Isolement et purification des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche Deserticola par chromatographie à contre-courant à grande vitesse

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Li a,b, Rong Tsao b,*, Raymond Yang b, Chunming Liu a, J. Christopher Young b, Honghui Zhu b

Résumé

Cinq glycosides phényléthanoïdes (PhG), l'échinacoside, le cistanoside A, l'actéoside, l'isoactéoside et le 20-acétylactéoside, ont été isolés et purifiés à partir deCistanche désertiquepour la première fois par chromatographie à contre-courant à grande vitesse (HSCCC) en utilisant deux systèmes biphasiques, l'un composé d'acétate d'éthyle-éthanol-eau (5 :0.5 :4.5, v/v/v) et l'autre d'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau ({{10}}.5 :0.5 :0.1 :1, v/v/v/v). Un total de 28,5 mg d'échinacoside, 18,4 mg de cistanoside A, 14,6 mg d'actéoside, 30,1 mg d'isoactéoside et 25,2 mg de 20-acétylactéoside ont été purifiés à partir de 1412 mg d'extrait de n-butanol de C. deserticola, chacun à plus de 92,5 pour cent de pureté comme déterminé par HPLC. Les structures ont été identifiées par leur temps de rétention, UV, LC-ESI-MS en mode ions négatifs, et confirmées par des expériences RMN. Le modèle de fragmentation caractéristique LC-ESI-MSn des cinq composés est discuté et s'avère être un outil très spécifique et utile pour l'identification structurelle des PhG de cette importante plante médicinale.

Mots clés:Cistanche désertique; Phényléthanoïde; échinacoside ; Cistanoside A; Actéoside; isoacteoside; 20-Acétylactéoside ; HSCCC ; LC-ESI-MS ; RMN

1. Introduction

Cistanche deserticola YC Maest une plante médicinale chinoise bien connue et a été largement utilisée dans des préparations traditionnelles similaires aux ingrédients alimentaires fonctionnels ou aux compléments alimentaires d'aujourd'hui (Wong, Li, Cheng et Chen, 2006). Les principaux constituants bioactifs de C. deserticola sont les glycosides phényléthanoïdes (PhG), notamment l'échinacoside, l'actéoside, l'isoactéoside, l'20-acétylactéoside et le cistanoside A (Kobayashi, Karasawa et Miyase, 1984 ; Kobayashi et al., 1987). Les PhG sont largement distribués dans le règne végétal et ont été largement étudiés pour leurs diverses fonctions biologiques telles que les activités hépatoprotectrices (Xiong et al., 1998), anti-inflammatoires, antinociceptives (Schapoval et al., 1998) et antioxydantes ( Cheng, Wei, Guo, Ni et Liu, 2005 ; He, Lau, Xu, Li et But, 2000 ; Li, Wang et Wang, 1997 ; Li, Wang, Zheng, Liu et Jia, 1993 ; Wang, Jiang, Wu et Wang, 2001 ; Xiong, Kadota, Tani et Namba, 1996), l'amélioration de la fonction sexuelle (Xie et Wu, 1993 ; Zong, He, Wu et Chen, 1996) et l'effet sédatif (Lu, 1998 ).

En raison des bioactivités importantes ci-dessus, de grandes quantités de composés purs sont nécessaires de toute urgence comme étalons de référence et pour diverses études in vitro et in vivo liées à l'utilisation des médecines traditionnelles chinoises. Des méthodes efficaces pour l'isolement, la purification et la caractérisation structurale des PhG deviennent donc nécessaires. Cependant, un tel travail nécessite généralement l'utilisation de plusieurs étapes chromatographiques pour le nettoyage et l'isolement des échantillons (Gross, Lahloub, Anklin, Schulten, & Sticher, 1988; Nishimura, Sasaki, Inagaki, Chin, & Mitsuhashi, 1991; Ravn, Nishibe , Sasahara, & Li, 1990 ; Shoyama, Matsumoto, & Nishioka, 1987), ce qui entraîne généralement de faibles taux de récupération en raison d'adsorptions irréversibles de PhG sur le support solide lors de la séparation (Lei et al., 2001). En revanche, la chromatographie à contre-courant à grande vitesse (HSCCC) est devenue une alternative efficace aux techniques chromatographiques conventionnelles pour la séparation de certains PhG à partir d'extraits de plantes (Lei et al., 2001 ; Li et al., 2005). Lei et al. a réussi à séparer l'actéoside et l'20-acétylactéoside deSalsa aux cistanches(CA Mey.) G. Beck en utilisant HSCCC (Lei et al., 2001). Les auteurs de cet article ont précédemment rapporté la séparation de l'actéoside et de l'isoactéoside de Plantago psyllium L. par HSCCC (Li et al., 2005). Cependant, aucun rapport n'a été publié sur la séparation et la purification de plusieurs PhG de C. deserticola à l'aide de HSCCC. En raison du manque de normes, les méthodes LC-MS ont été développées et utilisées comme un outil analytique puissant pour la caractérisation et l'identification rapides de certains PhG dans les extraits de plantes (Li et al., 2005 ; Wang et al., 2000).

