Influence de la simulation de digestion humaine in vitro sur la teneur en composés phénoliques et les activités biologiques des extraits aqueux d'espèces de ciste turc Partie 2

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Pour résumer

L'extrait aqueux de C.salvifolius a montré une meilleure activité inhibitrice des enzymes digestives que les extraits d'autres espèces. De plus, les échantillons IN de tous les extraits aqueux ont révélé des activités inhibitrices enzymatiques inférieures à celles des échantillons ND.

2.4.Activité inhibitrice des AGEs

Comme présenté dans le tableau 4, une activité inhibitrice des AGE dépendante de la concentration a été observée dans tous les extraits aqueux. Les échantillons ND de CCA, CPA et CSA ont montré une meilleure activité inhibitrice que la quercétine, le composé de référence, aux concentrations de 0.5 et 1 mg/mL. Cependant, seul l'extrait de C. saluifolius a montré une meilleure activité inhibitrice que la quercétine parmi les échantillons IN des extraits. Les échantillons biodisponibles d'extraits aqueux ont montré des activités inhibitrices d'AGE inférieures à celles des échantillons non digérés. Selon les résultats, l'échantillon ND d'extrait aqueux de C. salvifolius possédait l'activité inhibitrice d'AGE la plus élevée. Cependant, l'échantillon IN d'extrait aqueux de C. monspeliensis présentait le potentiel d'inhibition d'AGE le plus faible aux concentrations testées.

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3. Débat

Les radicaux libres peuvent attaquer les protéines, les lipides ou l'ADN pour se procurer un électron, entraînant divers problèmes de santé. Pour cette raison, il est essentiel d'équilibrer le système antioxydant de l'organisme et les radicaux libres formés par oxydation. En cas de détérioration de cet équilibre, un stress oxydatif apparaît [29]. Le stress oxydatif est l'un des principaux facteurs à l'origine de divers troubles chroniques tels que le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires, la maladie d'Alzheimer, etc. S'il existe dans le corps humain des systèmes auto-antioxydants pour lutter contre leoxydantdommages aux tissus et aux organes, ces systèmes de défense peuvent perdre leur efficacité en raison de différentes conditions telles que la surconsommation d'alcool, le tabagisme, le stress, la consommation chronique de drogues, les radiations, etc. [30]. Divers rapports scientifiques ont indiqué que les métabolites secondaires des plantes jouent un rôle important dans la prévention du stress oxydatif et de ses effets nocifs [13,14,31]Même si la biodisponibilité est un paramètre important affectant la bioactivité de ces composés, il n'a pas été pris en compte dans la plupart des études. Cependant, il est bien connu que les métabolites secondaires sont soumis à des transformations structurelles dues à différentes conditions de pH, d'activité enzymatique et de température corporelle dans le système gastro-intestinal. De plus, les caractéristiques chimiques des métabolites secondaires tels quemoléculairele poids, la polarité et le degré de liaison aux macromolécules dans la matrice végétale sont également des facteurs importants affectant leur biodisponibilité [13]. En conséquence, l'absorption des composés ou de leurs métabolites dans la circulation sanguine une fois ingérés est essentielle pour exercer leurs effets physiologiques systémiques. Les modèles de simulation de digestion in vitro peuvent fournir des preuves pour l'évaluation des caractéristiques de biodisponibilité possibles des substances. Alors que la confirmation dans les essais sur l'homme est nécessaire pour revendiquer toute propriété fonctionnelle, les modèles de simulation in vitro sont largement utilisés comme alternatives aux études in vivo ou aux essais sur l'homme, qui sont souvent discutables sur le plan éthique, gourmandes en ressources, coûteuses et chronophages [32].

