Conception in silico d'un vaccin multi-épitope chimère promiscueux contre la tuberculose à Mycobacterium Partie 1

Abstrait

La tuberculose (TB) est une menace mondiale pour la santé, tuant environ 1,5 million de personnes chaque année. L'éradication de Mycobacterium tuberculosis, le principal agent causal de la tuberculose, est de plus en plus difficile en raison de l'émergence de nombreuses souches résistantes aux médicaments. La vaccination est considérée comme un moyen efficace de protéger l'hôte contre les agents pathogènes, mais le seul vaccin antituberculeux cliniquement approuvé, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), a une protection limitée chez les adultes. Il a été découvert que les vaccins multi-épitopes renforcent l'immunité aux maladies en combinant sélectivement des épitopes de plusieurs protéines candidates.

La tuberculose est une maladie infectieuse causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis qui affecte principalement les poumons mais peut également affecter d'autres organes. L'immunité joue un rôle important dans le développement et le traitement de la tuberculose.

En cas d'immunité insuffisante, Mycobacterium tuberculosis peut facilement envahir le corps humain et évoluer vers la tuberculose. Par exemple, un système immunitaire affaibli par certaines maladies ou certains traitements médicaux augmente le risque d'infection tuberculeuse. De plus, des facteurs tels que la malnutrition, une mauvaise qualité de vie et un stress excessif peuvent également affaiblir l'immunité, conduisant au développement de la tuberculose.

Par conséquent, le maintien d'une bonne santé et le renforcement de l'immunité sont très importants pour prévenir la tuberculose. L'immunité peut être renforcée par une alimentation saine, un mode de vie régulier, un exercice physique adéquat et suffisamment de sommeil, ce qui peut réduire efficacement le risque de contracter diverses maladies, dont la tuberculose.

L'immunité est également importante pour le traitement et la guérison lorsque la tuberculose est déjà survenue. Plus le système immunitaire est fort, plus l'organisme peut se défendre efficacement contre une attaque du bacille de la tuberculose et produire suffisamment d'anticorps pour combattre la maladie. Par conséquent, le maintien d'une alimentation adéquate, d'un exercice physique approprié et d'une attitude positive peut améliorer l'immunité et favoriser la récupération.

En conclusion, il existe une forte relation entre l'immunité et la tuberculose. Le maintien d'une bonne santé et le renforcement de l'immunité sont l'un des moyens importants de prévenir et de traiter la tuberculose. Faisons face à la vie positivement, maintenons un mode de vie sain et restons à l'écart des maladies. De ce point de vue, nous devons améliorer notre immunité. Cistanche peut améliorer considérablement l'immunité, car la cendre de viande contient une variété de composants biologiquement actifs, tels que des polysaccharides, deux champignons, Huang Li, etc. Ces composants peuvent stimuler le système immunitaire. Différents types de cellules du système augmentent leur activité immunitaire.

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Cette étude visait à concevoir un vaccin multi-épitope contre la tuberculose en utilisant une approche immuno-informatique. Grâce à l'enrichissement fonctionnel, nous avons identifié huit protéines sécrétées par M. tuberculosis qui sont soit nécessaires à la pathogenèse, soit sécrétées dans l'espace extracellulaire, soit les deux. Nous avons ensuite analysé les épitopes de ces protéines et sélectionné 16 épitopes de lymphocytes T auxiliaires ayant une activité inductrice d'interféron, 15 épitopes de lymphocytes T cytotoxiques et 10 épitopes de cellules B linéaires, et les avons conjugués avec un adjuvant et l'épitope de liaison Pan HLA DR (PADRE) en utilisant des méthodes appropriées. liens.

De plus, nous avons prédit la structure tertiaire de ce vaccin, son interaction potentielle avec le récepteur Toll-Like -4 (TLR4) et la réponse immunitaire qu'il pourrait susciter. Les résultats ont montré que ce vaccin avait une forte affinité pour le TLR4, qui pouvait stimuler significativement les cellules CD4 plus et CD8 plus pour sécréter des facteurs immunitaires et les lymphocytes B pour sécréter des immunoglobulines, afin d'obtenir une bonne immunité humorale et cellulaire. Dans l'ensemble, cette protéine multi-épitope a été prédite comme étant stable, sûre, hautement antigénique et hautement immunogène, ce qui a le potentiel de servir de vaccin mondial contre la tuberculose.