Dans cet article, nous rapportons une méthode HSCCC développée pour la préparation de l'échinacoside, du cistanoside A, de l'actéoside, de l'isoactéoside et du 20-acétylactéoside de C. deserticola. La caractérisation et l'analyse des cinq PhG séparés ont été réalisées par l'utilisation de la LC couplée à la spectrométrie de masse ESI en ligne et aux expériences de RMN. Le temps de rétention, le poids moléculaire et les ions fragments caractéristiques des cinq PhG sont présentés et discutés dans cet article. Les structures des cinq PhG identifiées dans cette enquête sont présentées à la Fig. 1.

Ingrédients efficaces de Cistanche deserticola

2.expérimental

2.1. produits chimiques et réactifs

L'acteoside a été acheté chez Sigma-Aldrich (Oak-Ville, ON), l'échinacoside a été acheté chez ChromaDex (Santa Ana, CA). L'isoacteoside a été isolé de P. psyllium L. (Li et al., 2005). C. deserticola a été acheté au Beijing TongRenTang Medicinal Store (Chine). Tous les solvants étaient de qualité HPLC et achetés auprès de Caledon Laboratories Ltd. (Georgetown, ON).

2.2. La préparation des échantillons

C. deserticola (20 g) a été extraite cinq fois à température ambiante pendant 12 h à chaque fois avec 100 ml d'éthanol aqueux à 80 %. A chaque fois, le mélange d'extraction a été filtré à travers un papier filtre Whatman n° 1 (Whatman International Ltd., Maidstone, Angleterre). Le filtrat combiné a été concentré à 100 ml sous vide à < 40="" degrés.="" la="" solution="" aqueuse="" résultante="" a="" été="" dégraissée="" deux="" fois,="" chacune="" avec="" 100="" ml="" d'hexane,="" puis="" extraite="" successivement="" cinq="" fois,="" chacune="" avec="" 100="" ml="" de="" n-butanol.="" les="" couches="" de="" n-butanol="" ont="" été="" combinées="" et="" concentrées="" à="" sec="" sous="" vide="" à="">< 40="" degrés,="" ce="" qui="" a="" donné="" 2,2="" g="" d'extrait="" de="" n-butanol.="" l'extrait="" a="" été="" stocké="" à="" -20="" degré="" avant="" la="" séparation="">

2.3. Procédure de séparation HSCCC

Le HSCCC préparatif a été réalisé dans une chromatographie à contre-courant à grande vitesse modèle CCC{{0}} (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland USA). Cet appareil avait trois bobines de préparation, connectées en série (volume total, 325 ml). La vitesse de rotation de l'appareil pouvait être réglée entre 0 et 2000 rpm. Le système HSCCC était équipé d'une pompe HPLC (Pharma-Tech Research, Baltimore, Maryland, USA), d'un détecteur UV modèle 450 (Alltech, USA), d'un enregistreur à plat modèle L 120 E (Linseis Inc., Princeton Jct, États-Unis), un collecteur de fractions (Advantec MFS Inc., États-Unis) et une vanne d'injection d'échantillon avec une boucle d'échantillon de 10- mL.

Un mélange d'acétate d'éthyle-éthanol-eau (5 :0.5 :4.5, v/v/v) a été secoué vigoureusement dans une ampoule à décanter et laissé reposer et se séparer à température ambiante. Les deux phases ont été utilisées dans le HSCCC après avoir atteint l'équilibre. La totalité de la colonne enroulée a d'abord été remplie avec la couche supérieure, qui sert de phase stationnaire. La couche inférieure (phase mobile) a ensuite été pompée dans la tête de la colonne à un débit de 1,5 mL/min. La vitesse de rotation a été fixée à 1050 tr/min. Un échantillon (environ 230 mg à chaque fois) dissous dans 8 ml du mélange d'acétate d'éthyle-éthanol-eau (5:0,5:4,5, v/v/v) a été chargé dans la vanne d'injection après que le système ait atteint le niveau hydrodynamique. équilibre. Ce système de solvant biphasique a été sélectionné sur la base du coefficient de partage (K), qui était de 0,87, 1,11 et 1,32 pour l'actéoside, l'isoactéoside et 20 acétylactéoside, respectivement. La valeur K était le rapport des concentrations dans les couches supérieure et inférieure du même composé tel que déterminé par HPLC (Fig. 2). L'effluent de la sortie de la colonne a été contrôlé en continu par un détecteur UV à 254 nm et collecté dans des tubes à essai avec un collecteur de fractions réglé à 4 min pour chaque tube.

2.4. Conditions CL

un échantillonneur automatique statique et un détecteur à réseau de photodiodes (DAD) ont été utilisés pour l'analyse des PhG dans l'extrait au n-butanol de C. deserticola et des fractions recueillies à partir de la séparation HSCCC. La séparation a été réalisée dans une colonne Phenomenex ODS-C18 (250 × 4,6 mm, 5 lm) avec une colonne de garde C18. La phase mobile binaire était constituée d'acétonitrile (solvant A) et d'eau contenant 2 % d'acide acétique (solvant B). Tous les solvants ont été filtrés à travers un

{{0}}Filtre de 0,45 lm avant utilisation. Le débit a été maintenu constant à 1,0 mL/min pendant une durée totale de fonctionnement de 25 min. Le système a été exécuté avec un programme de gradient : 0–20 min : 90 % B à 60 % B ; 20 à 22 min : 60 % B à 0 % B ; et 22 à 25 min, 0 % B à 90 % B. Le volume d'injection de l'échantillon était de 10 lL. Les pics d'intérêt ont été surveillés à 320 nm par un détecteur DAD.

2.5. Expériences LC-ESI-MS

Des expériences LC-MS ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre de masse à piège à ions Finnigan LCQ DECA (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) équipé d'une source d'ionisation par électrospray (ESI). Les échantillons ont été analysés dans les mêmes conditions chromatographiques. Un modèle négatif a été utilisé pour la collecte des données. Les débits de gaz gaine et auxiliaire ont été fixés respectivement à 96 et 7 (unité arbitraire). La tension capillaire a été fixée à 29 V et sa température a été contrôlée à 350 degrés. La tension de la lentille d'entrée a été fixée à 40 V et l'amplitude RF multipolaire a été fixée à 540 V. La tension de l'aiguille ESI a été contrôlée à 4,5 kV. Le décalage de la lentille du tube était de 16 V, le décalage de la lentille multipolaire 1 était de 8,20 V et le décalage de la lentille multipolaire 2 était de 10,5 V. La tension du multiplicateur d'électrons était fixée à 980 V pour la détection des ions.

2.6. RMN pour l'identification

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Avance-600 (Bruker BioSpin Ltd., Milton, Canada). Seuls les composés 2 et 5 (aucun étalon disponible) ont été soumis à des expériences de RMN. Les échantillons ont été dissous dans du CD3OD.

Principes actifs du cistanche : échinacoside et actéoside

3. Résultats et discussion

Une séparation HSCCC réussie dépend en grande partie d'un système de solvant à deux phases approprié qui fournit un coefficient de partage idéal (K) autour de 1 pour le composé souhaité. Un tel système biphasique devrait également produire un temps de stabilisation raisonnablement court (Chen, Games et Jones, 2003 ; Foucault et Chevolot, 1998 ; Oka, Oka et Ito, 1991). Dans notre expérience, nous avons sélectionné quatre séries de systèmes de solvants en fonction de la solubilité des composés cibles dans C. deserticola. La HPLC a été utilisée pour mesurer la concentration dans chaque phase, à partir de laquelle les valeurs K des composés cibles ont été calculées. Deux systèmes, acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (4:0,6:0,6:5, v/v/v/v) et acétate d'éthyle-eau (1:1, v/v), ont déjà été utilisés dans HSCCC pour séparer l'actéoside et l'20-acétylactéoside de

