La gossypitrine, un flavonoïde naturel, atténue les dommages neuronaux et mitochondriaux induits par le fer Partie 1

S'il vous plaît contactezoscar.xiao@wecistanche.compour plus d'informations

Résumé:La perturbation de l'homéostasie du fer est un facteur important dans la perte de la fonction mitochondriale dans les cellules neurales, conduisant à la neurodégénérescence. Ici, nous avons évalué l'action protectrice de la gossypitrine (Gos), un flavonoïde naturel, sur les dommages aux cellules neuronales induits par le fer à l'aide de cellules HT -22 de l'hippocampe de souris et de mitochondries isolées de cerveaux de rats. Gos a pu sauver les cellules HT22 des dommages induits par 100 uM Fe()-citrate (EC50 8.6 uM). Cette protection était liée à la prévention de la dissipation potentielle de la membrane mitochondriale induite par le fer et de l'épuisement de l'ATP. Dans les mitochondries isolées, Gos (50 uM) a induit une protection presque complète contre le gonflement mitochondrial induit par le fer, la perte du potentiel transmembranaire mitochondrial et l'épuisement de l'ATP. Gos a également empêché la peroxydation des lipides mitochondriaux induite par le citrate de Fe (Ⅱ) avec une valeur ICs0 （12,45 μM） environ neuf fois inférieure à celle induite par l'hydroperoxyde de tert-butyleoxydation. De plus, le flavonoïde a été efficace pour inhiber la dégradation du 2-désoxyribose 15 et 1,5 mM. Il a également diminué la concentration de Fe(II) avec le temps, tout en augmentant le taux de consommation d'O2 et en altérant la réduction de Fe(II) par l'ascorbate. Les complexes Gos-Fe(I) ont été détectés par spectroscopies UV-VIS et IR, avec une stoechiométrie Gos-fer apparente de 2:1. Les résultats suggèrent que le Gos n'agit généralement pas comme un antioxydant classique, mais qu'il affecte directement le fer, en le maintenant sous sa forme ferrique après stimulation de l'oxydation du Fe(II). Les ions métalliques seraient donc incapables de participer à une réaction de type Fenton et à la phase de propagation de la peroxydation lipidique. Par conséquent, Gos pourrait être utilisé pour traiter les maladies neuronales associées au stress oxydatif induit par le fer et aux dommages mitochondriaux.

Veuillez cliquer ici pour en savoir plus

Mots clés: gossypitrine; le fer; Cellules HT-22 ; mitochondries;neurodégénérescence; neuroprotection

1. Introduction

Le fer est un cofacteur essentiel dans de nombreux processus biologiques cruciaux tels que la synthèse et la restauration de l'ADN, le transport de l'oxygène, la respiration cellulaire, le métabolisme xénobiotique et la synthèse hormonale [1. Cependant, à des niveaux intracellulaires élevés, il peut augmenter les espèces oxygénées réactives cellulaires avec une modification des potentiels redox cellulaires [2,3]. La dyshoméostasie du fer est observée dans presque toutes les affections neurologiques telles que la maladie de Parkinson (MP), la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Huntington (HD), la sclérose en plaques, l'ataxie de Friedreich, l'épilepsie, le syndrome des jambes sans repos et les accidents vasculaires cérébraux [4,5]. En particulier, dans l'hémorragie intracérébrale, où il y a une rupture des microvasculatures et où le sang libéré produit une exposition au fer dérivé du sang des cellules neurales, les principaux mécanismes de neurodégénérescence sont la production de ROS induite par le fer et l'hème, l'inflammation et l'excitotoxicité [6 ,sept]. Des modèles expérimentaux in vitro et in vivo d'hémorragie cérébrale ont montré la présence de ferroptose, une forme de nécrose régulée dépendante du fer [8]. En outre, de plus en plus de preuves suggèrent que la perturbation de l'homéostasie du fer est essentielle à la perte de la fonction mitochondriale dans les cellules neurales [9,10], ce qui pourrait, à son tour, conduire à la neurodégénérescence [11-14. Une relation a été récemment rapportée entre la forme précoce de la maladie de Parkinson avec un dérèglement du métabolisme du fer et une atteinte mitochondriale [15]. La coexistence de quantités relativement élevées de fer et de ROS dans les compartiments mitochondriaux rend cet organite sensible aux dommages médiés par les radicaux hydroxyles. Les agents pharmacologiques ciblant la régulation du fer dans le cerveau et la déficience mitochondriale médiée par le fer peuvent donc être thérapeutiquement utiles contre la neurodégénérescence. Plusieurs agents chélateurs du fer ont montré des actions neuroprotectrices dans différents modèles expérimentaux [16-19]. D'autre part, de nombreux rapports ont été publiés sur le potentiel neuroprotecteur des polyphénols naturels en raison de leurs actions antioxydantes basées sur une combinaison d'activités de chélation du fer et de piégeage des radicaux libres [20,21]. Notre groupe a observé que les polyphénols contenant du catéchol comme la mangiférine, la guttiférone-A et la rapanone interagissent avec le fer, à la fois in vitro et in vivo, annulant ainsi son rôle catalytique dans la promotion des ROS [22-28]. Nous avons également récemment signalé les puissants effets antioxydants de la gossypitrine (Gos), un flavonoïde naturel (Figure 1), indiquant son utilisation potentielle en tant qu'agent neuroprotecteur [29]. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans ces effets antioxydants sont peu connus. La présence d'un système cyclique planaire à six membres avec délocalisation des électrons, une fraction catéchol et trois autres groupes hydroxyle aromatiques (dont deux adjacents à un groupe carbonyle), suggèrent fortement que cette molécule pourrait agir comme agent chélateur du fer puisque ces sont des caractéristiques structurelles qui favorisent la chélation du fer par les flavonoïdes 30]. Par conséquent, le but de cette étude est d'évaluer la capacité de Gos à protéger HT-22cellules neuronaleset des mitochondries cérébrales de rat isolées à partir dedommages oxydatifs. D'autres études dans des systèmes sans cellules/mitochondries ont été menées pour caractériser davantage la nature de l'interaction Gos-fer.

