HPLC pour la détermination simultanée de quatre composants glycosides de phényléthanol dans les morceaux de décoction de Cistanche Herba et les extraits de Cistanche Tubulosa

Résumé : L’objectif de cette étude est d’établir unechromatographie liquide haute performance (HPLC)procédé de détermination simultanée de quatre glycosides de phényléthanol dansMorceaux de décoction de Cistanches HerbaetExtraits de Cistanche tubulosa. Les conditions chromatographiques utilisaient une colonne Inertsil ODS{{0}} (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), avec une phase mobile constituée d'acétonitrile - 0,1 % d'acide formique. solution utilisant une élution par gradient. Le débit a été réglé à 1,0 ml/min, la température de la colonne a été maintenue à 30 degrés et la longueur d'onde de détection était de 330 nm avec un volume d'injection de 1{ {27}} µL. La linéarité de l'aire du pic avec des concentrations variait de 2,53 à 201,60 µg/mL pour différents glycosides, avec des coefficients de corrélation (r) supérieurs à 0,9993. Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) se situaient respectivement entre 0,2249 et 1,1004 µg/mL et entre 0,3101 et 0,8161 µg/mL. La méthode a démontré une bonne précision, stabilité et répétabilité avec des valeurs RSD inférieures à 3,0 %. Les taux de récupération moyens variaient entre 97,70 % et 100,95 %, ce qui indique l'exactitude et l'efficacité de la méthode pour la quantification simultanée de ces composants dans les échantillons.

Mots clés:Chromatographie en phase liquide à haute performance,Cistanches Herba, morceaux de décoction,Extraits de Cistanche tubulosa, glycosides de phényléthanol, détermination du contenu.

HÉTIAN DICHENCHAMBRE LIMITE MICROBIENNE

Le Cistanche, également connu sous le nom de Rou Cong Rong et Desert Ginseng, appartient à la famille des Orobanchaceae et est utilisé en médecine traditionnelle pour ses tiges charnues recouvertes d'écailles. Il parasite les racines des plantes Chenopodiaceae telles que Haloxylon et Tamarix, et se trouve principalement dans les régions arides de la Mongolie intérieure, du Qinghai, du Xinjiang et du Ningxia en Chine. Elle a été répertoriée pour la première fois dans le texte classique sur les herbes « Shennong Bencao Jing » comme herbe de première qualité. La cistanche a un goût sucré et salé, est de nature chaude et est associée aux méridiens des reins et du gros intestin. Il est connu pour ses bienfaits pour renforcer les reins et le yang, hydrater les intestins et soulager la constipation, protéger le foie, lutter contre le vieillissement, lutter contre la fatigue et renforcer l'immunité. Cliniquement, il est souvent utilisé pour traiter des affections telles que l’insuffisance rénale en yang, la constipation due à une carence sanguine, l’infertilité chez les femmes, la faiblesse des genoux et du dos et le déclin de la mémoire. Le cistanche est vénéré comme le « ginseng du désert » et un « médicament précieux ».

La plante contient des glycosides de phényléthanol, des terpènes iridoïdes, des alcaloïdes, des lignanes et d'autres composants, l'échinacoside et l'actéoside étant des glycosides de phényléthanol représentatifs connus pour leurs effets sur l'amélioration du yang, leurs propriétés anti-âge, leurs propriétés antioxydantes et leur amélioration de la mémoire. Ces composants constituent la base principale des effets médicinaux du Cistanche et sont également des indicateurs clés pour l'évaluation et le contrôle de la qualité dans l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise.