1. Introduction

La tuberculose (TB), une maladie hautement contagieuse causée par Mycobacterium tuberculosis, est classée par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) comme la principale cause de décès due à un seul agent infectieux [1–3]. En 2021, le nombre estimé de décès dus à la tuberculose et de nouveaux cas a atteint respectivement 1,6 million et 10,6 millions [4]. Actuellement, le traitement clinique de la tuberculose est relativement rare et la combinaison de plusieurs médicaments antimicrobiens est principalement utilisée.
Ce cycle de chimiothérapie est très long, prenant généralement neuf à douze mois, voire plus [5], ce qui augmente le risque de mutations résistantes aux médicaments chez M. tuberculosis [6,7]. Ces dernières années, la chimiothérapie est devenue moins efficace en raison de l'émergence et de la proportion croissante de M. tuberculosis multi-résistants et ultra-résistants [6]. Empêcher la tuberculose de se développer peut être plus efficace que de la traiter. La vaccination est bien connue pour être un moyen efficace de protéger l'hôte des bactéries pathogènes [8].

Actuellement, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), développé il y a plus de 100 ans, est le seul vaccin antituberculeux cliniquement approuvé [9]. Malheureusement, le BCG ne protège que les nouveau-nés et les nourrissons et est largement inefficace contre les adolescents et les adultes [2,10], bien que l'OMS signale que 89 % des cas de tuberculose en 2021 étaient des adultes [4]. Par conséquent, il est urgent de développer un nouveau vaccin antituberculeux efficace, en particulier pour les adolescents et les adultes.

Le développement d'un vaccin contre la tuberculose est compliqué par de multiples caractéristiques des mycobactéries, telles que l'infection latente, la persistance et l'évasion immunitaire [11–13]. Un vaccin antituberculeux idéal devrait être conçu pour cibler les protéines/voies responsables de ces propriétés chez M. tuberculosis et être capable d'induire efficacement des réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus [14].

De plus, un vaccin efficace devrait également cibler les complexes majeurs d'histocompatibilité (MHC) de l'hôte, qui sont hautement polymorphes [15]. Ces caractéristiques mettent en avant des exigences très élevées pour la polyvalence du vaccin, qui ne peuvent évidemment pas être atteintes par une seule protéine naturelle. Le vaccin multi-épitope, une protéine recombinante constituée d'une série d'épitopes (peptides) qui se chevauchent [16], est un nouveau type de vaccin candidat qui peut résoudre les problèmes ci-dessus.

Ces dernières années, les vaccins multi-épitopes ont attiré beaucoup d'attention en raison de leurs avantages d'une immunité plus élevée et d'une plus faible allergénicité que les vaccins conventionnels [17,18]. Actuellement, des vaccins multi-épitopes ont été conçus contre de nombreux micro-organismes pathogènes, dont Shigella spp. [19], virus de la fièvre aphteuse [20], Helicobacter pylori [21,22], virus de l'hépatite B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], virus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] et le virus de la leucose [29].

En particulier, l'émergence de la pandémie de COVID-19 a renforcé l'application de cette technologie [16,30–32]. Comme pour la tuberculose, plusieurs vaccins multi-épitopes ont été conçus pour cibler la tuberculose intrinsèquement active [33–39] et la tuberculose latente [40,41]. Parmi eux, trois vaccins candidats ont été conçus sous forme d'ADN [34,36,40], et deux d'entre eux ont incorporé des épitopes dans les squelettes protéiques pour générer des vaccins recombinants [34,36].

Il convient de noter que les protéines candidates pour certains des vaccins multi-épitopes ci-dessus sont sélectionnées au hasard, et la couverture de la population de ces vaccins nécessite des études supplémentaires.

De plus, deux vaccins candidats multi-épitopes contre la tuberculose avec une large couverture de la population ont été conçus, un épitope a été sélectionné à partir de protéines de vésicules d'exosomes immunogènes aux propriétés pathogènes [39], et l'autre ne se concentre pas sur les protéines candidates, mais sélectionne directement des protéines hautement conservées et validées expérimentalement. épitopes de la Immune Epitope Database (IEDB) [38]. Cependant, ces protéines candidates manquent d'enrichissement fonctionnel et la capacité des candidats vaccins à induire la sécrétion d'interféron (IFN-) reste à améliorer.