2. Résultats

2.1. Gos sauve les cellules HT-22 de la mort cellulaire induite par le Fe(I)

Fe（II）（100 μM） a réduit la survie des cellules HT-22 à 17,4 % après 24 h d'exposition, comme estimé par le test MTT. Gos a empêché la mort cellulaire de l'hippocampe de manière dose-dépendante. L'EC50 était de 8,64 ± 1,58 μM (Figure 2A, encadré). Une protection cellulaire complète a été observée avec 100 μM de Gos était plus efficace que Trolox (500 uM), l'antioxydant hydrosoluble bien connu, qui a empêché la mort cellulaire de 74 %.

L'exposition HT -22 au fer pendant 2 h (avant l'exécution de la mort cellulaire) a induit la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale, telle qu'estimée par la rétention de rhodamine 123 dans les organites (Figure 2B) et l'épuisement de l'ATP (Figure 2C ). Cela suggère une association possible entre les effets toxiques médiés par le fer sur les mitochondries et la viabilité cellulaire. Gos a empêché l'altération dose-dépendante induite par le fer des mitochondries, en suivant les schémas de viabilité des neurones qui ont montré qu'il pouvait empêcher la mort des cellules HT -22 induite par le fer grâce à la protection mitochondriale.

Figure 2. Protection de Gos contre les dommages cellulaires neuronaux induits par le fer. Effets de Gos sur la survie des neurones hippocampiques de souris HT -22 (A), le potentiel de membrane mitochondriale cellulaire (B) et les niveaux d'ATP cellulaire (C). Gos（0-100 μM） ou Trolox（500 μM） ont été co-incubés pendant 24 h （viabilité） ou 2h （potentiel de membrane mitochondriale et taux d'ATP） avec 100 μM de FeCl2/ 1 mM de citrate. Les conditions de test sont décrites dans la section 4. Les cellules témoins endommagées (sans Gos) contenaient du DMSO (0,001 pour cent) plus le mélange fer-citrate. Les résultats sont exprimés en pourcentage de mort cellulaire par rapport au témoin non endommagé (contenant 0,001 % de DMSO comme véhicule). Les valeurs sont les moyennes ± SD de trois expériences différentes. Différents symboles indiquent des différences statistiques à p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Cistanche peut améliorer l'immunité

2.2. Gos Rescues Rat-Brain Mitochondria from Iron-Induced Mitochondrial Lipoperoxidation Brain mitochondria incubated with Fe（）-citrate （50 μM） underwent a marked lipoperoxidation expressed by an increase in the formation of the thiobarbituric acid reactive substance(Figure 3A). Gos inhibited the iron-mediated mitochondrial lipid peroxidation in a concentration-dependent manner （IC50 value of 12.45±1.24 μM） （Figure 3A, inset）. The effects of Gos on tert-butyl hydroperoxide（300 μM）-induced mitochondrial lipid peroxidation（IC50 value>100 μM） montre qu'il est plus efficace pour prévenir la peroxydation lipidique induite par le fer que la peroxydation lipidique induite par le peroxyle, suggérant sa capacité à agir directement sur le fer (Figure 3B).

