Identification des gènes d'horloge liés à l'hypertension dans le rein de rats spontanément hypertendus
Feb 20, 2022
CONTEXTEIl existe une variation diurne de la fluctuation de la pression artérielle de l'hypertension, et l'anomalie de la fluctuation de la pression artérielle est considérée comme un facteur de risque indépendant de lésions organiques, y compris les complications cardiovasculaires. Dans la présente étude, nous avons tenté d'identifier les molécules responsables de la formation du rythme circadien de la pression artérielle sous le contrôle duun reinhorloge biologique dans l'hypertension.
MÉTHODES L'analyse par puce à ADN a été réalisée enreinsprovenant de 5- rats spontanément hypertendus (SHR)/Izm âgés d'une semaine, de rats SHR sujets aux AVC (SHRSP)/Izm et de rats Wistar Kyoto (WKY)/Izm. Pour détecter la variation, des cellules épithéliales tubulaires de souris (TCMK-1) ont été stimulées avec de la dexaméthasone. Nous avons effectué une immunocoloration et une analyse Western blot dansrénalmoelle deun reinde 5-rats WKY et SHR âgés d'une semaine.
RÉSULTATSNous avons extrait 1 032 gènes avec E-box, une séquence de liaison pour BMAL1 et CLOCK à l'aide d'une analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes. Dans une analyse par puce à ADN, nous avons identifié 12 gènes multipliés par plus de 2- dans lereinsdes SHR et SHRSP par rapport aux rats WKY. Dans une analyse de régression périodique, la phosphoribosyl pyrophosphate amidotransférase (Ppat) et le retard mental du X fragile, l'homologue autosomique 1 (Fxr1) ont montré un rythme circadien. L'immunocytochimie a révélé une positivité PPAT dans les noyaux et le cytoplasme des tubules, et une positivité FXR1-dans le cytoplasme de TCMK-1. Chez 5-rat WKY et SHR âgés d'une semainereins, PPAT était localisé dans le noyau et le cytoplasme des tubules proximaux et distaux, et FXR1 était localisé dans le cytoplasme des tubules proximaux et distaux.
CONCLUSIONPPAT et FXR1 sont des molécules essentielles dans le contrôle du rythme circadien de la pression artérielle par leun reindans l'hypertension.
Mots clés:pression artérielle;; hypertension; un rein; néphrotubule; rat spontanément hypertendu
Divers phénomènes biologiques, notamment le cycle du sommeil, la fréquence cardiaque et la tension artérielle, ont un rythme circadien. Pour le rythme circadien, la présence d'horloge biologique a été découverte, puis il a été établi que le rythme circadien existe chez tous les organismes vivants, des archéobactéries à l'être humain. 1
Le noyau suprachiasmatique (SCN), qui est considéré comme fonctionnant comme une horloge centrale, est un centre qui exerce une oscillation autonome du rythme circadien. De plus, les horloges internes présentes dans les organes périphériques sont contrôlées par des horloges centrales, et marquent le rythme approprié pour chaque organe. 2 L'horloge centrale contrôle les horloges périphériques via des facteurs neuronaux et humoraux. Le SCN est constitué d'un grand nombre de neurones qui oscillent de manière autonome, lorsque ces cellules ont été isolées et dispersées chez des rats et des souris, elles ont montré des rythmes circadiens avec de légères différences dans leur fréquence de décharge et leur expression génique. Ainsi, les neurones individuels du SCN sont des cellules d'horloge avec leurs propres oscillateurs circadiens. 3
Récemment, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le rythme des horloges biologiques ont été clarifiés. L'horloge biologique consiste en une boucle principale dans laquelle le cerveau et le muscle arnt-like 1 (BMAL1), les cycles de sortie locomotrice circadienne kaput (CLOCK), la période (PER) et le cryptochrome (CRY) fonctionnent comme des protéines de base. CLOCK et BMAL1 forment un dimère pour agir comme un facteur de transcription et se lier à une séquence E-box (CACGTG). 4 Les gènes cibles comprennent d'autres gènes d'horloge, tels que Per et Cry. Les protéines PER et CRY générées se transloquent dans le noyau et suppriment les gènes BMAL1 et CLOCK. Par la suite, PER et CRY sont résolus au fil du temps par une phosphorylation en plusieurs étapes par la caséine kinase (CKIε), la glycogène synthase (GSK-3) et la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK). Ainsi, la suppression de BMAL1 et CLOCK est annulée par PER et CRY, et la promotion de l'expression génique par CLOCK et BMAL1 recommence, et l'horloge tourne. En plus de cette boucle principale, il existe également une sous-boucle impliquant le membre 1 du groupe D de la sous-famille 1 des récepteurs nucléaires (NR1D1), le récepteur orphelin lié au récepteur de l'acide rétinoïque (ROR), le site D de la protéine de liaison du promoteur de l'albumine (DBP), et E4 protéine de liaison au promoteur 4 (E4BP4). NR1D1 se lie à la séquence RRE (AGGTCA) et supprime la boucle principale via une rétroaction négative, tandis que DBP favorise la boucle principale via une rétroaction positive en se liant à la séquence D-box (TTATGTAA). 5 Il est également rapporté que les protéines agissant sur le rythme circadien sous le contrôle de l'horloge biologique atteignent environ 15 % dans chaque tissu. 6 L'horloge biologique est impliquée dans la formation des rythmes circadiens de divers phénomènes physiologiques.