Une étude précédente a déduit que l'optimisation rationnelle des épitopes peut être obtenue par une combinaison de la capacité de liaison du CMH et de la capacité de l'épitope à réagir avec les récepteurs des lymphocytes T [42]. En outre, ils ont prédit que les vaccins contenant les épitopes de liaison des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) A1, A2, A3, A24 et B7 auraient une couverture de près de 100 % dans les principaux groupes ethniques (Noirs, Asiatiques, Hispaniques et Caucasiens).

Cependant, jusqu'à présent, il n'y a pas eu d'approche similaire pour concevoir un vaccin contre la tuberculose. Dans cette étude, nous avons conçu un vaccin antituberculeux multi-épitope hautement promiscuité en utilisant diverses caractéristiques antigéniques de huit protéines enrichies en fonctions. Le vaccin candidat chimérique possède 15 épitopes CTL, 16 épitopes de lymphocytes T auxiliaires (HTL) dotés de propriétés inductrices d'IFN- -et 10 épitopes de lymphocytes B linéaires. L'analyse immuno-informatique a démontré que ce vaccin candidat était "global", ce qui en fait une pierre angulaire potentielle pour la réalisation de la "stratégie de fin de la tuberculose".

2. Matériels et méthode

2.1. Sélection de protéines et récupération de séquences

Pour construire un vaccin multi-épitope contre la tuberculose, nous avons d'abord sélectionné des protéines du complexe M. tuberculosis, qui sont déposées dans la base de données IEDB [43] et ont été validées comme épitopes de liaison au CMH de classe I et II. Les séquences d'acides aminés (structure primaire) des protéines de la souche M. tuberculosis H37Rv ont été obtenues à partir de la base de données UniProt [44]. Des prédictions indépendantes de l'alignement des antigènes prospectifs basées sur les propriétés physicochimiques ont été obtenues à partir du serveur VaxiJen 2.0 [45], qui a subi une transformation automatique et à covariance croisée (ACC) des séquences protéiques en un vecteur uniforme d'acides aminés majeurs. propriétés, avec le seuil d'antigénicité fixé à 0.4 pour chaque protéine bactérienne [45,46].

L'annotation fonctionnelle des protéines a été évaluée à l'aide de la base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée (DAVID) 6.8 [47]. Les protéines sécrétées ont ensuite été enrichies en utilisant deux catégories : l'espace extracellulaire et la pathogenèse via les bases de données DAVID et BioCyc [48], respectivement. Le protéome d'Homo sapiens GRCh38.p13 a été téléchargé au format FASTA à partir de la base de données du National Center for Biotechnology Information (NCBI) [49]. BLASTp a été utilisé pour prédire l'homologie (valeur E =1e-5) entre les protéines sécrétées et les protéines de H. sapiens.

2.2. Prédiction de l'épitope des lymphocytes T

La prédiction et la sélection des épitopes sont des étapes cruciales dans la construction de vaccins multi-épitopes. Les molécules du CMH I se lient à des peptides courts (9 à 11 acides aminés) car la fente de liaison aux peptides des molécules du CMH I consistant en une seule chaîne est fermée [50]. Le NetMHCpan-4.1 [51] librement accessible a été utilisé pour la prédiction des épitopes CTL, qui utilise NNAlign_MA pour générer des classements en pourcentage (rang en pourcentage) basés sur une combinaison d'affinités de liaison au CMH I et de ligands élués .

Le « classement en pourcentage » d'une séquence de requête a été déterminé en comparant son score de prédiction à la distribution des scores de prédiction pour le CMH pertinent calculé à l'aide d'un ensemble de peptides natifs choisis au hasard. Les épitopes avec un classement en pourcentage < 0,5 % étaient considérés comme des liants forts, tandis que les épitopes avec un classement en pourcentage < 2 % étaient considérés comme des liants faibles [51].

Bien que jusqu'à 12 épitopes de supertype MHC de classe I puissent être prédits sur le serveur, nous n'avons utilisé que A1, A2, A3, A24 et B7 car ces cinq supertypes couvrent 100 % des principales races humaines [42] . Nous avons sélectionné des liants puissants et prédit leur antigénicité à l'aide de VaxiJen2.0 [45], puis nous avons prédit l'immunogénicité de classe I à l'aide de l'International Epitope Database (IEDB) [52], qui utilise une validation croisée 3- fois.