C. salsa, et actéoside et isoacteoside de P. Psyllium,

respectivement (Lei et al., 2001 ; Li et al., 2005). Bien que le premier système ait eu un temps de sédimentation relativement court, il avait de mauvaises performances pour séparer les PhG de C. deserticola, en raison des faibles valeurs de K pour les composés 1 et 2 et des valeurs élevées de K pour les composés 3–5. Les valeurs de K étaient très faibles pour les composés 1 à 4 dans le deuxième système, mais très élevées pour le composé 5 (tableau 1). Un système modifié contenant de l'acétate d'éthyle-éthanol-eau (5: 0,5: 4,5, v/v/v), a donné une valeur K idéale pour les composés 3-5 à 0,87, 1,11 et 1,32, respectivement, et a abouti à la bonne séparation de ces trois composés (Fig. 3A et B). Ce système a cependant produit

une valeur K trop faible pour les composés 1 et 2, provoquant la co-élution des deux composés près du front de solvant (fraction 1 sur la figure 3A). Une modification supplémentaire du système (acétate d'éthyle–n-butanol–éthanol-eau (0.5 :0.5 :0.1:1, v/v/v/ v) a élevé les valeurs K pour les composés 1 et 2 à 0.52 et 0.92, respectivement, et a conduit à une séparation complète (Fig. 3C). La Fig. 3A montre la séparation HSCCC d'un échantillon contenant 230 mg de l'extrait au n-butanol de C. deserticola à l'aide d'un mélange acétate d'éthyle-éthanol-eau (5 :0.5 :4.5, v/v/v). par HPLC pour ne contenir que les composés 3, 4 ou 5 ont été combinés séparément, et ceux contenant les composés 3 et 4 ont été regroupés, lyophilisés et soumis à nouveau au HSCCC pour une séparation supplémentaire (Fig. 3B). La séparation HSCCC décrite ci-dessus a donné un total de 14,6 mg, 30.1 mg et 25,2 mg de composés 3 à 5 à partir de 1 412 mg d'extrait de n-butanol. La figure 3C montre la séparation HSCCC d'un échantillon contenant les composés 1 et 2 (fraction 1 dans la première séparation) en utilisant de l'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (0.5:0.5:0.1:1, v/v/ v/v). Un total de 28,5 et 1 8,4 mg des composés 1 et 2 ont été obtenus. Les puretés chromatographiques des composés lyophilisés 1 à 5 étaient supérieures à 92,5 %, qui ont été directement utilisées pour les analyses LC-ESI-MS et RMN.

L'identification provisoire des composés 1, 3 et 4 a été obtenue par des temps de rétention et des données spectrales UV congruents avec ceux de l'échinacoside, de l'actéoside et de l'isoactéoside authentiques (Fig. 2). Les composés 2 et 5 étaient inconnus, cependant, les spectres UV des cinq composés étaient très similaires, indiquant des caractéristiques structurelles similaires.

Pour étudier plus avant les structures de ces cinq composés, des expériences LC – ESI-MSn ont été tentées et les résultats sont présentés à la Fig. 4 et au Tableau 2. Les composés liés aux pics (1–5) de la Fig. 2 présentaient des ions moléculaires déprotonés intenses. [MH]— à m/z 785, 799, 623, 623 et 665, respectivement, en mode négatif. Des ions dimériques [2M H]- ont également été observés pour les pics 1 à 4 sur la figure 2. Ceux-ci ont confirmé que les poids moléculaires des pics 1 à 5 étaient de 786, 800, 624, 624 et 666, respectivement. Les données LC-MSN (tableau 2) ont fourni des informations structurelles très utiles pour les cinq PhG, telles que la perte neutre d'une procédure expérimentale : environ 1 mg de chaque échantillon a été pesé dans un tube à essai de 10 ml dans lequel 1 ml de chaque phase du système de solvant à deux phases pré-équilibré a été ajouté. Le tube à essai a été bouché et secoué vigoureusement pendant 1 min, et laissé au repos jusqu'à ce qu'il se sépare complètement. Une aliquote de 100 lL de chaque couche a été prélevée et évaporée séparément à sec sous vide à<40 °c.="" the="" residue="" was="" dissolved="" in="" 10="" ll="" methanol="" and="" analyzed="" by="" hplc="" for="" determining="" the="" partition="" coefficient="" (k)="" of="" compounds="" 1–5.="" the="" k="" value="" was="" expressed="" as="" the="" peak="" area="" of="" the="" target="" compound="" in="" the="" upper="" phase="" divided="" by="" that="" in="" the="" lower="">