Il y a eu des rapports sur la détermination de la teneur en glycosides de phényléthanol chez les espèces de Cistanche par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), mais ceux-ci se sont limités aux matières premières et aux tranches de Cistanche. Actuellement, il n’existe aucune norme nationale pour l’extrait de Cistanche tubulosa, et sa teneur n’a pas été déterminée. Nos recherches préliminaires ont révélé que le Cistanche tubulosa du Xinjiang contient principalement quatre glycosides représentatifs de phényléthanol : l'échinacoside, l'isoacteoside, l'acteoside et le tubuloside A. Cette étude a établi une méthode HPLC pour la détermination simultanée de ces quatre composants dans les morceaux de décoction de Cistanche et les extraits de Cistanche tubulosa, visant à mieux évaluer la qualité des morceaux de décoction de Cistanche et à contribuer à l'établissement de normes de qualité pour ses extraits. Le rapport est le suivant.

1 Instruments et réactifs

1.1 Instruments

• Chromatographie liquide haute performance LC-20AT, comprenant un détecteur à barrette de diodes (Simadzu, Japon)

• Balance électronique AB135-S (Mettler Toledo, Suisse)

• Nettoyeur à ultrasons KQ-500DE (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Système d'eau ultra-pure Aike (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Réactifs

• Substances standards de pinorésinol diglucoside (numéro de lot S-003-01904003), isomucronulatol 7-O-glucoside (numéro de lot Y-073-11803024), mucronulatol 7-O-glucoside (numéro de lot M{ {6}}) et Tubuloside A (numéro de lot G-066-11812016), tous achetés auprès de Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., avec une pureté supérieure à 98 %.

• Acétonitrile et méthanol de qualité chromatographique, acide formique de qualité analytique, l'eau était ultra pure.

• Quatre lots de morceaux de décoction de Cistanches Herba (codes S1, S2 de Mongolie intérieure ; codes S3, S4 du Xinjiang) ont tous été achetés auprès de quatre pharmacies d'Urumqi.

• Les extraits de Cistanche tubulosa (code S5, extraction à l'eau par tranche sèche inactivée par une enzyme ; code S6, extraction à l'alcool par tranche sèche inactivée par une enzyme ; code S7, extraction liée à la résine d'alcool par tranche sèche inactivée par une enzyme) ont tous été achetés auprès de Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., Ltd.

2 Méthodes et résultats

2.1 Conditions chromatographiques

• Colonne chromatographique : colonne Inertsil ODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Phase mobile : Acétonitrile (A) - 0, solution aqueuse d'acide formique à 1 % (B) avec une élution en gradient (de 17 % A à 20 % A sur 0-12 min, 20 % A à 22 % A sur 12-30 min, 22 % A à 17 % A sur 30-35 min)

• Débit : 1,0 mL/min

• Longueur d'onde de détection : 330 nm

• Température de la colonne : 30 degrés

• Volume d'injection : 10 µL

  

Laboratoire Physico-chimique Hetia Dichen

2.2 Préparation de la solution

• Solution étalon mixte : pesez avec précision chacun des quatre étalons et transférez-les dans des fioles jaugées séparées de 1 0 mL, complétez au volume avec 50 % de méthanol pour obtenir des solutions étalons uniques avec des concentrations de 1,008, 1,011, 1,012 et 1,012. mg/L pour le diglucoside de pinorésinol, le tubuloside A, le mucronulatol 7-O-glucoside et l'isomucronulatol 7-O-glucoside, respectivement. Mesurer une quantité appropriée de chacun, combiner dans une fiole jaugée de 10 mL, porter au volume avec 50 % de méthanol, bien mélanger pour préparer une solution étalon mixte avec des concentrations de 201,60, 50,55, 101,20 et 50,60 µg/mL, respectivement, et filtrer. à travers un filtre à membrane de 0,45 µm.

• Solution d'échantillon : environ 1,0 g de poudre de morceau de décoction de Cistanches Herba (passée au tamis n°4) est pesé avec précision et transféré dans une fiole jaugée ambrée de 1{{10}}0 mL. . Ajouter précisément 50 mL de méthanol à 50 %, peser, extraire par ultrasons pendant 40 minutes avec une puissance de 250 W et une fréquence de 35 kHz, refroidir, repeser et reconstituer la masse perdue avec du méthanol à 50 %. Bien mélanger, filtrer et récupérer le filtrat. Passer sur un filtre à membrane de 0,45 µm pour obtenir la solution échantillon de Cistanches Herba. De même, préparez la solution échantillon d’extrait de Cistanche tubulosa en utilisant environ 0,2 g de poudre d’extrait.