Enfin, nous avons classé les épitopes qui étaient à la fois antigéniques et immunogènes selon le classement en pourcentage et avons sélectionné 15 épitopes à faible score, trois pour chaque supertype et au moins un pour chaque protéine candidate, à l'exception d'une protéine candidate qui ne pouvait pas avoir un épitope de liaison CTL fort. qui est antigénique et immunogène. Enfin, les valeurs IC50 pour chaque épitope CTL ont été prédites à partir de NetMHC-4.0 [53].
Les molécules du CMH de classe II se lient aux peptides antigéniques et le complexe résultant peut être reconnu par HTL. Typiquement, les peptides antigéniques ont une longueur de 12 à 20 résidus d'acides aminés, mais des peptides de 13 à 16 résidus de longueur sont fréquemment observés [54].

Les {{0}}mers étaient les épitopes du CMH II les plus abondants pour M. tuberculosis et ont été déposés à l'IEDB. En conséquence, nous avons utilisé le NetMHCIIpan-4.0 [51,55] pour prédire la liaison des peptides 15-mer à l'antigène leucocytaire humain-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, et H-2–1 allèle. La prédiction était également basée sur NNAlign_MA avec un classement en pourcentage de < 2 % et < 10 % considérés comme des liants forts et faibles, respectivement [51].

En outre, nous avons prédit des épitopes 15-mères induisant l'IFN pour les protéines candidates à l'aide du serveur IFNepitope [56], qui utilise une approche hybride de machine à vecteur de support qui permet le criblage virtuel de l'IFN - -peptide/épitope induisant l'IFN dans un peptide bibliothèque composée de liants MHC II inductibles et non inductibles par l'IFN - - qui activent les cellules T auxiliaires. Nous avons ensuite prédit l'antigénicité des épitopes induisant l'IFN [45], et enfin, nous avons sélectionné les 16 épitopes les plus proches qui se lient fortement au MHC-II, induisent l'IFN et antigéniques.

Il est important de noter que les peptides signal ont été retirés des protéines candidates avant la prédiction de l'épitope. Dans cette étude, les peptides signal ont été criblés en utilisant SignalP 5.0 [57] et TargetP2.0 [58].

2.3. Prédiction linéaire des épitopes des lymphocytes B

Les épitopes linéaires des lymphocytes B (16-mers) ont été prédits à l'aide d'ABCpred [59,60] avec un seuil par défaut de 0.51. De plus, pour augmenter la fiabilité des résultats de prédiction, nous avons également utilisé BepiPred 2.0 [61] pour prédire les épitopes linéaires des lymphocytes B. Les épitopes obtenus à partir de ces deux logiciels ont ensuite été soumis à une prédiction d'antigénicité à l'aide de VaxiJen2.0 [45]. Enfin, nous avons sélectionné dix épitopes linéaires de lymphocytes B sur la base de scores ABCpred élevés et d'antigénicité, avec au moins un épitope sélectionné pour chaque protéine candidate.

2.4. Construction du candidat vaccin multi-épitope aux propriétés chimériques

Le vaccin multi-épitope conçu contient un adjuvant HBHA (heparin-binding hemagglutinin), un épitope Pan HLA DR-binding (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 épitopes de cellules B linéaires et une étiquette His × 6 (Fig. 3). Des lieurs ont été utilisés pour joindre des épitopes, empêcher la production d'épitopes de jonction et améliorer la procession et la régénération d'épitopes individuels dans des vaccins chimériques [62].

Pour la construction de ce candidat vaccin, l'adjuvant HBHA (UniProt ID : P9WIP9) était situé à l'extrémité N-terminale et lié au PADRE en aval via un linker EAAAK. Ensuite, les épitopes HTL joints par les linkers GPGPG ont été liés à PADRE. De plus, les épitopes CTL joints par le lieur AAY ont été connectés aux épitopes HTL via le lieur HEYGAEALERAG, qui a également joint l'unité d'épitope CTL aux épitopes linéaires de lymphocytes B liés à l'aide de lieurs KK. Enfin, une étiquette His x 6 a été attachée à l'extrémité C-terminale de la protéine chimère.

2.5. Antigénicité, allergénicité et propriétés physicochimiques

L'antigénicité du vaccin à épitopes multiples et des huit protéines composantes a été prédite par le serveur VaxiJen 2.0 [45], tandis que l'allergénicité de ces protéines a été prédite par le serveur AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 utilise les descripteurs E d'acides aminés, la transformation ACC des séquences protéiques et les k-plus proches voisins (kNN) pour la classification des allergènes.

