloration à l'argent ammoniacal et TEM, on pourrait conclure que l'extrait aqueux de G.lucidum a pénétré la membrane cellulaire au cours du processus de croissance. Cet effet réparateur sur la membrane cellulaire pourrait inciter les substances actives de l'extrait aqueux de G. lucidum à pénétrer dans le cytoplasme et à protéger la structure membranaire du noyau et des mitochondries pour favoriser le métabolisme de T. thermophila et obtenir des effets anti-âge. Comme le montrent les résultats de l'enrichissement de lKEGG, un grand nombre de gènes différentiels sont concentrés dans les voies métaboliques. Ces résultats indiquent que l'extrait aqueux de G. lucidum est bénéfique pour le métabolisme du glutathion et l'élimination des peroxydes toxiques produits par le vieillissement cellulaire.

En général, l'extrait aqueux de G. lucidum a favorisé l'expression de l'enzyme PHGPx dépendante du sélénium dans la famille GPX. L'amélioration de l'activité PHGPx pourrait non seulement réduire la réponse au stress oxydatif in vivo, mais également réduire spécifiquement et efficacement le dépôt lipidique de la membrane biologique et maintenir l'intégrité de la membrane (Fig.7). Par conséquent, les substances actives de l'extrait aqueux de G. lucidum pénètrent dans les cellules à travers la membrane intacte et favorisent leur métabolisme. Cela a créé un cercle vertueux pour obtenir l'effet anti-âge.

Cet article est extrait de Scientifc Reports|(2022) 12:3139|https://doi.org/10.1038/s41598-022-06985-z