1. Échinacoside 2. Tubuloside A 3. Actéoside 4. Isoacteoside A. Solution mixte de référence B. Solution test de morceaux de décoction de Cistanches Herba C. Solution test d'extrait de Cistanche Tubulosa

2.3 Examen méthodologique

Test d'adéquation du système : des volumes appropriés de trois solutions de la section 2.2 ont été échantillonnés dans les conditions chromatographiques décrites dans la section 2.1, et des chromatogrammes ont été enregistrés. Les résultats ont indiqué que le nombre théorique de plateaux pour le pic de l’échinacoside ne devrait pas être inférieur à 3 000, avec des degrés de séparation supérieurs à 1,5, ce qui indique une bonne séparation de base. Voir la figure 1 pour plus de détails.

Évaluation de la linéarité : volumes précis de la solution de référence mixte de la section 2.2 (0,5, 1.0, 2,5, 5.0 et 10,0 mL ) ont été transférés dans des fioles jaugées de 10 ml, portés au volume avec 50 % de méthanol, bien mélangés et utilisés pour créer une série de solutions de référence mixtes. Précisément 10 µL de ces solutions ont été injectés dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Les zones de pic ont été enregistrées et une régression linéaire a été réalisée en utilisant les concentrations des composants (X, µg/mL) comme variable indépendante et les zones de pic (Y) comme variable dépendante. Les équations de régression et la plage de linéarité se trouvent dans le tableau 1.

Limites de détection et de quantification : Des volumes précis de la solution de référence mixte de la section 2.2 ont été prélevés, dilués en conséquence et analysés dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Des concentrations correspondant à des rapports signal/bruit de 3 : 1 et 10 : 1 ont été utilisées respectivement comme limites de détection et de quantification. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.

Test de précision : Un volume approprié de la solution de référence mixte de la section 2.2 a été analysé six fois consécutives dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Les valeurs RSD pour les zones de pic de l'échinacoside, du tubuloside A, de l'actéoside et de l'isoacteoside étaient respectivement de 1,31 %, 0,91 %, 1,58 % et 0,58 % (n {{12} }), indiquant une bonne précision de l'instrument.

Test de stabilité : les solutions d'échantillons de test ont été préparées et laissées à température ambiante pendant 0, 2, 4, 6, 8, 12 et 24 heures avant d'être analysées dans les conditions de la section 2.1. Les valeurs RSD pour les zones de pic de l'échinacoside, du tubuloside A, de l'acteoside et de l'isoacteoside étaient respectivement de 1,84 %, 2,18 %, 1,05 % et 1,55 % (n=7), ce qui indique que les solutions de test étaient stables à température ambiante. température jusqu'à 24 heures.

Test de répétabilité : Un échantillon (ID : S2) a été pesé avec précision et divisé en six portions. Chaque portion a été préparée comme solution d'échantillon d'essai selon la méthode de la section 2.2 et analysée dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Les teneurs moyennes en échinacoside, tubuloside A, acteoside et isoacteoside étaient respectivement de 0,779 %, 0.020 %, 0,155 % et 0,074 % , avec des valeurs RSD de 1,21 %, 3,12 %, 2,65 % et 2,96 % (n=6), démontrant une bonne répétabilité de la méthode.

Test de récupération : Une quantité connue d’échantillon (ID : S2) a été prélevée et divisée en neuf portions. Chaque portion a été enrichie avec des concentrations faibles, moyennes ou élevées des solutions de référence individuelles, préparées selon la méthode de la section 2.2 et analysées dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Les zones de pic ont été enregistrées et les taux de récupération ont été calculés. Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Laboratoire HPLC Hetian DiChen

2.4 Exemple de détermination du contenu

Des volumes appropriés de chaque lot d'échantillons ont été préparés comme solutions d'essai selon la méthode de la section 2.2, puis analysés dans les conditions chromatographiques de la section 2.1. Chaque échantillon a été testé en triple, les zones de pics ont été enregistrées et le contenu des échantillons a été calculé. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.

3 Discussion

Dans cette étude, un détecteur à réseau de diodes a été utilisé et des analyses des solutions de référence mixtes et des solutions d'échantillons de test ont été effectuées dans la plage de longueurs d'onde de 200 à 450 nm. Les résultats ont montré que l'échinacoside et l'acteoside présentaient une absorption maximale à 330 nm, le tubuloside A à 331 nm et l'isoacteoside à 327 nm. De plus, en faisant référence à l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise, qui spécifie une longueur d'onde de détection de 330 nm pour l'échinacoside et l'actéoside, il a été observé que de nombreux composants présentaient des pics chromatographiques significatifs et des valeurs de réponse élevées à 330 nm, ce qui a conduit à la sélection de 330 nm comme la longueur d'onde de mesure finale.

À partir des résultats de la détermination du contenu des morceaux de décoction de Cistanches Herba, il a été constaté que l'échinacoside avait la teneur la plus élevée dans le Cistanche tubulosa et le Cistanche du désert, suivi de l'acteoside, tandis que le tubuloside A et l'isoacteoside avaient des teneurs relativement plus faibles. Il y avait une variabilité significative dans la teneur en quatre composants glycosides de phényléthanol, et cette variabilité était également prononcée entre différents lots provenant du même endroit ou de différents endroits. Cette variation peut être attribuée à des facteurs tels que l’environnement géographique, la température, le climat et les processus de récolte des matières premières, qui affectent l’accumulation de constituants chimiques dans les plantes. Bien que les composants chimiques du Cistanche provenant de différentes origines soient similaires, les concentrations de ces composants varient, entraînant des différences dans leurs effets. Il est donc approprié de sélectionner les matières premières en fonction de leur efficacité afin d’obtenir de meilleurs résultats cliniques.

En résumé, la méthode établie dans cette étude est simple, rapide, précise et efficace. Il peut être utilisé pour déterminer simultanément quatre composants glycosides de phényléthanol dans les morceaux de décoction de Cistanches Herba et les extraits de Cistanche tubulosa. Les résultats de la détermination du contenu peuvent refléter les niveaux de qualité de différents lots et de différents extraits provenant du même endroit ou de différents endroits, fournissant ainsi une base théorique pour l'établissement de normes de qualité pertinentes.

Languette. 2 Résultats du test de récupération (n=9)

Languette. 3 Résultats de la détermination de la teneur en quatre glycosides phényléthanoïdes dans les échantillons (%, n=3)

Avantages du Cistanche

Les références:

1. 中文 (chinois) : 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京 :中国医药科技出版社,2020 :{{ 1}}.
   英文 (anglais) : Commission nationale de pharmacopée. Pharmacopée de la République populaire de Chine (Vol. 1) [M]. Pékin : Presse chinoise des sciences et technologies médicales, 2020 : 140-141.

2. 中文 (chinois) : 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. Publié dans 2016,51(13) :1116-1119.
   英文 (anglais) : Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng et al. Etude comparative des empreintes digitales de Cistanche deserticola et Cistanche tubulosa [J]. Journal pharmaceutique chinois, 2016, 51(13) : 1116-1119.

3. 中文 (chinois) : 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. Publié dans 2019,35(1) :120-121.
   英文 (anglais) : Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui et al. Comparaison de Cistanche deserticola et Cistanche tubulosa [J]. Journal du Collège médical de Baotou, 2019, 35(1) : 120-121.

4. 中文 (chinois) : 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. J］. 中医药学刊,2003,21(4) :539-548.
   英文 (anglais) : Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei et al. Etude sur les effets laxatifs et tonifiants rein-yang de Cistanche deserticola et Cistanche tubulosa [J]. Journal de médecine chinoise et de pharmacie, 2003, 21(4) : 539-548.