Cistanche peut améliorer l'immunité

Plusieurs chercheurs ont également étudié le potentiel antioxydant d'extraits préparés à partir de différents organes d'espèces de Cistus. Selon l'étude de la littérature, il s'agit de la première étude sur les espèces de Cistus concernant la biodisponibilité des substances phénoliques et leur impact sur l'activité antioxydante en utilisant un modèle de simulation de digestion in vitro. Karas et al. [33] ont suggéré que 10 % des composants polyphénoliques restent non digérés dans la matrice végétale et que 90 % d'entre eux sont soumis à une digestion dans la phase gastrique ou intestinale (environ 48 % et 52 %, respectivement). Comme mentionné précédemment, toutes les quantités de composés phénoliques dans les extraits aqueux ont été affectées négativement par la procédure de simulation de digestion humaine in vitro. Ainsi, des pertes importantes ont été détectées dans le contenu phénolique des échantillons biodisponibles de tous les extraits. De plus, les concentrations totales de proanthocyanidines des échantillons IN étaient inférieures à la limite de détection dans tous les extraits aqueux. Diverses études ont également incité l'influence négative de la procédure de digestion sur les composés phénoliques dans les extraits de plantes et donc sur les bioactivités associées. Par exemple, nous avons rapporté le contenu phénolique total de Salvia virgata Jacq. a également été affectée par la procédure de digestion dans notre étude précédente. De plus, les quantités des principaux métabolites de l'extrait, à savoir la rutine et l'acide rosmarinique, avaient tendance à diminuer [13]. En revanche, plusieurs études ont rapporté des résultats contradictoires. Dans l'étude de Celeb et al. [34], ils ont observé l'augmentation des quantités totales d'acide phénolique, de flavonoïdes et de phénols dans les échantillons biodisponibles d'extrait méthanolique d'Hypericum perfoliatum L. En fait, les principaux métabolites, la quercitrine, l'acide chlorogénique et l'acide gallique, avaient des ratios de bioaccessibilité supérieurs à 100 pour cent. Ces études ont montré que les effets de la procédure de digestion pouvaient varier selon les matières végétales. Afin de clarifier ces différences, il est essentiel de considérer le mécanisme d'action du système de digestion sur les substances phénoliques. Serra et al. [35] ont suggéré que les composés phénoliques se trouvent principalement sous forme de glycosides, de polymères et d'esters dans la matrice végétale et sont hydrolysés dans le système digestif avant absorption. Divers facteurs peuvent influencer les transformations structurelles des composés phénoliques dans le tractus gastro-intestinal. Par exemple, les composés avec des poids moléculaires plus élevés, tels que les proanthocyanidines ou les procyanidines, doivent être hydrolysés avant l'absorption dans l'intestin. La structure de la matrice végétale est également un facteur important dans la biodisponibilité des composés phénoliques ; les composés phénoliques peuvent se lier aux macromolécules de la matrice végétale, telles que les fibres, les protéines et les molécules lipidiques. Ainsi, seuls les composants phénoliques libérés de la matrice peuvent devenir absorbables par le tractus gastro-intestinal. De plus, les différentes valeurs de pH et les actions enzymatiques du microbiote intestinal sont parmi les autres facteurs cruciaux affectant la transformation de la structure chimique des composés phénoliques [36]. À la lumière de ces données, nous pouvons émettre l'hypothèse que des résultats différents obtenus à partir de types d'études expérimentales similaires peuvent être dus à la complexité du système de digestion et à la composition de la matrice végétale. Comme présenté dans le tableau 3, les échantillons biodisponibles d'extraits de ciste ont présenté une activité antioxydante plus faible que les homologues non digérés et post-gastriques en raison de leur teneur en phénols plus faible.

De plus, les deux extraits de C. saluifolius ont montré une meilleure activité antioxydante dans les tests DPPH, CUPRAC, FRAP et TOAC par rapport aux autres espèces. En outre, les deux extraits de C.paroiflorus ont montré une activité de piégeage des radicaux DMPD plus élevée que les extraits d'autres espèces. Comme indiqué dans le tableau 1, les teneurs totales en composés phénoliques, en flavonoïdes et en acide phénolique de C. salviifolius étaient plus élevées que dans les autres échantillons. Ainsi, le potentiel antioxydant plus élevé des extraits de C. saloiifolius peut être lié à son contenu phénolique.

De plus, la réduction des potentiels antioxydants, des activités inhibitrices sur les enzymes liées aux glucides et des AGE des échantillons biodisponibles peut être liée à la baisse des glycosides flavonoïdes marqueurs. Cependant, les extraits de ciste contenaient également d'autres substances phénoliques, comme indiqué sur la figure 1. Par conséquent, une analyse chromatographique détaillée des extraits est nécessaire pour surveiller l'influence de la digestion sur l'activité biologique.