Figure 3. Gos inhibe la formation de malondialdéhyde dans les mitochondries, induite par 50 uM de Fe()-citrate (A) ou 300 μM d'hydroperoxyde de tert-butyle (B). Des mitochondries de cerveau de rat (1 mg/mL) ont été incubées dans un milieu réactionnel contenant 125 mM de saccharose, 65 mM de KCl, 10 mM de tampon HEPES (pH 7,4), 2 mM de succinate et 2,5 uM de roténone, avec ou sans Gos(1-50 uM). Les expériences ont commencé par l'ajout de 50 μM Fe（II） ou 300 μM d'hydroperoxyde de tert-butyle, à l'exception du contrôle non endommagé (barres grises). La période d'incubation était de 20 min à 28 °C. Les valeurs sont les moyennes ± SD (n=6). Différents symboles indiquent des différences statistiques à p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos empêche la dissipation du gonflement mitochondrial induite par le fer et l'épuisement de l'ATP

La figure 4A montre que le complexe 50 μM Fe（I）-citrate induit un gonflement mitochondrial, exprimé par une diminution de l'absorbance à 540 nm (ligne f par rapport à la ligne a). Il était associé à une dépolarisation △Y spontanée et complète (figure 4B, lignef par rapport à la ligne a) et à un appauvrissement en ATP (figure 4C, colonne Fe()/citrate). Gos a inhibé le processus de gonflement induit par le fer et la dissipation AY d'une manière dépendante de la concentration (figure 4A, lignes B be). Les valeurs d'absorbance (moyenne ± SD à 7 min) du panneau A étaient : 0.482±0.013 (ligne a), 0.459± { {23}}.011 (ligne b),0.445± 0.007 (ligne c),0.435± 0.015( ligne d), 0,360 ± 0,011 (ligne e) et 0,338 ± 0,012 (ligne f). Les valeurs de fluorescence du panneau B (moyenne ± SD à 7 min) étaient de 15,03 ± 1,71 (ligne a), 19,41 ± 2,07 (ligne b), 22,29 ± 2,58 (ligne c), 45,505 ± 4,47 (ligne d), 118,468 ± 5,76 (ligne e), et 146.201±5.83 (ligne f). Des différences statistiquement significatives ont été trouvées entre la ligne f et les autres lignes, à p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Figure 4. (A) Induction de transition de perméabilité mitochondriale, (B) perte de potentiel de membrane mitochondriale (AH) et (C) réduction des niveaux d'ATP induite par 50 μM Fe (II)-citrate. A a été estimé à l'aide de la sonde de fluorescence safranine （5 uM）. Les effets inhibiteurs de Gos 50, 25, 10 et 1 μM sont indiqués dans les lignes (b), (c), (d) et (e), respectivement. Les lignes (a) et (f) représentent respectivement les commandes non endommagées (sans fer) et les commandes endommagées (sans Gos). Des mitochondries cérébrales de rat (RBM-0.5 mg/mL), du Fe（II） et du CCCP 1 μM ont été ajoutés aux endroits indiqués par les flèches. Différents symboles dans le graphique (C) indiquent des différences statistiques atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos induit l'auto-oxydation du Fe(II)-citrate et la consommation d'O

Gos a diminué la concentration de Fe() (1- min de préincubation) dans un milieu réactionnel contenant 2 mM de citrate (sans mitochondries) de manière dose-dépendante (figure 5A, cercles noirs). Une période de préincubation de 5- min (Figure 5A, cases rouges) a encore plus diminué la concentration de Fe(II). Gos a également augmenté le taux de consommation d'O2, probablement en raison de l'oxydation de Fe(ll) en Fe(ⅡII)(Figure 5B,C). Ces résultats suggèrent que Gos pourrait éliminer Fe(II) du complexe de citrate et l'oxyder en forme ferrique dans un processus qui nécessite O2 comme accepteur d'électrons. En conséquence, Gos pourrait entraver la formation de radicaux "OH en inactivant le Fe (Il) nécessaire à la réaction de type Fenton-Haber-Weiss, qui peut initier la peroxydation lipidique de la membrane mitochondriale.

Figure 5. (A)Gos stimule l'auto-oxydation de Fe(Ⅲl) en l'absence de mitochondries cérébrales de rat dans un milieu standard additionné de citrate 1 mM et de 5 mM1,10-phénanthroline.1,10-phénanthroline a été ajouté 1 ou 5 min après la période d'incubation de Gos-Fe(II), et les absorbances ont été lues à 510 nm. Les valeurs sont la moyenne de trois déterminations. * différence statistique à p<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos,="" （c）="" 30μm="" gos,="" （d）50="" μm="" gos,and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Cet article est extrait de Molecules 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules