Les nanozymes imitant la catalase détectant l'inflammation atténuent les lésions rénales aiguës en inversant le stress oxydatif local

Abstrait

Contexte : Leespèces réactives de l'oxygène (ROS)et l’infammation, un contributeur essentiel aux lésions tissulaires, est bien connue pour être associée à diverses maladies. Le rein est sensible à l’hypoxie et vulnérable aux ROS. Ainsi, le cercle vicieux entrestress oxydatifet rénall'hypoxie contribue de manière critiqueà la progression demaladie rénale chroniqueet enfin,insuffisance rénale terminale. Ainsi, l’administration d’agents thérapeutiques au site d’information riche en ROS et la libération des agents thérapeutiques constituent une solution réalisable.

Nouvelles herbes pour les maladies rénales

Résultats : Nous avons développé une nano-plateforme polyvalente à circulation plus longue, détectant l'inflammation et éliminant les ROS, en chargeant de manière stable du Mn3O4 (dMn) stabilisé par le 1-dodécanethiol imitant la catalase.3O4) nanoparticules à l'intérieur de nanomi‑ sensibles aux ROScellules (PTC), aboutissant à un nanozyme sensible aux ROS (PTC-M). DMn hydrophobe3O4des nanoparticules ont été chargées à l'intérieurMicelles PTC pour empêcher la libération prématurée pendant la circulation et agir comme un agent thérapeutique en réponse aux ROSlibération du dMn chargé3O4une fois qu'il a atteint le site d'information.

Mots-clés :Nanoparticules Mn3O4, Nanozymes, Infammation,Ischémie-reperfusion, Rein

Arrière-plan

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 fois par rapport au départ dans les sept jours ou une réduction du volume urinaire de<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Lésion d'ischémie-reperfusion (IRI)est une lésion d'un organe causée par la réduction ou l'arrêt transitoire du flux sanguin, suivie d'une reperfusion, et peut être rencontrée dans diverses situations cliniques, telles qu'un choc, un infarctus du myocarde, un accident vasculaire cérébral ischémique, une intervention chirurgicale majeure et une transplantation d'organe. L'IRI rénale est l'une des principales causes d'AKI, qui entraîne un déclin rapide de la fonction rénale. Le rein est un organe particulièrement sensible aux agressions ischémiques et les cellules épithéliales tubulaires blessées entraînent par la suite une altération de l'excrétion des déchets et un contrôle de l'équilibre hydrique, électrolytique et acido-basique [6]. Le mécanisme de lésion des cellules tubulaires rénales dans l'IRI est connu pour impliquer une inflammation causée par des espèces réactives de l'oxygène (ROS) générées lors de la reperfusion (6–8). Par conséquent, des tentatives ont été faites pour appliquer le nettoyage des ROS au traitement de l’IRI. Cependant, son utilisation clinique réelle a été limitée en raison de préoccupations concernant les effets secondaires systémiques, qui incluent des réactions d'hypersensibilité [9]. L'administration d'antioxydants tels que l'édaravone a déjà été utilisée pour éliminer les ROS dans l'IRI. Cependant, cela s'est accompagné de plusieurs effets secondaires et, par conséquent, des demandes pour de nouveaux antioxydants efficaces tels que les nanozymes (nanomatériaux présentant une activité naturelle semblable à celle d'une enzyme) ont été formulées [9-13]. Yao et coll. ont découvert que les particules Mn3O4 nan possédaient de multiples activités imitant les enzymes, c'est-à-dire des activités imitant la superoxyde dismutase et la catalase, ainsi qu'une activité de piégeage des radicaux hydroxyles (11). Il a été démontré que le Mn3O4 possédait une capacité d'élimination des ROS plus forte que d'autres enzymes telles que V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 et Fe3O4 et était meilleure que celle des autres types d'oxyde de manganèse (MnOx (MnO2, MnO et Mn2O3).

Fig. 1 Illustration schématique montrant la préparation et le mode d'action du PTC-M A Synthèse du PTC-M, B Mécanisme d'action du PTC-M (1) injection intraveineuse de PTC-M (2) le PTC-M injecté circule dans le sang et accumule au niveau du site d'inflammation (3) la déstabilisation du PTC-M en raison des ROS intrinsèques présentes sur le site d'inflammation (4) libération du dMn 3O4 chargé au site d'inflammation (5) le dMn3O4 libéré catalyse le piégeage des ROS conduisant à (6) réduction de l'inflammation, de l'apoptose et de la fibrose (7) atténuation des lésions rénales et (8) amélioration des fonctions rénales

Résultats

Synthèse et caractérisation de nanoparticules dMn3O4 et de conjugués polymères

Les NP Te dMn3O4 ont été synthétisées à l'aide de la méthode de coprécipitation et stabilisées à l'aide de groupes thiol de 1-dodécanethiol (Fig. 2A). L'analyse par microscopie électronique à transmission à émission de champ (FE-TEM) a démontré que les NP dMn3O4 avaient une taille moyenne inférieure à 2{{10}} nm (18,0±0,6 nm) (Fig. 2B ). Fichier supplémentaire 1 : Les figures S1A et S1B montrent les images et la représentation schématique du dMn3O4 préparé. Les données de spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (EDS) ont montré la présence de Mn provenant de Mn3O4 et de soufre et de carbone provenant de SH-C12 (Fig. 2C et fichier supplémentaire 1 : Figure S1C). Les résultats de l'analyse par spectroscopie de photons à rayons X (XPS) ont représenté le spectre XPS de Mn 2p, composé de deux pics situés à 641,42 eV et 653,23 eV et ces pics ont été attribués à Mn 2p3/2 et Mn 2p1/2, respectivement (Fig. .2D et fichier supplémentaire 1 : Figure S2). L'écart énergétique entre ces deux pics était de 11,81 eV, ce qui était en bon accord avec la littérature rapportée pour le Mn3O4. Dans le diagramme de diffraction des rayons X sur poudre (DRX) des NP dMn3O4, comme le montre la figure 2E, tous les pics de diffraction mesurés correspondaient bien au diagramme standard de l'hausmannite Mn3O4 [ICDD : #001-1127], confirmant leur caractère hautement cristallin. nature. Le conjugué PTC sensible aux ROS a été préparé via des réactions chimiques par étapes où le lieur thiocétal (TK) avec un groupe carboxylate terminal a été dimensionné en premier. Le groupe carboxylique du lieur TK a ensuite été conjugué au groupe amino de la méthoxy-PEG amine (PEG-AM) en utilisant la réaction EDC/NHS pour former du PEG-TK. Enfin, l’autre groupe carboxylique du PEG-TK a été à nouveau conjugué au groupe amino de la stéaramine via la réaction EDC/NHS [15]. Le conjugué PC non sensible aux ROS a été préparé en conjuguant l'acide stéarique au PEG-AM. La composition du PTC et du PC a été analysée par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) 1 H (fichier supplémentaire 1 : figure S3). Les spectres RMN ont montré des pics caractéristiques à δ 0,83 et 1,23 ppm correspondant aux protons méthyle et méthylène de C18. Le pic à δ 3,6 correspondait à O – CH2 – CH2- de PEG. Le degré de substitution (DS %) du C18 dans le PTC et le PC a été calculé à 78 % et 46 %, respectivement.

Préparation et caractérisation de l'enzyme PTC-M

Les nanomicelles (PTC) sensibles aux ROS ont été chargées de dMn3O4, ce qui a donné lieu au PTC-M. Le rapport d'alimentation en dMn3O4 (20 %) de PTC a été utilisé pour la préparation de PTC-M. Le diamètre hydrodynamique, le potentiel zêta et les images FE-TEM du PTC et du PTC-M préparés sont présentés sur la figure 3A et le fichier supplémentaire 1 : figure S4A. Les images FE-TEM de PTC ont démontré des nanomicelles sphériques avec des tailles de particules uniformes. Le diamètre hydrodynamique du PTC-M a légèrement augmenté après le chargement de dMn3O4 en raison de l'accumulation de dMn3O4 dans l'espace hydrophobe, tandis que le potentiel zêta est resté négatif dans les deux nanomicelles en raison du blindage PEG. Les images FE-TEM de PTC et PTC-M montraient des particules uniformément réparties. Le contenu de chargement et l'efficacité d'encapsulation ont été calculés à l'aide d'une analyse spectrométrique de masse et ont été calculés comme étant respectivement de 10 ± 3 % et 17 ± 6 %. La présence de dMn3O4 était visible dans les images FE-TEM de PTC-M (Fig. 3A), ce qui a été confirmé par l'analyse EDS de PTC-M, montrant le Mn de Mn3O4, le soufre et le carbone de SH-C12 et le carbone. , l'azote et l'oxygène du PEG (fichier supplémentaire 1 : figure S5). Une analyse thermogravimétrique (TGA) a été effectuée et la charge en dMn3O4 a été calculée à 12 % (fichier supplémentaire 1 : figure S6B). Des micelles non sensibles aux ROS chargées de dMn3O4 (PC-M) ont également été préparées comme contrôles par la même méthode.

Pour confirmer le rôle de la liaison TK dans la déstabilisation de PTC-M sensible aux ROS et la libération de dMn3O4, PTC-M a été exposé aux conditions de ROS en ajoutant du H2O2. Comme contrôles, nous avons utilisé le PC-M non sensible au ROS. Le PTC-M et le PC-M présentaient tous deux une morphologie sphérique avec du dMn3O4 étroitement emballé dans les nanomicelles, mais après le traitement au H2O2, le supra-assemblage du PTC-M a été déformé, suivi de la libération de dMn3O4, qui a ensuite été agrégés comme le montrent les images FE-TEM, alors que le PC-M présentait des structures stables même après exposition au H2O2 (Fig. 3B et fichier supplémentaire 1 : Figure S4B). La susceptibilité aux ROS du PTC-M a été confirmée en comparant les modifications du diamètre hydrodynamique et du potentiel zêta avec le PC-M, comme le montre le fichier supplémentaire 1 : Figure S7. Le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta du PC-M non sensible aux ROS n'ont montré aucune différence perceptible après l'ajout de H2O2. Cependant, le PTC-M sensible aux ROS a montré des tailles hydrodynamiques réduites, probablement en raison de la suppression du blindage PEG via la rupture du TK, entraînant la déstabilisation de la structure. Après l’ajout de H2O2, le potentiel zêta est passé d’une charge négative à une charge positive, ce qui pourrait être dû à l’élimination du PEG et à l’exposition à la vapeur. Nous avons ensuite étudié la variation de taille en vérifiant la stabilité dans le temps en suivant les diamètres hydrodynamiques en présence ou en absence de H2O2 (Fig. 3C). Après l'ajout de H2O2, les diamètres hydrodynamiques ont diminué de manière significative en 10 s sans autre changement jusqu'à six jours, alors que le PTC-M seul a montré des tailles stables au cours de l'expérience, suggérant la bonne stabilité colloïdale du PTC-M. Nous avons également vérifié la stabilité dans 10 % de FBS et observé que le PTC-M présentait une bonne stabilité jusqu'à 4 jours (fichier supplémentaire 1 : figure S9). Les diamètres hydroxy dynamiques et la variation du potentiel zêta ont également été confirmés avec des nanomicelles vides sensibles aux ROS et non sensibles (PTC et PC) (fichier supplémentaire 1 : figure S8). Toutes ces études comparatives en présence ou en absence de ROS ont démontré la stabilité et la sensibilité aux ROS des nanomoles préparées ou de l'enzyme dMn3O4 PTC-M finale.

Fig. 2 Synthèse et caractérisation de dMn3O4 Une illustration schématique de la synthèse de dMn 3O4, des images B FE-TEM, de l'analyse C EDS, du spectre D XPS et des modèles E XRD des NP dMn3O4

Nous avons en outre vérifié la propriété d’élimination de H2O2 de l’enzyme PTC-M finale en raison de la charge de NP en dMn3O4. Cela a été testé en utilisant de l’acide téréphtalique (TA) comme sonde de centimes à terme. TA a réagi avec H2O2 pour former de l'acide phtalique 2-hydroxytère avec un pic fluorescent à 425 nm. Le dMn3O4 convertira le H2O2 en eau et en oxygène et, par conséquent, l'intensité de la fluorescence diminuera, confirmant l'activité catalase, comme le montre la figure 3D. Le Te PTC-M a montré une forte réduction de l’intensité de la fluorescence par rapport à la micelle vide PTC en présence de H2O2 au fil du temps. L'activité de type catalase de la PTC-M dépendait également de la concentration, comme le montre le fichier supplémentaire 1 : figure S10. La capacité de production d'oxygène du PTC-M a ensuite été confirmée à l'aide d'une sonde fluorescente spécifique O2-Ru (DDP) en présence de H2O2. La fluorescence dans dix villes du Ru(DDP) diminue en présence d'O2, suggérant une production efficace d'O2. Comme le montre la figure 3E, l'intensité de fluorescence du Ru (DDP) a diminué en présence de H2O2 dans le groupe PTC-M, alors que la présence de H2O2 dans le groupe PTC seul a montré une faible diminution de la fluorescence (Fig. 3F), confirmant l'activité catalase entraînant la production d'oxygène dans PTC-M. Enfin, nous avons confirmé la propriété d'élimination de H2O2 du PTC-M à l'aide d'un détecteur d'oxygène. Comme le montre la figure 3G, la production d'oxygène par PTC-M a augmenté dans le délai initial, suivie d'une lente augmentation alors que les micelles vides PTC n'ont pas montré de production d'oxygène. La dismutation de H2O2 a été observée par la formation de bulles d'oxygène dans le groupe PTC-M, comme le montre le fichier supplémentaire 1 : figure S11A. Il a également été observé que le PTC-M montrait une production d'oxygène plus élevée que le dMn3O4 seul, probablement en raison de l'étroitesse du dMn3O4 dans le PTC-M, le rendant plus disponible pour la réaction par rapport au dMn3O4 libre (fichier supplémentaire 1 : figure S11B). Même si les nanomicelles se sont relâchées en raison du traitement au H2O2, comme le montre le FE-TEM, le dMn3O4 pourrait encore être présent à l'intérieur du PTC-M, ce qui entraînerait une activité catalase élevée par rapport au dMn3O4 libre. Tous ces résultats réunis ont confirmé l’activité supérieure d’imitation de la catalase du PTC-M.