On sait qu'il existe une variation diurne de la fluctuation de la pression artérielle de l'hypertension, et l'anomalie de la fluctuation de la pression artérielle est considérée comme un facteur de risque indépendant de lésions organiques, y compris les complications cardiovasculaires. 7 Les troubles du rythme circadien de la pression artérielle causent des dommages aux organes. Il existe de nombreux rapports sur la relation entre la pression artérielle et les horloges biologiques, telles que Per, Cry, Bmal1 et Clock. Une diminution de la pression artérielle, une perte de fluctuation quotidienne de la pression artérielle et des lésions des cellules endothéliales vasculaires ont été signalées chez des souris knock-out Bmal1. 8 Des souris knock-out ont signalé une augmentation de l'excrétion urinaire de sodium, une diminution de la pression artérielle et même une fréquence cardiaque réduite et une diminution de l'amplitude circadienne de la fréquence cardiaque. 9 Dashti et al. ont rapporté que les gènes de l'horloge induisaient une grande proportion de variance phénotypique de la pression artérielle systolique. dix
Concernant la contribution de lareinsaux rythmes circadiens, normauxreinsont une plus grande excrétion d'électrolytes et une plus grande production d'urine pendant la journée que la nuit, et il existe un rythme circadien dans l'excrétion de sodium, de potassium et de chlore. 11 Dans l'hypertension, la défaillance du rythme circadien de ces fonctions serait associée à des complications cardiovasculaires. 12 souris knock-out Per1 montrent une excrétion accrue de sodium et une diminution de la pression artérielle par rapport à la sous-unité durénalcanal sodique épithélial (ENaC) dans le canal collecteur duun rein, indiquant la présence d'une horloge biologique dans leun rein.13 De plus, une variation diurne de la pression artérielle (état non louche) est observée chez les patients atteints demaladie du rein. 14 Ainsi, l'horloge centrale située dans le SCN régule larénalhorloge périphérique, marquant le moment optimal pour leun rein.
Il a été rapporté que le rat spontanément hypertendu (SHR), un modèle génétique de l'hypertension essentielle, présente une déviation de la fréquence cardiaque et une fluctuation diurne de la pression artérielle, qui sont accentuées par le vieillissement. 15 Auparavant, nous avons étudié l'horloge circadienne de la glande surrénale chez des rats SHR et Wistar Kyoto (WKY) maintenus sous un cycle lumière-obscurité de 12- heures et avons découvert que les SHR possèdent une horloge circadienne surrénalienne anormale.
et montrent le rythme circadien altéré de l'enzyme limitant la vitesse de codage du gène contrôlé par l'horloge dans la genèse des stéroïdes ainsi que le niveau altéré de glucocorticoïdes sériques. 16 En plus du signal de l'horloge centrale du SCN, le glucocorticoïde libéré par la glande surrénale est connu pour synchroniser l'horloge circadienne périphérique dans un autre organe. 17 La stimulation de la dexaméthasone peut reproduire la fluctuation circadienne du gène de l'horloge et être applicable pour une étude in vitro. 18 Dans ces circonstances, il est possible que SHR ait également des horloges circadiennes périphériques anormales dans divers organes, y comprisun reinqui joue un rôle central dans la régulation de la pression artérielle. Néanmoins, l'horloge circadienne dansun reinde SHR n'a pas été entièrement comprise.
Dans la présente étude, nous avons essayé d'identifier les gènes d'horloge responsables de laun reindans l'hypertension à l'aide de rats SHR et de rats SHR sujets aux accidents vasculaires cérébraux (SHRSP), et a évalué les rôles des gènes d'horloge impliqués dans la régulation du rythme circadien de la pression artérielle anormale.
MÉTHODES
Ethique et animauxNotre enquête était conforme au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par les National Institutes of Health des États-Unis (NIH Publication No. 85-23, 1996). Les protocoles de recherche impliquant l'utilisation d'animaux vivants ont été évalués par le comité d'éthique de la Nihon University School of Medicine (n° 11-034). Des rats WKY/Izm et SHR/Izm maintenus à la Disease Model Cooperative Research Association ont été achetés auprès de Japan SLC (Hamamatsu, Shizuoka, Japon). La pression artérielle systolique a été mesurée par la méthode du brassard. Dans cette étude, afin d'éviter les modifications secondaires de l'expression des gènes par l'élévation de la pression artérielle et d'identifier les gènes responsables qui affectent les rythmes circadiens et éventuellement associent l'hypertension, nous avons choisi des rats d'une semaine préhypertendus 5-.
Recherche de gènes avec E-box dans le génome entier
Nous avons utilisé la base de données des signatures moléculaires dans l'analyse de l'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA ; Broad Institute, Boston, MA) pour rechercher dans le groupe de gènes des cibles de facteurs de transcription humains et utilisé la base de données avec le plus grand nombre de gènes en amont du gène A du point de départ de la transcription, dans lequel E-box (CACGTG) était présent à 2,000 bp en amont.
Analyse de puces à ADN
Reinsont été retirés de 5-rats SHR/Izm, SHRSP/Izm et WKY/Izm âgés d'une semaine à 12 :00. Les réséquésun reina été homogénéisé avec un TaKaRa BioMasher Standard (Takara, Otsu, Shiga, Japon), et l'ARN total a été extrait. Après hybridation et numérisation, la quantification a été effectuée avec Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies). L'expression des gènes a été comparée et examinée. Les gènes dont l'expression fluctue entre les souches ont été extraits avec un seuil supérieur à 2- fois ou inférieur à 0,5- fois.
Détection de la variation des gènes candidats dans les cellules TCMK-1
Des cellules épithéliales tubulaires de souris (TCMK{{0}}) de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) ont été stimulées avec 0,5 µmol/l de dexaméthasone comme décrit
précédemment. 18 Le milieu a été remplacé par du milieu Eagle modifié de Dulbecco sans sérum. L'ARN total a été extrait toutes les 4 heures après stimulation par la dexaméthasone, et l'abondance des ARNm Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat et Tef a été quantifiée à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel. À la même étape, une réaction en chaîne par polymérase en temps réel a été réalisée sur l'ARN de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et utilisée comme étalon interne. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S1 en ligne. La périodicité de la fluctuation de l'ARNm après stimulation par la dexaméthasone des cellules TCMK -1 a été analysée par une analyse de régression multivariée qui a déterminé la courbe de maillage (MESS), l'amplitude (AMP), la phase (TZ1) en optimisant la courbe cosinus à l'aide de la méthode des moindres carrés Estimations de MESS, AMP et TZ1 ; leurs intervalles de confiance à 95 % ont été calculés à l'aide de la méthode de la simple coïncidence.
Coloration immunofluorescente des cellules TCMK-1Les cellules TCMK-1 ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %. Après lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate, les cellules ont été incubées avec un anticorps monoclonal de lapin anti-PPAT
(Sigma-Aldrich) dilué 250 fois et l'anticorps monoclonal de lapin anti-FXR1 (Abcam, Cambridge, UK) dilué 300 fois à température ambiante pendant 1 heure. Une dilution de 1,000- fois d'IgG anti-lapin Alexa Fluor 488 (Invitrogen), en tant qu'anticorps secondaire, a été amenée à réagir dans l'obscurité pendant 1 heure.
Immunomarquage dans le rein de rats WKY et SHRLarénalmoelle de laun reinde 5-rats WKY/Izm âgés d'une semaine et SHR/Izm a été isolé et inclus dans de la paraffine, et incubé avec un anticorps monoclonal de lapin anti-PPAT dilué 250 fois et un anticorps monoclonal de lapin anti-FXR1 dilué 200 fois. Histofine Simple Stain Rat MAX-PO (MULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japon) a été appliqué comme anticorps secondaire. Les tranches ont été déshydratées, clarifiées, scellées avec du marinol et observées au microscope optique.
Western blot pour les protéines FXR1 et PPAT dans les reins de rats WKY et SHRLarénalmedulla a été soumis à une extraction de protéines à l'aide d'un tampon de test de radio-immunoprécipitation (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon). Les tranches ont été transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène avec iblot (Invitrogen) et bloquées avec une solution de lait écrémé à 5 % pendant 1 heure. Les anticorps primaires, qui étaient des anticorps monoclonaux de lapin anti-FXR1 et des anticorps monoclonaux de lapin anti-PPAT, ont été appliqués. Une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à la peroxydase de raifort (Jackson ImmuneReseach, West Grove, PA) a été utilisée comme anticorps secondaire. La GAPDH a été utilisée comme étalon interne.
analyses statistiquesLes valeurs ont été rapportées comme la moyenne ± SE. Le test t de Student a été utilisé pour l'analyse des données non appariées. Une analyse 2-way de la variance avec la procédure de Bonferroni/Dunn comme post-test a également été utilisée. Valeurs P de<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistical="">
RÉSULTATS
Pression artérielleLa tension artérielle systolique des {{0}} rats WKY/Izm, SHR/Izm et SHRSP/Izm âgés d'une semaine était de 116 ± 3,0 (n=6), 121 ± 3,3 (n=6), et 125 ± 3,4 (n=5) mm Hg, respectivement. La pression artérielle systolique ne différait pas entre les 3 souches de manière statistiquement significative.
Recherche de gènes avec E-box dans le promoteur par analyse GSEANous avons recherché des gènes portant la séquence de liaison E-box (CACGTG) de l'hétérodimère CLOCK et BMAL1 dans l'ensemble du génome. En conséquence, 1 032 gènes portant une boîte E entre 2,000 pb en amont ou en aval du point d'initiation de la transcription ont été identifiés (tableau supplémentaire S2 en ligne).
Comparaison de l'expression génique dans le rein de rats WKY, SHR et SHRSP par analyse de puces à ADNNous avons comparé l'expression des gènes dansreinsà partir de 5-rats WKY/Izm et SHR/Izm âgés d'une semaine à l'aide de puces à ADN. Trois cent soixante-trois gènes étaient fortement exprimés (plus de 2- fois) dans lerénalcortex des rats SHR/Izm par rapport aux rats WKY/Izm. Les niveaux d'expression de 281 gènes dans leun reinétaient plus de 0.5- fois par rapport aux rats WKY/Izm. Dans lerénalmoelle de rats SHR/Izm, 284 gènes ont montré des niveaux d'expression plus élevés et 203 gènes
ont montré des niveaux d'expression inférieurs à ceux des rats WKY/Izm. Dans lerénalcortex des rats SHRSP/Izm, les niveaux d'expression de 267 gènes étaient plus que 2- fois supérieurs à ceux des rats WKY/Izm. Les niveaux d'expression de 580 gènes étaient inférieurs à 0,5- fois par rapport aux rats WKY/Izm. Dans lerénalmedulla de SHRSP/Izm, 639 gènes ont montré des niveaux d'expression plus élevés et 251 gènes ont montré des niveaux d'expression plus faibles par rapport aux rats WKY/Izm. Parmi 1 032 gènes avec une boîte E, le niveau d'expression de 17 gènes d'ARNm était plus que 2- fois dansrénalcortex des rats SHR/Izm par rapport à
Figure 2. La variation d'expression des ARNm des gènes candidats dans les cellules TCMK-1 après stimulation par la dexaméthasone. Les cellules TCMK-1 ont été stimulées avec 0.5 µmol/l dexaméthasone pendant 2 heures. L'ARN total a été extrait toutes les 4 heures après stimulation par la dexaméthasone et l'abondance des ARNm Npm1, Nptx1, Trim46, Plbd1, Plagl1, Bcl6, Fxr1, Tbl1, Hnrnpa3, Ppat et Tef a été évaluée par réaction en chaîne par polymérase en temps réel. L'expression relative des gènes a été analysée par comparaison avec l'ARNm de GAPDH. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n=6).
Rats WKY/Izm. Parmi ces 17 gènes, l'expression de 4 gènes (Bcl6, Nr1d1, Ppat et Tef) a été augmentée de plus de 2- fois dans lerénalcortex des rats SHRSP/Izm par rapport aux rats WKY/Izm (tableau 1). Dans lerénalcortex des rats SHR/Izm, l'expression de l'ARNm de 10 gènes a été détectée, qui a diminué de moins de 0,5- fois par rapport aux rats WKY/Izm ; 8 de ces gènes (Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1,
Plbd1, Tbl1x et Trim46) ont également été réduits à moins de 0.5- fois dans lerénalcortex de rats SHRSP/Izm (tableau 1). L'expression de l'ARNm de 10 gènes dans lerénalla médulla des rats SHR/Izm était plus que 2- fois supérieure à celle des rats WKY/Izm. Parmi ces 10 gènes, l'expression des ARNm Nr1d1 et Tef dans lerénalla médulla des rats SHRSP/Izm a été augmentée de plus de 2- fois par rapport aux rats WKY/Izm (tableau 1). L'expression de l'ARNm du récepteur de la transferrine (Tfrc) dans lerénalla médulla des rats SHR/Izm était inférieure à 0.5- fois par rapport aux rats WKY/Izm. Cependant, l'expression de l'ARNm de Tfrc a été augmentée dans lerénalmoelle de rats SHRSP/Izm (tableau 1).
Induction des ARNm du gène de l'horloge dans les cellules néphrotubulairesLa figure 1 montre la variation de l'expression des ARNm Per1, Bmal1, Nr1d1 et Cry1 après l'ajout de dexaméthasone dans les cellules TCMK-1. Les amplitudes de l'expression des ARNm de Per1, Bmal1 et Nr1d1 ont montré des pics à 28 et 44 heures après 4 heures de stimulation par la dexaméthasone. L'amplitude de l'expression de l'ARNm de Cry1 a montré des pics à 4, 28 et 44 heures après 4 heures de stimulation par la dexaméthasone. Ainsi, la stimulation de la dexaméthasone a induit la fluctuation de l'expression de l'ARNm du gène de l'horloge dans TCMK-1 (Figures 1 et 2).
stimulation par la dexaméthasone. L'expression de l'ARNm de Ppat a culminé à 28 heures après la stimulation avec la dexaméthasone, puis a de nouveau augmenté à 44 heures. Hnrnpa3 a montré des pics à 16, 28 et 44 heures et a montré des amplitudes relativement similaires à Per1. Npm1 a montré un pic à 28 heures, similaire à Per1. Fxr1 a montré un pic à 24 et 44 heures (Figure 2). Nous avons effectué une analyse de régression périodique pour évaluer la signification statistique de ces variations. L'analyse a indiqué que la variation de l'expression des ARNm de Cry1 et Bmal1 présentait une périodicité significative (P <0.05) après="" le="" chargement="" de="" dexaméthasone="" dans="" les="" cellules="" tcmk-1="" (figure="" supplémentaire="" s1="" et="" tableau="" s3="" en="" ligne).="" les="" résultats="" de="" l'analyse="" de="" régression="" périodique="" de="" 7="" gènes="" sont="" présentés="" dans="" la="" figure="" supplémentaire="" s2="" et="" le="" tableau="" s3="" en="" ligne.="" l'analyse="" a="" indiqué="" que="" fxr1="" et="" ppat="" ont="" montré="" une="" régression="" significative="" (p="">< 0,05).="" dans="" la="" régression="" de="" fxr1,="" la="" période="" et="" l'amplitude="" ont="" montré="" de="" grandes="" vagues,="" tandis="" que="" dans="" ppat,="" la="" période="" et="" l'amplitude="" étaient="" petites="" et="" ont="" montré="" un="" rythme="">
Immunomarquage de PPAT et FXR1 dans les cellules néphrotubulaires et dans les reins de rats WKY et SHRLa PPAT était localisée à la fois dans le cytoplasme et le noyau. FXR1 n'était localisé que dans le cytoplasme des cellules TCMK -1 (Figure 3). Le PPAT a été coloré à la fois dans les noyaux et le cytoplasme dans les tubules proximaux et distaux (Figure 4). FXR1 était principalement coloré dans le cytoplasme des tubules proximaux et distaux (Figure 4). Il n'y avait aucune différence apparente dans la coloration ou la localisation dans les reins des rats WKY et SHR.