La méthode a atteint une précision de 85,3 % avec une validation croisée 5- fois. Pour la prédiction des propriétés physicochimiques telles que la demi-vie, le point isoélectrique, l'indice d'instabilité, l'indice aliphatique et la grande moyenne d'hydropathie (GRAVY) de ce vaccin à épitopes multiples, le serveur ExPASy ProtParam [64] a été utilisé.
En outre, la solubilité du peptide vaccinal multi-épitope a été évaluée à l'aide du serveur proteinSol (PROSO II) [65] basé sur un classificateur exploitant les différences subtiles entre les protéines insolubles bien connues de TargetDB et les protéines solubles de TargetDB et PDB [ 66]. Lorsqu'il a été évalué à l'aide d'une validation croisée 10- fois, il a atteint une précision de 71,0 % (aire sous la courbe ROC=0.785).

2.6. Simulation immunitaire

Pour caractériser le profil de réponse immunitaire et l'immunogénicité du vaccin, des simulations immunitaires in silico ont été réalisées à l'aide du serveur C-ImmSim [67]. C-ImmSim prédit les interactions immunitaires à l'aide de matrices de notation spécifiques à la position dérivées de techniques d'apprentissage automatique pour la prédiction des peptides.
Il simule simultanément trois compartiments représentant trois régions anatomiques distinctes trouvées chez les mammifères : (i) la moelle osseuse, où les cellules souches hématopoïétiques ont été simulées pour produire de nouveaux lymphocytes et cellules myéloïdes ; (ii) le thymus, où les lymphocytes T naïfs ont été sélectionnés pour éviter l'auto-immunité ; et (iii) l'organe lymphatique tel que les ganglions lymphatiques.

Pour amorcer et stimuler efficacement le vaccin, nous avons suivi l'approche de [68] où deux injections ont été administrées à quatre semaines d'intervalle. Tous les paramètres de simulation ont été définis sur des valeurs par défaut, avec des pas de temps définis sur 10 et 94 (chaque pas de temps est de huit heures).

2.7. Prédiction de région désordonnée

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont présentes dans de nombreuses protéines. La région désordonnée a été prédite à l'aide de DISOPRED3 [69], qui utilise DISOPRED2 et deux autres modules basés sur l'apprentissage automatique formés sur de grands IDR pour identifier les résidus désordonnés. Ils étaient alors anno

2.8. Prédiction de structure secondaire et tertiaire

La structure secondaire du vaccin conçu a été prédite par le serveur PSIPRED 4.0 [70], qui utilise d'abord PSI-BLAST pour identifier des séquences étroitement liées à la protéine de requête. La structure tertiaire de ce vaccin a été prédite à l'aide du serveur I-TASSER (Iterative Threading Assembly Refinement) [71].

Il y a quatre étapes clés dans la modélisation ITASSER ; a) identification du modèle de filetage ; b) simulation itérative d'assemblage de structure; c) sélection et raffinement du modèle ; et d) annotation fonctionnelle basée sur la structure [72, 73].

I-TASSER a généré cinq modèles, qui ont été examinés à l'aide de ProSA-web [74], et le modèle avec le score Z le plus bas a été sélectionné pour être affiné. ProSA-web compare les scores de modèles obtenus à partir de structures vérifiées expérimentalement déposées dans PDB. Un tracé de score de qualité local aide à identifier les zones problématiques dans le modèle, et les mêmes scores ont été représentés à l'aide d'un code couleur sur la présentation de la structure 3D. Ceci est utile pour la détermination et le raffinement structurels précoces.

2.9. Raffinement de la structure tertiaire

Le modèle 3D "grossier" du candidat vaccin obtenu par ITASSER a été affiné en deux étapes à l'aide de deux serveurs ; d'abord avec ModRefiner [75] suivi de GalaxyRefine [76]. ModRefiner utilise des traces C pour affecter la construction et le raffinement des protéines obtenues par minimisation de l'énergie au niveau atomique en deux étapes.

Tout d'abord, les traces C ont été utilisées pour construire la chaîne principale, suivies du raffinement des rotamères de la chaîne latérale et des atomes du squelette à l'aide de champs de force composites basés sur la physique et les connaissances. GalaxyRefine utilise plusieurs modèles pour générer des structures de base fiables, tandis que des boucles ou des terminaux non fiables ont été générés par une modélisation basée sur l'optimisation.

