La spectrométrie de masse en tandem à haute résolution identifie un schéma ganglioside particulier dans l'insuffisance rénale diabétique précoce chez les patients diabétiques de type 2

Abstrait:

Compte tenu des informations précieuses fournies par les glycosphingolipidesmarqueurs moléculaireset les données limitées disponibles pour leur détection et leur caractérisation chez les patients souffrant deMaladie rénale diabétique de type 2(DKD), nous avons développé et mis en œuvre une méthode supérieure basée sur la spectrométrie de masse (MS) à haute résolution (HR) et la MS tandem (MS/MS) pour la détermination des gangliosides dans l'urine dePatients DKD. Cette étude s'est concentrée sur : (i) le test de la faisabilité et des performances des HR MS et MS/MS en matière de cartographie etséquençage des gangliosides rénaux dans le diabète de type 2les patients; (ii) détermination des changements dans leganglioside urinaire de DKDpatients dansdifférents stades de la maladie-normo-, micro- et macroalbuminurie-dans un test comparatif avec des contrôles sains. En raison de la haute résolution et de la précision de masse, le dépistage comparatif par MS a révélé que l'état de sialylation des composants gangliosides ; leur modification par O-acétyle, CH3COO−, O-fucosyl et O-GalNAc ; ainsi que la composition du céramide représentent des marqueurs possibles pour la détection précoce de la DKD, l'évaluation de la progression de la maladie et le traitement de suivi. De plus, une enquête structurelle par MS/MS a démontré que GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18 :0) et GT1b(d18:1/18 :{{ 23}}) sont associés à la macroalbuminurie, ce qui mérite une étude plus approfondie en ce qui concerne leur rôle dans la DKD.

Mots clés : nanoélectrospray ; spectrométrie de masse tandem haute résolution ; dépistage; analyse de fragmentation ; maladie rénale diabétique; biomarqueurs gangliosides

1. Introduction

Le diabète sucré (DM) de type 2 reste un défi thérapeutique avec une prévalence mondiale en constante augmentation, malgré les avancées scientifiques dans le domaine. Associé à des dommages macrovasculaires et microvasculaires dévastateurs à long terme, le diabète de type 2 entraîne une mortalité accrue. La maladie rénale diabétique (DKD) est la cause la plus fréquente d'insuffisance rénale terminale (IRT) dans les pays développés et en développement [1,2]. Ainsi, la détection précoce du DKD et la prise en charge optimale du diabète de type 2 sont cruciales afin de réduire les complications, la morbidité et la mortalité. Actuellement, le diagnostic et la progression de la DKD reposent sur la mesure de l'albuminurie et la réduction constante du débit de filtration glomérulaire (DFGe), deux paramètres montrant une prédiction modeste de l'état rénal futur. L'histoire naturelle de la DKD comprend plusieurs stades cliniques, dont les suivants : une hyperfiltration glomérulaire précoce, la survenue d'une microalbuminurie ou d'une macroalbuminurie, une diminution du débit de filtration glomérulaire et une IRT. Cependant, des recherches récentes considèrent l’albuminurie comme un marqueur d’aggravation de l’état [3].

Au cours de la dernière décennie, un intérêt particulier a été manifesté pour le concept subtélocentrique, selon lequel le tubule proximal et le compartiment tubulo-interstitiel pourraient jouer un rôle essentiel dans l'initiation et la progression de la DKD [4-6]. Dans ce contexte, le développement de biomarqueurs glycomiques pronostiques et prédictifs fait l’objet d’une attention croissante et est devenu l’objet de nombreux groupes de recherche au fil des années [7-11].

Les gangliosides représentent une classe particulière de glycosphingolipides à structure complexe identifiée dans tous les tissus et fluides corporels et particulièrement abondante dans le système nerveux central (SNC) [12]. En tant que constituants essentiels des membranes bicouches des cellules neuronales, les gangliosides jouent un rôle essentiel dans le développement, la maturation et le vieillissement du cerveau, en assurant la médiation de l'adhésion, de l'activation, de la prolifération, de la motilité et de la croissance des cellules. Les gangliosides sont constitués d'un céramide de composition différente par rapport à la base sphingoïde, de résidus d'acides gras enracinés dans la couche externe de la membrane et d'une chaîne oligosaccharidique sialylée recouvrant la membrane et participant à des interactions spécifiques et essentielles avec d'autres molécules du milieu environnant. Grâce au renouvellement normal de la surface cellulaire, appelé « excrétion de la surface cellulaire », les gangliosides sont libérés, dans une certaine mesure, dans l'espace intercellulaire.

Parce que l'expression, la distribution et la structure des gangliosides sont connues pour être spécifiques au type de cellule et de tissu et pour varier au cours du développement, de la maturation, du vieillissement et, surtout, dans les états pathologiques [12], les gangliosides sont considérés comme parmi les plus précieux. marqueurs diagnostiques et agents thérapeutiques potentiels.

Plusieurs méthodes utilisant des fragments de sérum ou de biopsie rénale ont été appliquées pour l'identification des gangliosides rénaux chez les patients atteints de diabète de type 2, telles que l'immunocoloration en couche mince [7,8], la chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC) [9], la spectrophotométrie [10]. ] et la spectrométrie de masse (MS) [11].

Compte tenu des informations précieuses que peuvent fournir les gangliosides en tant que marqueurs moléculaires du tissu neuronal [12] et des données limitées disponibles jusqu'à présent dans la détection et la caractérisation des glycosphingolipides dans l'urine des patients atteints de DKD, nous avons développé et mis en œuvre une méthode supérieure basée sur sur la MS haute résolution (HR) par nanoélectrospray (nanoESI) pour la détermination des gangliosides dans l'urine des patients diabétiques. Cette option pour HR MS a été guidée par les avantages offerts par cette méthode dans l’analyse des mélanges complexes de gangliosides extraits de l’urine humaine. Le pouvoir de résolution élevé de l'instrument : (i) permet la détection d'ions de valeurs m/z proches, qui autrement ne pourraient pas être discriminés dans un échantillon hétérogène à plusieurs composants contenant des espèces de différentes longueurs et architectures de la chaîne glycane et des compositions différentes du céramide; (ii) élimine fondamentalement le besoin de séparation du mélange par des méthodes de chromatographie liquide ou d'électrophorèse avant l'analyse MS ; (iii) fournit une précision de masse élevée, ce qui augmente considérablement la fiabilité de l'identification structurelle ; et (iv) offre non seulement un meilleur aperçu de la complexité du gangliosidome associé au DM, mais également des données sur les espèces ayant un rôle potentiel de biomarqueur, basées sur la confiance élevée dans la détermination de la masse des ions moléculaires et fragmentaires.

Cette étude pilote, ayant pour objectif de caractériser les gangliosides urinaires ayant un rôle de biomarqueur dans ladiagnostic précoce de DKD, visait à : (a) tester la faisabilité et les performances de la MS HR et de la MS tandem (MS/MS) par dissociation induite par collision (HCD) à haute énergie dans la cartographie des gangliosides rénaux chez les patients atteints de diabète de type 2 ; (b) détermination des changements dans l'expression de mélanges de gangliosides natifs à partir des échantillons d'urine de patients atteints de diabète de type 2 dans un test comparatif avec des contrôles sains et caractérisation des biomarqueurs découverts. À cette fin, nous avons optimisé une plate-forme bioanalytique moderne basée sur nanoESI HR MS sur un instrument Orbitrap réglé pour fonctionner en mode ions négatifs à la fois en criblage MS et en fragmentation MS/MS pour une analyse structurelle détaillée.

2. Résultats et discussions

2.1. Criblage comparatif des échantillons par nanoESI HR MS

Les échantillons de gangliosides A1, A2, A3 et C ont été perfusés par nanoESI l'un après l'autre dans un Orbitrap MS et criblés en mode ions négatifs dans des conditions instrumentales identiques. Dans chaque cas, le signal de courant ionique total (TIC) a été acquis pendant 2 minutes, générant des spectres à partir de l'accumulation de 100 balayages. En raison de la sensibilité élevée de la méthode, même dans des conditions de temps limitées, les spectres de masse acquis présentaient un rapport signal/bruit élevé et un riche motif d'ions moléculaires.

L'évaluation des données cartographiques générées dans les mêmes conditions a révélé des différences significatives dans le nombre et le type de composants gangliosides exprimés dans les échantillons A1, A3 et C, alors qu'aucune différence entre les échantillons A1 et A2 n'a été observée. Ces résultats sont résumés dans le tableau 1, qui répertorie de manière comparative les structures identifiées dans les mélanges natifs A1, A3 et C, ainsi que les valeurs expérimentales m/zexp des signaux détectés et les valeurs théoriques m/ztheor correspondant aux structures proposées.

La haute résolution et la précision de masse de la plate-forme MS utilisée ont amélioré la discrimination et l'identification sur la base de mesures de masse précises de pas moins de 37 composants distincts de gangliosides et de fucogangliosides urinaires dans les trois échantillons. Les espèces découvertes appartiennent à 15 classes différentes, y compris les modifications de la chaîne principale de glycanes (tableau 2), et se sont vu attribuer une excellente précision de masse moyenne de 4 ppm.

Une évaluation détaillée des structures du tableau 1 a révélé que parmi tous les échantillons, le mélange A3, qui correspond à la macroalbuminurie (donc à un stade avancé de DKD), contient le plus grand nombre de composés gangliosides distincts, soit 19, suivis par l'échantillon C, avec 12 espèces distinctes, et l'échantillon A1, avec 10.

Par rapport aux échantillons A1 et C, A3 : (i) englobe également le plus grand nombre d'espèces avec la plus longue chaîne O-glycane appartenant à la classe G1 et la plus grande diversité de compositions de céramides ; (ii) présente le plus grand nombre de classes de gangliosides exprimées en classes -12 contre seulement 6 dans l'échantillon A1 et 6 dans l'échantillon C, respectivement ; (iii) contient le plus grand nombre de gangliosides, qui présentent un noyau saccharidique altéré par des modifications non glucidiques O-acétyle, ainsi que des modifications glucidiques O-fucosyl et O-GalNAc biologiquement pertinentes ; (iv) est le seul extrait urinaire contenant des structures gangliosides modifiées par l'attachement de O-GalNAc, à savoir GalNAc-GS1 (t18:1/18:0), détecté comme une molécule déprotonée et sodée à quatre brins à m/z 1176,8266 , et GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), en tant que molécule doublement déprotonée à m/z 1310.1271. Comme le montrent les figures 1a à c, montrant la proportion de classes de gangliosides exprimées dans les trois échantillons, et dans l'histogramme comparatif représenté à la figure 2, l'extrait A3 présente un statut de sialylation particulier, dominé par des composés polysialo. À l'exception du gangliotétraose monosialylé GM1(d18:1/16:1) détecté comme [M-2H+ ] 2− à m/z 756,9078 et du GM3 monosialylé (d18:0/24 : 0) détectée comme une molécule doublement déprotonée à m/z 645,3956, les 17 autres espèces contiennent plus d'un résidu Neu5Ac dans leur fragment glycane. De plus, comme pas moins de sept trisialo GT1, quatre pentasialo GQ1 et même un GS1 heptasialylé ont été découverts, évidemment, outre le nombre et la diversité accrus des structures, la longueur des noyaux de glycane et leurs modifications périphériques, la sialylation globale élevée le contenu représente une autre caractéristique spécifique à la macroalbuminurie.

Tableau 1. Les espèces de gangliosides ont été identifiées dans les échantillons A1, A3 et C par le dépistage (-) nanoESI Orbitrap MS. d : base sphingoïde dihydroxylée ; t : base sphingoïde trihydroxylée.

Une observation cliniquement pertinente émerge également du test comparatif A1 vs. C. Alors que dans l'échantillon témoin C, le degré de sialylation le plus élevé des gangliosides détectés est de quatre, identifiés via deux gangliotétraoses tétrasialylés GQ1 différant par la composition de leur aglycone lipidique, dans l'échantillon A1, le degré de sialylation le plus élevé est de quatre. À côté des gangliosides di-, tri- et tétrasialylés, le mélange A1 contient un pentasialo gangliotetraose GP1 (d18:1/18:0), détecté comme [M-4H+ ] 4− ion à m/z 676,5569, auquel a été attribuée l'excellente précision de masse de 2,95 ppm. Ces données liées au statut de sialylation des échantillons étudiés montrent que le degré de sialylation des gangliosides rénaux suit le trait C < A1 < A2=A3, une observation qui souligne la précocité de ces modifications, même au stade de normoalbuminurie de Patients atteints de diabète de type 2. Le degré de sialylation augmente avec la progression de la maladie, ce qui en fait un paramètre moléculaire à prendre en compte non seulement pour la détection précoce de la DKD mais également pour l'évaluation deProgression de la DKDetefficacité du traitement.

Tableau 2. Vue tabulée des classes de gangliosides urinaires identifiées ainsi que leur expression différentielle dans les échantillons A1, A3 et C. Symboles : x=la classe a été détectée ; -=la classe n'a pas été détectée.

Une inspection détaillée de la constitution des aglycones révèle que, outre les dissemblances marquées dans la composition de la chaîne glycane, les gangliosides exprimés dans les trois échantillons présentent également des différences dans la structure de leurs céramides. Les altérations les plus évidentes de la partie lipidique sont liées au processus moins courant de trihydroxylation de la base sphingoïde, qui se produit dans les mélanges de gangliosides A1 et A3, et à la longueur inhabituelle des chaînes d'acides gras, présentes uniquement dans A3. Chacun des échantillons A1 et A3 s’est avéré contenir deux espèces avec des bases sphingoïdes trihydroxylées du céramide. Par conséquent, GT1(t18:0/18:0) et GT1(t18:0/20:0) ont été découverts dans l'échantillon A1, alors que plus Des structures complexes trihydroxylées GT1 (t18: 1/24: 3) et Fuc-GT3 (t18: 1/18: 3) ont été trouvées dans l'échantillon A3.

Remarquablement, l’échantillon A3 montre également la présence d’espèces contenant des acides gras à très longue chaîne (VLCFA). Un VLCFA est considéré comme une structure lipidique rare comprenant 23 à 27 atomes de carbone dans la chaîne des acides gras. Quatre de ces espèces VLCFA inhabituelles portant 24 atomes de carbone dans la chaîne d'acide gras ont été détectées dans l'échantillon A3 : GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18 :0/24 :0) et Fuc-GT1(d18 :0/24:0), dont une structure présente également la trihydroxylation rare de la base sphingoïde et trois doubles liaisons dans la chaîne des acides gras, tandis que deux structures présentent des attaches au noyau glycane du groupe O-Ac et fucosyle, respectivement.

Ces caractéristiques des portions céramides dans les échantillons A1 et A3, qui n'étaient pas retrouvées dans l'échantillon témoin ; les similitudes entre l'A1 et l'A2 ; et les différences marquées détectées dans l'A3 suggèrent que, outre la composition en glucides et le statut de sialylation, la structure de la fraction lipidique dans les gangliosides rénaux est un autre marqueur possible de la DKD précoce. Par ailleurs, les modifications de la composition en céramides semblent dépendre des stades d'albuminurie ; des céramides complexes, présentant une trihydroxylation de la base sphingoïde et des VLCFA, semblent être liés aux stades avancés d'albuminurie. Considérant que le nombre rare de trois doubles liaisons dans la chaîne d'acide gras a été rencontré uniquement dans l'échantillon A3 via deux espèces différentes, Fuc-GT3(t18:1/18:3) et GT1(t18:1/24:3), apparemment, le mécanisme de formation de doubles liaisons est également lié à la progression du DKD.

Les effets négatifs exercés par l’accumulation de lipides dans le rein, tant au niveau glomérulaire que tubulaire, sont spécifiques à chaque cellule. De plus, la lipotoxicité est associée à différents types de lipides, parmi lesquels les gangliosides jouent un rôle central [13].

La teneur rénale en gangliosides, entre autres classes de lipides, a été augmentée dans les podocytes, ainsi que dans les cellules du tubule proximal, dans un modèle de souris DN (14). Les tubules proximaux peuvent être exposés à des taux élevés de lipides urinaires, notamment de gangliosides, en raison de l'augmentation de la teneur en acides gras par molécule d'albumine au début de la DKD [15]. Les conséquences directes de l’accumulation de lipides dans les segments du néphron sont liées à des modifications structurelles et fonctionnelles, qui conduisent à une altération du traitement de l’albumine au début du diabète de type 2.

La grande majorité des études portant sur la caractérisation du ganglioside rénal s'appuient sur des modèles expérimentaux de néphropathie diabétique. Au meilleur de nos connaissances, il s’agit de la première étude translationnelle humaine, depuis la recherche fondamentale jusqu’à l’applicabilité clinique, à rendre compte d’un profil ganglioside urinaire particulier chez des patients atteints de diabète de type 2. L'importance pratique de notre étude réside dans la démonstration d'une association du degré de sialylation des gangliosides urinaires et de la structure de leurs céramides avec une DKD précoce, classée par niveau d'albuminurie.

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