Viabilité cellulaire in vitro et absorption cellulaire

Pour confirmer l'absorption cellulaire et la ville sensible aux ROS de la PTC sensible aux ROS distribuée de manière intracellulaire ainsi que le modèle de libération de la charge utile, nous avons comparé la PTC aux conditions in vitro du PC. Tout d'abord, nous avons vérifié la viabilité cellulaire des PTC, PC, PTC-M et PC-M préparés dans des cellules HK-2 par le test WST-1 (fichier supplémentaire 1 : figure S12). Les micelles vides ont subi peu de mort cellulaire, mais après une charge en dMn3O4-, la viabilité cellulaire a diminué mais le changement n'était pas statistiquement significatif. Étant donné que les micelles vides n’étaient pas cytotoxiques, la légère variation de la viabilité cellulaire pourrait être due au dMn3O4 adsorbé en surface. La valeur IC50 de PTC-M et PC-M a été déterminée comme étant respectivement de 130,41 et 247,17 ug/ml (figure 4A). Pour examiner plus en détail l'absorption intracellulaire et la distribution des nanomicelles, l'IR780 a été utilisé comme médicament modèle et a préparé des nanomicelles PTC chargées d'IR780, PTC-IR780, pour visualiser l'intensité de fluorescence de l'IR780 à l'aide d'une microscopie de présence amusante (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific , États-Unis) (Fig. 4B). En tant que groupe témoin, nous avons également analysé l’absorption du PC-IR780 non sensible aux ROS. Comparé au PC-IR780, le PTC-IR780 a montré une absorption plus élevée dans les cellules HK-2 (fichier supplémentaire 1 : figure S13). La raison exacte derrière l'absorption accrue du PTC-IR780 dans des conditions non ROS n'est pas claire. Cependant, cela pourrait être dû au fait que le PTC pourrait montrer une légère sensibilité au niveau normal de ROS dans des conditions de culture cellulaire, ce qui entraînerait une perte de protection du PEG à la surface. charge légèrement positive. Le PC-IR780 a montré un modèle d'absorption similaire indépendamment des ROS induites par le traitement au H2O2 ou des conditions de ROS induites par l'hypoxie en raison de sa nature non sensible, tandis que le PTC-IR780 a montré un modèle de distribution différent à l'intérieur des cellules, ce qui pourrait être dû à la libération accrue d'IR780. à l'intérieur des cellules. Les données précédentes sur la viabilité cellulaire (fichier supplémentaire 1 : figure S11) montrant une mort cellulaire accrue dans le PTC-M seraient également dues à l'absorption cellulaire accrue du PTC par rapport au PC. L'iodure IR780 est un colorant hautement hydrophobe qui peut montrer une haute affinité envers la membrane cellulaire et montre un signal très lumineux quelle que soit l'exposition aux ROS. L'absorption cellulaire a ensuite été analysée en vérifiant l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) par analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Fig. 4C), qui confortait les données obtenues par microscopie à fluorescence. Comme indiqué, le MFI était le plus élevé dans le groupe PTC IR780 sensible aux ROS par rapport aux autres groupes, confirmant la libération améliorée d'IR780 dans les cellules. Nous avons en outre lié le MFI de divers groupes (Fig. 4D), ce qui étayait les données de microscopie suggérant que le PC-IR780 ne présentait aucune différence significative dans l'absorption cellulaire, même dans des conditions induites par les ROS, alors que le PTC IR780 montrait une augmentation significative de l'absorption cellulaire. absorption lorsqu'il est traité dans des conditions induites par les ROS. L'absorption cellulaire du PTC a également été déterminée en vérifiant le Mn résiduel dans les cellules après traitement avec le PTC-M. Comme le montre la figure 4E, PTC-M a montré une absorption dépendante de la concentration dans les cellules HK-2. Ces résultats résument ainsi l’internalisation accrue des nanomicelles et la libération accélérée à l’intérieur des cellules, probablement dues au désassemblage des nanomicelles médié par les ROS.

Nous avons mené des études in vitro sur des cellules HK-2 pour explorer davantage les effets du PTC-M sur les conditions de stress oxydatif au niveau cellulaire. Les cellules HK-2 ont été stimulées avec H2O2, un ROS représentatif (Fig. 5A). H2O2 a amélioré l'expression de l'hème oxygénase (HO) -1, qui a été améliorée par le co-traitement PTC-M (Fig. 5A). Un test de diacétate de 2′, 7′-dichlorodihydrofuorescéine (DCF DA) a été effectué pour vérifier le schéma de modification des ROS intracellulaires. Les cellules HK -2 stimulées par H2O2 présentaient une intensité de fluorescence élevée, mais après un co-traitement avec PTC-M, l'intensité de fluorescence était diminuée (Fig. 5B). Le rapport BAX / BCL -2 a été augmenté par le traitement au H2O2, qui a également été récupéré par le co-traitement PTC-M, indiquant une protection contre l'apoptose (Fig. 5C). Les cellules HK -2 traitées avec H2O2 ont présenté une augmentation progressive significative de la coloration à l'annexine V + / PI−, qui a été empêchée par PTC-M (Fig. 5D). La phosphorylation de ERK, JNK et p38 induite par H2O 2- a également été supprimée par le co-traitement avec PTC-M, bien qu'une réduction significative de la P38 phosphorylée n'ait pas été observée (Fig. 5C). Ces données suggèrent que la PTC-M a supprimé les processus apoptotiques induits par les ROS dans les cellules épithéliales des tubes rénaux.