L'expression des protéines FXR1 et PPAT dans les reins des rats WKY et SHRLa figure 5 montre le western blot des protéines FXR1 et PPAT dans lerénalmoelle de 5- rats WKY et SHR âgés d'une semaine. L'abondance de la protéine FXR1 était dansrénalla médulla des rats SHR était significativement plus faible par rapport aux rats WKY (P <0.05). l'expression="" de="" la="" protéine="" ppat="" dans="">rénalla médulla des rats WKY et SHR ne différait pas de manière statistiquement significative.
DISCUSSIONL'hypertension induit des troubles cardiovasculaires etrénalcomplications, telles que chroniquesmaladie du rein(CKD). Les patients atteints d'IRC sont connus pour développer des anomalies de fluctuation de la pression artérielle, ce qui suggère que leun reinpeut être impliqué dans les rythmes circadiens anormaux de la pression artérielle dans l'hypertension. 19 Dans la présente étude, nous avons donc cherché à identifier les molécules responsables de la formation du rythme circadien de la pression artérielle sous le contrôle de l'horloge biologique duun reindans l'hypertension. Nous avons obtenu 1 032 gènes candidats portant la séquence E-box à partir de la base de données GSEA. Étant donné que l'hétérodimère BMAL1 / CLOCK se lie à la boîte E pour réguler la transcription des gènes en aval, ces gènes sont considérés comme contrôlés par une horloge circadienne biologique. Afin d'identifier les molécules impliquées dans le rythme circadien de la pression artérielle dans le rein, nous avons étudié de manière approfondie l'expression des gènes dans les reins des rats SHR, SHRSP et WKY à l'aide d'une puce à ADN. Parmi les 1 032 gènes, nous avons sélectionné des transcrits qui ont augmenté de plus de 2- fois ou ont diminué de moins de 0,5- fois
en SHRun reinpar rapport à celles des rats WKY. Nous nous sommes ensuite concentrés sur les gènes qui montraient des tendances similaires dans lereinsde SHRSP, en particulier, Bcl6, Nr1d1, Ppat, Tef, Fxr1, Hnrnpa3, Npm1, Nptx1, Plagl1, Plbd1, Tbl1x et Trim46. Ces 12 gènes portant la séquence E-box, qui ont montré des niveaux d'expression plus ou moins élevés chez les rats modèles hypertendus (SHR et SHRSP) par rapport aux rats WKY normotendus, sont peut-être associés au rythme circadien de la pression artérielle. Parmi ces gènes, il a été rapporté que Nr1d1, également appelé virus de l'érythroblastose inverse (Rev-erb), forme une sous-boucle de l'horloge biologique. 20
Il a été confirmé que le fait de soumettre des cellules cultivées à une charge de dexaméthasone ou à un choc sérique de cheval à haute concentration reproduisait l'amplitude de l'expression du gène de l'horloge in vitro. 21,22 L'ajout de sérum à haute concentration et de glucocorticoïde est considéré comme utile pour la reproduction du rythme circadien de l'expression du gène de l'horloge dans les tissus périphériques. 18,23 Dans cette étude, nous avons réussi à induire l'amplitude des gènes d'horloge d'ARNm Per1, Cry1 et Nr1d1 in vivo avec une charge de dexaméthasone dans des cellules épithéliales tubulaires de souris. Avec la charge de dexaméthasone, Per1 a augmenté à 4, 20–24 et 44 heures après la stimulation, Cry1 a augmenté à 0–8 et 24–32 heures, et Nr1 d1 a augmenté à 0– 4, 16–24 et 40–44 heures. Ces changements sont similaires à ceux décrits dans les rapports précédents. 21 Grâce à ce système de dexaméthasone, nous avons identifié l'induction d'amplitudes de 2 gènes : Fxr1 et Ppat. De plus, l'immunocoloration a démontré que PPAT était exprimé dans le noyau et le cytoplasme des tubules, et que FXR1 était exprimé dans le cytoplasme des tubules. Ces résultats suggèrent que ces 2 molécules sont contrôlées par lerénalhorloge périphérique et sont des candidats potentiels pour la formation du rythme circadien de la pression artérielle.