Le potentiel inhibiteur des extraits de plantes sur les enzymes digestives a récemment attiré plus d'attention en raison du problème de sécurité des inhibiteurs synthétiques. Par conséquent, l'effet inhibiteur des extraits de plantes a été déterminé dans plusieurs études, et cet effet était généralement associé à des substances phénoliques telles que les flavonoïdes, les acides phénoliques, les proanthocyanidines, etc. Sun et al. [37] ont suggéré que les composés polyphénoliques manifestent leurs effets inhibiteurs en se liant aux enzymes mentionnées ci-dessus à l'aide de forces hydrophobes et de liaisons non covalentes. Par conséquent, l'inhibition de l'activité des enzymes -amylase et -glucosidase par les polyphénols est liée à leurs structures moléculaires. Bien que ce mécanisme d'interaction ait été étudié à l'aide de différentes techniques telles que la cinétique d'inhibition, l'amarrage moléculaire de la fluorescence, etc., aucune conclusion certaine n'a encore été acquise [38]. Cependant, de nombreuses études ont rapporté que les inhibitions des enzymes digestives des extraits de plantes sont directement liées à leur contenu phénolique. Des études similaires sur les activités inhibitrices enzymatiques des espèces de Cistus ont également été rapportées précédemment. Sayah et al. [39] ont étudié les activités inhibitrices de l'amylase et de l'a-glucosidase des extraits méthanoliques et aqueux à 80 % de C. monspeliensis et C. saluifolius. Leurs résultats étaient conformes à la présente étude, révélant que l'extrait aqueux de C. salvijfolius a démontré une plus grande -glucosidase （IC50 ug/mL∶0.95±0.14） et o -amylase（IC50 ug/mL∶217.1±0.15）activité inhibitrice que l'extrait aqueux de C. monspeliensis （IC50 ug/mL∶14.58±1.26） et （ICsn ug/mL:886.10±0.10), respectivement. Les taux d'inhibition des deux extraits aqueux sur ces enzymes étaient plus élevés que le composé de référence acarbose (ICso ug/mL : 18,01 ± 2. 00) Semblable à notre étude, ils ont trouvé une corrélation avec les taux d'inhibition enzymatique et le total quantités de phénols et de flavonoïdes. Les teneurs en phénols totaux et en flavonoïdes totaux de l'extrait aqueux de C. salvijfolius (408,43 ± 1,09 mg de GAE et 140,00 ± 1,15 RE, respectivement) étaient plus élevées que l'extrait aqueux de C. monspeliensis (261,76 ± 1,9 mg de GAE et 78.00±1,15 RE respectivement). Orhan et al. [40] ont également étudié les potentiels inhibiteurs des enzymes digestives d'extraits aqueux et éthanoliques à 80 % des feuilles de C.laurifolius. Selon leurs résultats, l'extrait éthanolique à 80 % (71,7 % ± 0,6) a affiché une forte activité inhibitrice de l'amylase par rapport à l'extrait aqueux (39,3 % ± 2,2) à une concentration de 1 mg/mL. Ils ont suggéré que les composés phénoliques, en particulier les flavonoïdes, affectent directement la sécrétion d'insuline en empêchant l'apoptose des cellules bêta et en soutenant l'activité antidiabétique. Cette hypothèse, corrélée à nos résultats, indique que l'échantillon ND d'extraits aqueux de C. salviifolius exerçait les teneurs totales en flavonoïdes et phénoliques les plus élevées et les plus grandes activités inhibitrices de l'o-amylase et de l'o-glucosidase. Comme indiqué dans le tableau 4, l'extrait aqueux de C. salviifolius a présenté de meilleures activités inhibitrices sur les enzymes digestives que les autres extraits.

De plus, les échantillons IN des extraits aqueux contenaient des quantités phénoliques et flavonoïdes inférieures à celles des échantillons ND et ont donc révélé des activités inhibitrices enzymatiques plus faibles dans le présent travail. Alors que le contenu phénolique des extraits était affecté négativement par la procédure de digestion, ils présentaient toujours une activité inhibitrice significative des enzymes digestives. Dans plusieurs études, les glycosides flavonoïdes ont été signalés comme les principaux métabolites d'extraits de plantes à fortea-amylaseet potentiels inhibiteurs de la -glucosidase [41-43]Alors que le mécanisme inhibiteur des composés phénoliques sur les enzymes digestives n'a pas encore été révélé, des études de relation structure-activité ont été menées sur certains composants phénoliques tels que les flavonoïdes, les acides phénoliques, les proanthocyanidines et des tanins Des études de relation structure-activité sur les flavonoïdes ont montré que la double liaison C2=C3 du cycle C améliore le potentiel d'inhibition des enzymes digestives de ces composés. Étant donné que cette liaison élève la densité électronique, la force de l'interaction entre le flavonoïde et l'enzyme est augmentée [44]. De plus, les groupes hydroxyle sur C-5 et C-7 facilitent le potentiel inhibiteur de l'o-amylase des flavonoïdes. Il a également été suggéré que l'hydroxylation du squelette des flavonoïdes affecte positivement leur a-amylase et-enzyme glucosidasepotentiels inhibiteurs[45]. Comme indiqué précédemment, tous les flavonoïdes marqueurs dans la présente étude étaient des glycosides de flavonol portant ces exigences structurelles décrites ci-dessus. Cependant, après la procédure de digestion in vitro, leurs activités associées ont diminué de manière significative dans les échantillons biodisponibles des extraits aqueux.

Généralement, le potentiel inhibiteur des extraits de plantes sur les AGE est lié à plusieurs facteurs, à savoir leur contenu phénolique, leurs potentiels antioxydants, leurs capacités de chélation des métaux, leurs interactions protéiques et leurs activités de blocage des récepteurs des AGE [13]. Comme présenté dans le tableau 4, les échantillons biodisponibles des extraits aqueux présentaient des activités inhibitrices d'AGE inférieures à celles des échantillons ND, car la procédure de digestion in vitro affectait négativement la teneur en composés phénoliques des extraits. Selon les résultats de l'étude actuelle, l'échantillon ND d'extrait aqueux de C. salvifolius possédait l'activité inhibitrice d'AGE la plus élevée ainsi que la teneur totale en phénols et en flavonoïdes. En comparaison, l'échantillon IN d'extrait aqueux de C. monspeliensis a montré le potentiel d'inhibition de l'AGE le plus faible, ce qui peut être attribué à sa plus faible teneur totale en flavonoïdes et en phénols. Étant donné que les flavonoïdes ont une large distribution dans les extraits de plantes, les fruits, les légumes et les boissons, plusieurs études se sont intensifiées sur le potentiel d'inhibition des flavonoïdes sur les formations d'AGE. Les mêmes flavonoïdes désignés comme marqueurs phénoliques dans cette étude ont également été signalés comme composés marqueurs dans d'autres études [46-48].

Semblable à l'inhibition des enzymes digestives, les activités inhibitrices des AGE des flavonoïdes ont été stimulées par la double liaison C2=C3 et l'hydroxylation des anneaux A et C. Cependant, la fixation du sucre au squelette flavonoïde entraîne une diminution de l'activité inhibitrice [49]. En revanche, Cervantès-Lauren et al. [50] ont suggéré que le flavon-3-des glycosides possédait un plus grand potentiel d'inhibition de l'AGE que les autres glycosides flavonoïdes. Cette hypothèse peut être une explication de la diminution de l'inhibition des AGE dans les échantillons biodisponibles. Par exemple, la quercitrine et l'hyperoside n'ont pas été détectés dans les échantillons biodisponibles de l'extrait aqueux de C. monspeliensis, ce qui explique la plus faible activité des échantillons IN de C. monspeliensis par rapport aux extraits d'autres espèces. Même si la quercitrine n'a pas été détectée dans l'extrait aqueux de C. saloifolius, des quantités significativement plus élevées d'hyperoside et de salidroside peuvent être à l'origine de sa forte activité d'inhibition des AGE. En général, une corrélation positive a été observée entre les teneurs en flavonoïdes marqueurs des échantillons et leurs potentiels inhibiteurs sur les AGE.

4. Matériel et méthodes

4.1.Produits chimiques

Toutes les références, enzymes et produits chimiques utilisés dans les expériences ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Des matériaux de qualité analytique ont été utilisés dans les expériences.

4.2.Échantillons de plantes

Des parties aériennes de C.creticus et C.saloifolius ont été recueillies sur le campus de l'Université Yeditepe (Kayisdagi, Istanbul) au cours de la dernière semaine d'avril 2018. Des parties aériennes de C.mon-speliensis et C.paroiflorus ont été recueillies près d'AlacatI Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir au cours de la deuxième semaine de mai 2018. Des parties aériennes de C. laurifolius ont été collectées sur la route Kemer-Doganhisar, à Konya, au cours de la première semaine de juin 2018. Le professeur Erdem Yesilada a authentifié du matériel végétal. Des spécimens de bons pour C.creticus (YEF18013),C.lauri-folios (YEF18017),C.monspeliensis(YEF18015),C.paroifforus(YEF18016)et C.salvifolus (YEF18014) ont été conservés à l'Herbier du Département de Pharmacognosie, Faculté de pharmacie, Université Yeditepe, Istanbul, Turquie.

4.3.Procédure d'extraction

L'extraction aqueuse a été choisie car elle est couramment utilisée comme technique de préparation en médecine traditionnelle. Les parties aériennes grossièrement séchées à l'air et réduites en poudreCistancheespèces (100 g) ont été extraites avec de l'eau distillée chaude (80 degrés, 1,5 L) en utilisant un dispositif d'agitation pendant 15 min. Ensuite, les extraits aqueux ont été filtrés à travers un papier filtre et évaporés à sec sous pression réduite. Une fois la procédure de lyophilisation terminée, les extraits ont été dissous dans de l'eau distillée pour un traitement ultérieur (échantillon non digéré : ND) (rendement des extraits : 13,04 % pour C.creticus, 15,7 % pour C.laurifolius, 12,8 % pour C.monspeliensis ,14,94 pour cent pour C.parviflorus,14,74 pour cent pour C.salvifolius).