5. 中文 (chinois) : 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. J］. Publié dans 2017,35(11) :2882-2885.
   英文 (anglais) : Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu et al. Effets de Cistanche deserticola avant et après traitement sur la fonction anti-âge et immunitaire chez des rats modèles vieillissants [J]. Journal chinois de médecine traditionnelle chinoise et de pharmacie, 2017, 35(11) : 2882-2885.

6. 中文 (chinois) : 吴波, 付玉梅. J］. 中国药理学通报,2005,21(5):639.
   英文 (anglais) : Wu Bo, Fu Yumei. Étude sur l'effet anti-lipidique de la peroxydation des glycosides de Cistanche chez des souris vieillissantes subaiguës [J]. Bulletin pharmacologique chinois, 2005, 21(5) : 639.

7. 中文 (chinois) : 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. J］. 中国预防医学杂志,2007,8(4) :370-373.
   英文 (anglais) : Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying et al. Étude sur l'effet des glycosides de Cistanche sur l'apprentissage et la fonction de mémoire chez des souris normales [J]. Journal chinois de médecine préventive, 2007, 8(4) : 370-373.

8. 中文 (chinois) : 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. J］. Publié par 中国现代中药,2015,17(4) :297-301.
   英文 (anglais) : Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai et al. Développer l'industrie écologique de Cistanche deserticola pour promouvoir la civilisation écologique dans les zones désertiques occidentales [J]. Médecine chinoise moderne, 2015, 17(4) : 297-301.

9. 中文 (chinois) : 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. J］. Publié dans 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (anglais) : Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei et al. Analyse qualitative des glycosides et polysaccharides phényléthanoïdes de Cistanche deserticola de différentes origines [J]. Journal de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning, 2018, 20(7) : 77-81.

10. 中文 (chinois) : 王力伟,曹瑞,房永雨,等. J］. Publié,2017,40(2) :295-300.
    英文 (anglais) : Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu et al. Détermination des composants actifs de Cistanche deserticola par chromatographie liquide ultra performance-spectrométrie de masse triple quadripôle en tandem [J]. Journal des matériaux médicinaux chinois, 2017, 40(2) : 295-300.

11. 中文 (chinois) : 初侨, 席兴军, 杨丽. J］. Publié dans 食品研究与开发,2015,36(16) :49-52.
    英文 (anglais) : Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Etude sur la technologie d'extraction flash de l'échinacoside et du verbascoside chez Cistanche deserticola [J]. Recherche et développement alimentaires, 2015, 36(16) : 49-52.

12. 中文 (chinois) : 余逸凡. J］. 化工管理,2019(13) :111-112.
    英文 (anglais) : Yu Yifan. Progrès de la recherche sur les constituants chimiques et les activités pharmacologiques du Cistanche [J]. Gestion des produits chimiques, 2019(13) : 111-112.

13. 中文 (chinois) : 王小新,骆婷婷. 对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药,2014,33(22):102-103.
    英文 (anglais) : Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Effet de Cistanche deserticola sur l'anti-fatigue et la mémoire chez la souris [J]. Journal de médecine traditionnelle chinoise de Mongolie intérieure, 2014, 33(22) : 102-103.

14. 中文 (chinois) : 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1) :191-196.
    英文 (anglais) : Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu et al. Progrès de la recherche sur les constituants chimiques et les effets pharmacologiques de Cistanche deserticola et analyse prédictive de ses marqueurs de qualité [J]. Journal de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning, 2021, 23(1) : 191-196.

15. 中文 (chinois) : 刘涛,殷松娜,栾昕. J］. Publié dans 2019,35(23) :3084-3087.
    英文 (anglais) : Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Effet de Cistanche deserticola sur les facteurs immunitaires et les protéines liées à l'apoptose chez les rats atteints d'insuffisance ovarienne prématurée [J]. Journal chinois de pharmacologie clinique, 20