Western blot a révélé que l'expression protéique de FXR1 était plus faible dans lerénalmedulla des rats SHR que dans celle des rats WKY. L'expression de PPAT dans la médullaire rénale des rats WKY et des SHR ne différait pas de manière statistiquement significative. Fxr1 appartient à la même famille de gènes que le gène 1 du retard mental de l'X fragile (Fmr1), qui est considéré comme le gène responsable du syndrome de l'X fragile. FXR1 est une protéine de liaison à l'ARN qui interagit avec FMR1 et FXR2. On suppose que le cytoplasme et le noyau peuvent être réciproques car ils ont des signaux de localisation nucléaire et des signaux d'exportation nucléaire. 24 Chez l'homme, il a été démontré que l'expression aberrante de Fxr1 dans le muscle squelettique provoque une dystrophie musculaire facioscapulohumérale. 25 Dans cette étude, l'expression de Fxr1 a été réduite dansreinsdes rats SHR et SHRSP et était exprimé dans le cytoplasme tubulaire d'origine mésodermique, qui est le même que celui du muscle squelettique, et peut être impliqué dans la prolifération et la croissance des cellules tubulaires. Le PPAT forme un homotétramère en forme de beignet et devient un homotétramère inactivé en se liant aux nucléotides puriques pour affecter le métabolisme de l'acide urique. Dans cette étude, l'expression de PPAT a été augmentée dans lereinsdes rats SHR et SHRSP, et la PPAT a été localisée dans le cytoplasme et le noyau des cellules tubulaires. Étant donné que l'acide urique a une forte toxicité vasculaire et est un facteur de risque indépendant d'artériosclérose. Ainsi, une fonction PPAT aberrante pourrait être associée aux caractéristiques physiopathologiques du SHR.
Cette étude a appliqué des analyses de séquence et d'expression et des expériences sur des cellules cultivées dans une nouvelle tentative pour affiner les molécules qui sont liées à la régulation de la pression artérielle et qui sont contrôlées par l'horloge biologique. De plus, Fxr1 et Ppat sont contrôlés par l'horloge biologique et sont liés à la régulation de la pression artérielle. Des études complémentaires sont nécessaires pour mesurer et confirmer la variation temporelle de l'expression des gènes Fxr1 et Ppat chez le ratun rein.On s'attend à ce que les mécanismes d'action de ces molécules soient clarifiés. Le contrôle de ces molécules est considéré comme une cible pour le traitement biologique des anomalies de fluctuation de la pression artérielle.
Sur la base des résultats de la présente étude, une possible boucle de rétroaction circadienne dans leun reinde SHR est illustré à la figure 6. PPAT et FXR1 ont une EBOX dans laquelle BMAL1 et CLOCK se lient au promoteur, suggérant qu'ils sont impliqués dans la formation du rythme circadien dans les tubules sous le contrôle des gènes de l'horloge. On considère qu'ils sont impliqués dans la réabsorption et l'excrétion de l'eau et des électrolytes dans les tubules, et qu'ils peuvent affecter l'hypertension et le rythme circadien de la pression artérielle.
Ainsi, PPAT et FXR1 ont été considérés comme des molécules impliquées dans la formation du rythme circadien de la pression artérielle dans leun rein. En ce qui concerne les mécanismes de régulation de la pression artérielle, ces molécules sont des candidats de choix pour des études visant à élucider les mécanismes sous-jacents à la formation du rythme circadien de la pression artérielle.