4.4.Méthode de simulation de digestion humaine in vitro

Le modèle de simulation de digestion humaine a été appliqué à des échantillons de Cistus in vitro, en suivant la méthode détaillée précédemment par Celeb et al. (SGF). Plus tard, le pH de la solution SGF a été arrangé à 2 avec HCl (5 M); 17,5 ml de cette solution ont été mélangés avec 2,5 ml d'échantillons de plantes, et ce mélange a été placé dans le bain-marie agité à 37 degrés pendant 2 h pour imiter les mouvements péristaltiques du système de digestion. Après 2 h, les échantillons ont été placés dans un bain de glace pour inactiver les réactions enzymatiques ; 2 ml des échantillons ont été mis de côté comme échantillon "post-gastrique" (P) pour d'autres expériences. Une membrane de dialyse cellulosique chargée d'une quantité appropriée de NaHCO3 (1 M, pH 7) était située dans les solutions d'échantillon froides ; ainsi, l'absorption gastro-intestinale a été imitée. Ensuite, 4,5 ml de solution d'acides biliaires/pancréatine ont été combinés avec les solutions, et le mélange a été incubé pendant 2 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius. Enfin, le fluide à l'intérieur de la membrane de dialyse a été acquis en tant qu'échantillon "biodisponible" (IN). Une fois la procédure terminée, tous les échantillons ont été conservés à -20 degré pour d'autres expériences. 4.5.Estimation in vitro du profil phénolique

4.5.1.Analyse du contenu phénolique total

La détermination spectrophotométrique du contenu phénolique total des échantillons a été effectuée dans un 96-modèle de plaque à puits selon la méthode détaillée précédemment par Barak et al. 20 μL de solutions d'échantillon et de référence fraîchement préparées. Ensuite, 100 μL de réactif de Folin-Ciocalteu ont été combinés au mélange. Après une période d'incubation de 30 min à température ambiante dans l'obscurité, l'absorbance a été mesurée à 690 nm. L'acide gallique a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour établir une courbe d'étalonnage et les teneurs phénoliques totales ont été exprimées en équivalents d'acide gallique (GAE).

4.5.2.Analyse de la teneur totale en flavonoïdes

La détermination spectrophotométrique de la teneur totale en flavonoïdes des échantillons a été gérée dans un modèle de plaque à puits 96- conformément à la méthode expliquée précédemment par Bardakci et al.[51] ; 150 ul d'éthanol à 75 %, 10 ul de chlorure d'aluminium , et 10 μL d'acétate de sodium trihydraté 1M ont été combinés avec 50 μL de solutions d'échantillon et de référence, séparément. Ensuite, ces mélanges ont été incubés à température de chambre noire pendant 30 min. Après la période d'incubation, l'absorbance a été calculée à 405 nm.Quercétinea été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour établir une courbe d'étalonnage et les teneurs totales en flavonoïdes ont été représentées en équivalents de quercétine (QE). 4.5.3.Analyse de la teneur totale en acide phénolique

La teneur totale en acide phénolique des échantillons a été mesurée par spectrophotométrie en suivant la procédure rapportée précédemment par Barak et al. [52]. Tout d'abord, des quantités appropriées de nitrite de sodium et de molybdate de sodium ont été dissoutes dans de l'eau distillée pour obtenir le réactif d'Arnow. Ensuite, 1 ml des échantillons a été combiné avec 1 ml de réactif d'Arnow, 1 ml de 0.1 M HCl et 1 ml de 1 M NaOH, séparément. Après cela, le volume du mélange a été ajusté à 10 ml avec de l'eau distillée et l'absorbance a été lue immédiatement à 490 nm. L'acide caféique a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour obtenir une courbe d'étalonnage, et les teneurs totales en acide phénolique ont été données en équivalents d'acide caféique (CAE).

4.5.4.Test de teneur totale en proanthocyanidines

La détermination spectrophotométrique de la teneur totale en proanthocyanidines des échantillons a été effectuée dans un modèle de plaque à puits 96- en suivant la méthode de Barak et al. [1]En bref, 25 μL des solutions d'échantillon ont été mélangés avec 150 μL de vanilline à 4 % et 75 μL de solutions de HCl (32 %), respectivement. Après 15 minutes d'incubation à température ambiante, l'absorbance a été ajustée à 492 nm. L'hydrate de catéchine a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour obtenir une courbe d'étalonnage. Le méthanol a été utilisé comme solution témoin. La teneur totale en proanthocyanidines des échantillons a été exprimée en équivalents de catéchine (CE).

4.6.Tests d'activité de piégeage des radicaux libres 4.6.1.Test d'activité de piégeage des radicaux DPPH

L'activité de piégeage des radicaux DPPH des échantillons a été déterminée dans un modèle de plaque à puits 96- suivant la méthode modifiée par Celeb et al. [53]. Dans un premier temps, 150 uM de solution de DPPH ont été fraîchement préparés. Ensuite, 200 μL de solution DPPH ont été mélangés avec 25 μL de solutions d'échantillon. Ensuite, ce mélange a été incubé à température ambiante pendant 50 min. L'absorbance a été calculée à 540 nm. L'hydroxytoluène butylé (BHT) a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations. Le méthanol a été utilisé comme solution témoin. L'activité des échantillons a été présentée comme CE50, correspondant à la concentration montrant une activité de 50 %.

4.6.2.Analyse de l'activité de piégeage des radicaux DMPD

L'activité de piégeage des radicaux DMPD plus (N, N-diméthyl-p-phénylènediamine) des échantillons a été réalisée dans un modèle de plaque à puits 96- selon la méthode décrite précédemment par Inan et al. [13]. Tout d'abord,10{{10}} mM DMPD plus solution, 0,05 M FeCl ; Une solution 6H2O et un tampon acétate 0,01 M ont été fraîchement préparés. Ensuite, 1 ml de solution DMPD, 100 ml de tampon acétate et 0,2 ml de FeCl ; La solution 6H2O a été mélangée, et plus tard 15 μL de solutions d'échantillon ont été combinés avec 210 μL de ce mélange. Après la période d'incubation à température ambiante pendant 50 min, l'absorbance a été mesurée à 492 nm. Trolox a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour obtenir une courbe d'étalonnage. Les concentrations des solutions d'échantillon étaient de 1 mg/mL. Les activités de piégeage des radicaux DMPD des échantillons ont été exprimées en équivalents Trolox (TE). 4.7.Tests d'activité de réduction des métaux

4.7.1.Ferric Reducing Antioxidant Power Assay (FRAP)

La détermination de l'activité FRAP des échantillons a été réalisée dans un modèle de plaque à 96 puits en suivant la procédure rapportée précédemment par Bardakci et al. [54]. Au début de l'expérience, le réactif FRAP a été formé en mélangeant du tampon acétate, de la ferrique-tripyridyltriazine et du FeCl; Solution 6H2O. Après cela, le réactif FRAP a été placé dans le four à 37 degrés pendant 30min. Ensuite, 10 ul des solutions d'échantillon ont été combinés avec 30 ul d'eau distillée et 260 ul de réactif FRAP, respectivement. Après un temps d'incubation à 37 degrés pendant 30 minutes, l'absorbance a été ajustée à 593 nm. Une courbe standard a été construite en utilisant différentes molarités de solution de sulfate ferreux (0,25-2 mM) pour évaluer les résultats. Le BHT a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations. Les activités FRAP des échantillons ont été présentées en mM FeSO4 dans 1 g d'extrait sec.

4.7.2.Test de capacité antioxydante réductrice cuivrique (CUPRAC)

L'activité CUPRAC des échantillons a été déterminée dans un modèle de plaque à puits 96- selon la méthode modifiée par Celeb et al. 【31】 ; 85 μL de solutions de CuSO4 （10 mM）, de néocupraine et d'acétate d'ammonium et 51 μL d'eau distillée ont été ajoutés à 43 μL de solutions d'échantillon, séparément. Après une période d'incubation (20 min) à 50 degrés dans un bain-marie, l'absorbance a été mesurée à 450 nm. L'acide ascorbique a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour acquérir une courbe d'étalonnage. Les activités CUPRAC des échantillons ont été présentées en équivalents d'acide ascorbique (AAE). 4.8. Test d'activité antioxydante totale (TOAC) La détermination de l'activité antioxydante totale des échantillons a été effectuée dans un modèle de plaque à puits 96- suivant la procédure de Celeb et al. [55]. Au début, une certaine quantité de phosphate de sodium monobasique, de molybdate d'ammonium tétrahydraté et d'acide sulfurique a été mélangée pour acquérir la solution de TOAC. Ensuite, 300 μL de solution TOAC ont été ajoutés à 30 μL de solutions d'échantillon. Après la période d'incubation à 95 degrés dans un bain-marie pendant 90 min, l'absorbance a été déterminée à 690 nm. L'acide ascorbique a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations pour acquérir une courbe d'étalonnage. Les activités TOAC des échantillons ont été représentées en équivalents d'acide ascorbique (AAE). 4.9.Estimation de l'indice de biodisponibilité

L'indice de biodisponibilité (BAvI) a été calculé selon l'équation théorique décrite par Inan et al.[13] : BAVI=CIN/CND L'"indice de biodisponibilité"(BAvI) a été décrit comme le rapport du nombre de composés phénoliques dans l'échantillon biodisponible (IN) à celui dans l'échantillon non digéré (ND). 4.10. Quantification des flavonoïdes marqueurs par HPTLC