2.10. Validation d'ouvrages tertiaires

La structure affinée du candidat vaccin a été validée par des tracés de Ramachandran générés à partir des bases de données PROCHECK [77] et MolProbity [78]. Les tracés de Ramachandran évaluent la conformation du squelette des protéines en divisant les résidus d'acides aminés en deux régions : autorisées et non autorisées. PROCHECK utilise la stéréochimie pour évaluer la qualité nette des structures protéiques en les comparant aux structures raffinées à la même résolution, puis en présentant les régions nécessitant une analyse plus approfondie.

Molprobity valide les modèles de macromolécules locales et globales (protéines et acides nucléiques) par une combinaison de critères de rayons X, de RMN, de calcul et de cryoEM [79]. La puissance et la sensibilité pour optimiser le placement de l'hydrogène et l'analyse de contact de tous les atomes sont largement utilisées dans une version mise à jour des critères de géométrie covalente et d'angle de torsion [80].

2.11. Epitopes B discontinus

Les épitopes discontinus des lymphocytes B dans la structure protéique native ont été prédits à l'aide d'ElliPro [81]. ElliPro implémente trois algorithmes pour approximer la forme des protéines sous forme d'ellipsoïde, calcule l'indice de protrusion des résidus (PI) et regroupe les résidus voisins en fonction de leurs valeurs PI. ElliPro fournit à chaque épitope de sortie un score décrit comme la valeur PI moyenne pour le résidu d'épitope. Un ellipsoïde avec une valeur PI de 0.9 se compose de 90 % des résidus protéiques contenus, tandis que les 10 % restants de résidus se trouvent à l'extérieur de l'ellipsoïde. Pour chaque résidu d'épitope, la valeur PI est calculée à partir du centre de masse du résidu situé à l'extérieur de l'ellipsoïde le plus grand possible.

2.12. Amarrage moléculaire de protéines chimériques

L'amarrage moléculaire du vaccin conçu (ligand) avec le récepteur immunitaire Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID : 3FXI) a été réalisé à l'aide de Patchdock [82]. Les 10 meilleurs modèles ont ensuite été affinés à l'aide de FireDock [83]. PatchDock remplace la représentation de surface des points Connolly des molécules par des patchs concaves, convexes et plats.

Les modèles ont ensuite été notés en fonction de l'ajustement géométrique et de la désolvatation atomique. [82]. FireDock optimise les conformations de la chaîne latérale et l'orientation du corps rigide et génère une sortie d'un complexe raffiné 3D basé sur l'énergie de liaison [83]. Nous avons sélectionné le premier modèle de Firedock basé sur l'énergie globale comme complexe d'amarrage. Enfin, l'énergie de liaison et le contenu de dissociation au sein du complexe d'amarrage ont été prédits à l'aide du serveur PRODIGY [84].

2.13. Simulation de dynamique moléculaire

Des simulations de dynamique moléculaire ont été effectuées sur des protéines à l'aide du serveur Web rapide et librement accessible, du serveur d'analyse en mode normal des coordonnées internes (iMODS) [85], et des résultats d'amarrage cohérents et optimaux ont été obtenus à partir du serveur PatchDock-FireDock. En coordonnées internes, l'analyse en mode normal (NMA) génère des mouvements collectifs critiques pour la fonction macromoléculaire. iMODS présente des mécanismes pour explorer ces modes comme l'analyse des vibrations, les animations de mouvement et les trajectoires de morphing qui ont été réalisées de manière presque interactive à différentes résolutions [85].

2.14. Traduction inverse, optimisation des codons et clonage in silico du vaccin

Pour exprimer efficacement le vaccin candidat dans les cellules d'Escherichia coli, l'ADNc a été généré in silico par optimisation des codons et traduction inverse à l'aide de l'outil Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

L'optimisation impliquait (i) d'éviter les terminateurs transcriptionnels rho-indépendants, ii) d'éviter les sites de liaison des ribosomes procaryotes, (iii) d'éviter le site de clivage des enzymes de restriction NcoI et XhoI, qui sert de sites de restriction N-terminaux et C-terminaux pour l'insertion d'ADNc modèle de vaccin, et (iv) seulement une optimisation partielle pour appliquer la mutagenèse dirigée. L'indice d'adaptation de codon (CAI) et la teneur en GC ont prédit la qualité de l'ADNc avec un codon d'arrêt opale (TGA) inséré après l'étiquette His × 6. Ensuite, le fragment d'ADN optimisé du candidat vaccin chimérique a été intégré dans le brin inverse de pET-28a( plus ) à l'aide de l'outil SnapGene [87].

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