La détermination quantitative des concentrations de salidroside, d'hyperoside et de quercitrine dans tous les échantillons de simulation (ND, PG, IN) des extraits aqueux des espèces de Cistus a été réalisée par chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Suisse) suivant la méthode validée par Guzelmeric et al.[16]. L'hyperoside, le salidroside et la quercitrine ont été préparés à des concentrations de 25, 50 et 100 ug/mL, et les concentrations des solutions d'échantillon fraîchement préparées ont été ajustées à 10 mg/mL. Ces solutions ont été appliquées sur des plaques de gel de silice à support de verre en phase normale (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Allemagne） avec certains volumes （1-5 μL de solutions standard et 5 μL de solutions d'échantillon） en utilisant des seringues de 100 μL （ Hamilton, Bonaduz, Suisse）. La procédure d'application a été réalisée avec l'applicateur d'échantillons Linomat 5. Le processus de développement a été réalisé dans une chambre de développement automatisée (ADC 2) et acétate d'éthyle : dichlorométhane. acide acétique. acide formique : eau (10:25:10 :10:10:10me) a été sélectionnée comme phase mobile. Ensuite, les plaques ont été dérivées avec un réactif de produit naturel (NPR) (1g d'acide diphénylborique 2-aminoéthylesterine 200mL d'acétate d'éthyle) dans le dispositif d'immersion (CAMAG).hyperosideet la quercitrine ont été analysées par spectrophotométrie à 260 nm, la quantité de salidroside a été mesurée à 330 nm par un scanner UV. Les valeurs Rf des standards ont été déterminées comme hyperoside （≈0.35）, quercitrine （≈0.45）, tiliroside （≈0.65）. Les coefficients de corrélation （r2） se sont avérés être ×0.98 pour la quantification des flavonoïdes marqueurs.

4.11.Activité inhibitrice sur les enzymes liées au diabète

4.11.1. -Activité inhibitrice de la glucosidase

-Les activités inhibitrices de la glucosidase des échantillons non digérés et biodisponibles obtenus à partir des extraits aqueux des espèces de Cistus ont été examinées selon la méthode expliquée précédemment par Balan et al. [56]. Tout d'abord, des quantités appropriées de phosphate monosodique et de phosphate disodique ont été mélangées avec un tampon phosphate 100mM (pH7). L'enzyme o--glucosidase a été dissoute dans un tampon phosphate pour obtenir la solution d'a-glucosidase （0.2U/mL）. Ensuite, 170 uL de tampon phosphate, 20 μL de la solution de -glucosidase et 20 uL de solutions d'échantillon ont été combinés et incubés dans un four à 37 degrés pendant 15 min. Après cela, 20 μL de solution de p-nitrophényl- -D-glucopyranoside 2,5 mM dans un tampon phosphate de potassium 100 mM (pH 7,0) ont été ajoutés au mélange, et une autre période d'incubation a été exécutée à 37 degré pendant 15 min. Ensuite, 80 μL de solution de carbonate de sodium 0,2 M ont été ajoutés au mélange pour terminer la réaction. L'absorbance a été mesurée à 405 nm. Une solution de quercétine à différentes concentrations a été utilisée comme référence. Les résultats ont été estimés sous forme de pourcentage d'activité inhibitrice dans des concentrations de 1 mg/mL et 0,5 mg/mL d'échantillons ND et IN des extraits aqueux d'espèces de Cistus. 4.11.2. -Activité inhibitrice de l'amylase L'activité inhibitrice de l'o-amylase des échantillons non digérés et biodisponibles obtenus à partir des extraits aqueux des espèces de Cistus a été déterminée en suivant la procédure détaillée précédemment par Balan et al.[56]. La détermination spectrophotométrique des activités inhibitrices de l'a-amylase des échantillons a été réalisée en utilisant le réactif DNS (acide 3,5-dinitrosalicylique). Comme indiqué dans le procédé, le maltose est formé à partir de la conversion de l'amidon, et la couleur jaune du DNS alcalin est transformée en couleur rouge orangé due au maltose produit à partir de l'amidon. Ainsi, une solution de DNS 96 mM a été préparée à partir du mélange d'une solution de tartrate de sodium et de potassium (dissous dans du NaOH 2 M) et d'une certaine quantité de DNS (dissous dans de l'eau distillée). Ensuite, un tampon de phosphate de sodium 20 mM avec 6,7 mM de NaCl (co-facteur de l'enzyme u-amylase) a été préparé à 20 degrés (pH : 6,9). l'enzyme a-amylase (1U/mL) et l'amidon (10 mg/mL) ont été dissous dans ce tampon. Après cela, 50 μL de tampon phosphate de sodium et 10 μL de solution d'enzyme a-amylase ont été mélangés avec 20 μL des solutions d'échantillon. Ce mélange a été incubé à 37 degrés pendant 45 min. Après la période d'incubation, 20 μL de la solution d'amidon ont été ajoutés au mélange. Une autre période d'incubation a commencé à 37 degrés pendant 45 min. La même procédure a été appliquée aux échantillons sans ajout de solution d'enzyme w-amylase appelée "échantillon de fond". Le groupe témoin a été étudié avec la même procédure en l'absence de solutions d'échantillons. L'absorbance a été mesurée à 540 nm. L'acarbose a été utilisé comme solution de référence à différentes concentrations. Les résultats ont été présentés sous forme de pourcentage d'activité inhibitrice dans des concentrations de 1 mg/mL et 0,5 mg/mL d'échantillons ND et IN d'extraits aqueux d'espèces de Cistus. 4.11.3.Activité inhibitrice des AGE L'activité inhibitrice des AGE d'échantillons non digérés et biodisponibles d'extraits aqueux d'espèces de Cistus a été déterminée selon la méthode décrite par Starow-icz et al. [57]. Avant tout processus, des concentrations de 1 mg/mL et 0,5 mg/mL d'échantillons ND et IN ont été fraîchement préparées. Ensuite, 1 mL d'une concentration de 10 mg/mL de solution d'albumine de sérum bovin (BSA) a été ajouté à 1 mL de solutions d'échantillons ND et IN. Les échantillons de contrôle ont été préparés sans ajouter de solutions d'échantillons ND et IN, et les échantillons blancs ont été préparés sans ajouter de glucose 0,5 M. Ensuite, tous les échantillons préparés ont été incubés pendant 40 h dans un bain-marie agité à 55 degrés. Une fois la période d'incubation terminée, le lecteur de microplaques multimode Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX a été utilisé dans la plage d'excitation de 370 nm/émission de 440 nm pour calculer l'intensité de fluorescence. La quercétine a été utilisée comme solution de référence à différentes concentrations.

4.12.Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées indépendamment à trois moments différents. Le logiciel GraphPad Prism (version 6.1) a été utilisé pour déterminer la distribution paramétrique ou non paramétrique des données. La section d'analyse des comparaisons multiples de l'ANOVA unidirectionnelle de Tukey a été utilisée pour évaluer les dosages TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH et DMPD. D'autre part, les résultats des expériences d'inhibition de l'o-amylase, de la -glucosidase et de l'AGE ont été examinés par l'analyse de comparaisons multiples ANOVA Sidak à deux voies. Des résultats significatifs ont été montrés avec p<0.05. 5.="">

Dans la présente étude, les extraits aqueux de toutes les espèces de Cistus enregistrées dans la flore turque ont été étudiés pour leurs profils phénoliques et leurs potentiels antioxydant et antidiabétique in vitro. La décoction ou l'infusion étant la forme courante des médecines traditionnelles, l'utilisation d'extraits aqueux pour l'évaluation de l'activité dans les études expérimentales est particulièrement importante. D'autre part, les constituants hydrophiles de l'extrait aqueux sont soumis à une série de transformations métaboliques dans le système gastro-intestinal une fois ingérés. Par conséquent, pour une évaluation correcte de l'activité des formulations traditionnelles, les activités des métabolites biodisponibles doivent également être étudiées.

Il s'agit de la première étude à examiner les conséquences de la méthode de simulation in vitro de la digestion humaine sur les espèces de cistes turcs. De plus, le potentiel d'inhibition des espèces de cistes turcs sur les AGE a été étudié dans cette étude pour la première fois. De plus, le salidroside, l'hyperoside et la quercitrine se sont vu attribuer des marqueursflavonoïdes, et les modifications de leurs concentrations ont été surveillées dans la procédure de digestion in vitro. Alors que le contenu phénolique et les activités antidiabétiques et antioxydantes des extraits étaient négativement affectés par les procédures de digestion gastro-intestinale, ils présentaient toujours une bioactivité significative. Selon les résultats, l'extrait de C.saloifolius a été détecté comme la plante la plus puissante en termes de contenu phénolique et d'activités antioxydantes et antidiabétiques. En conclusion, les parties aériennes des espèces de cistes turcs ont un contenu phénolique riche et des activités antioxydantes et antidiabétiques potentielles. Bien que la méthode de simulation de digestion in vitro ait été utilisée pour évaluer la biodisponibilité, elle pourrait ne pas imiter complètement les voies métaboliques se produisant dans l'organisme. Par conséquent, d'autres études in vivo et cliniques sont nécessaires pour évaluer en détail la biodisponibilité des composés phénoliques et leur contribution aux effets pharmacologiques rapportés.

Cet article est extrait de Molecules 2021, 26, 5322