La LC – ESI-MS du pic 1 est illustrée à la Fig. 4A. L'ion moléculaire déprotoné [MH]- à m/z 785 avec une forte abondance et un dimère moléculaire déprotoné.l'ion [2M H] - à m/z 1571 a été observé en mode négatif, suggérant un poids moléculaire de 786, qui était le même que celui de l'échinacoside. Une enquête plus approfondie dans l'expérience LC – MS2 des ions m / z 785 a donné un ion fille principal à m / z 623 (Fig. 4B) produit directement à partir de m / z 785 par perte d'une fraction caffeoyl ou d'une fraction hexose comme [M 162 H]—. Le spectre LC – MS3 de m/z 623 présentait deux ions majeurs à m/z 477 et 461, et deux ions mineurs à m/z 315 et 179 (Fig. 3C, Tableau 2). Les différences de masse entre m/z 623 et les ions fragments m/z 477 et 461 étaient respectivement de 146 et 162, correspondant à la perte d'une unité rhamnose et d'un groupement glucose ou d'un groupement caféoyle [M 162 H]-. Les ions m/z 623 ont également perdu une fraction caféoyle et une fraction rhamnose pour produire les ions m/z 315. L'ion à m/z 179 a été produit à partir du clivage de la fraction caféoyle, la charge négative restant sur la partie de la fraction caféoyle. L'expérience LC – ESI-MSN sur l'échinacoside authentique a montré le même schéma de fragmentation. Le pic 1 a donc été confirmé comme étant l'échinacoside.

Pour le pic 2, la LC–ESI-MS a montré m/z 799 comme ion moléculaire déprotoné [MH]— et m/z 1599 comme ion dimérique, suggérant une masse moléculaire de 800. Au cours des expériences MS2, le m/z 799 ions ont formé trois filles à m/z 637, 623 et 475 (tableau 1). L'ion à m/z 637 a été produit directement à partir de l'ion parent de m/z 799 à nouveau en raison de la perte neutre du caféoyle [M—162—H]— ou d'un fragment glucose [M—162—H]—. L'ion à m/z 623 résulte de la perte d'un radical CH2. L'ion à m/z 475 a été formé à partir de la perte neutre à la fois de la fraction caféoyle [M 162 H]— et de la fraction glucose de l'ion parent. L'expérience MS3 sur m/z 637 a produit trois ions à m/z 619, 491 et 475, correspondant aux pertes d'une eau, d'une unité de rhamnose et d'une fraction de glucose, respectivement. L'ion fille m/z 623 a produit m/z 461 et 315 dans l'étude MS3, qui a suivi les mêmes voies de fragmentation que l'échinacoside, comme indiqué ci-dessus. Les données LC-ESI-MSN ont soutenu une tentative d'identification du pic 2 en tant que cistanoside A. Les deux pics ont montré le même [MH]-ion à m/z 623 et dimère à m/z 1247 en mode négatif (tableau 1), indiquant ce sont peut-être des isomères de même poids moléculaire que

624, le même que l'acteoside et l'isoacteoside. Les spectres MS2 des ions [MH]- ont également montré un même ion fille de m/z 461, ce qui indique la perte de la fraction caffeoyl de l'ion parent m/z 623 (tableau 1). Des spectres MS3 similaires ont été obtenus pour les deux composés. Pour le pic 3, le spectre MS3 de l'ion à m/z 461 a formé trois ions à m/z 315, 161 et 135. Le m/z 315 est formé après avoir perdu le rhamnose comme discuté précédemment. L'ion m/z 161 a été produit à partir du clivage de la fraction caféoyle, suivi d'une nouvelle perte d'une eau ; la charge est restée du côté du groupement caféoyle. L'ion à m/z 135 [aglycone 18 H]— provient du clivage de la liaison glycosidique en position C1 avec une perte supplémentaire d'une eau, laissant la charge à la partie aglycone. Le spectre MS3 du pic 4 a suivi la même voie de fragmentation que le pic 3, à l'exception de l'ion manquant à m/z 135. L'ion moléculaire et les schémas de fragmentation de ces deux composés sont cohérents avec les données de la littérature sur l'actéoside et l'isoactéoside (Wang et al ., 2000), bien qu'un ion supplémentaire m/z 153 ait été trouvé et que les données de RMN du proton du cistanoside A et du 20-acétylactéoside aient été attribuées comme [aglycone H] - par Wang et al. (Wang et al., 2000). Cet ion peut avoir été instable et avoir perdu de l'eau pour donner m/z 135 dans notre expérience. Sur la base des données MS et des temps de rétention congruents des pics 3 et 4 avec les standards, ils sont donc identifiés respectivement comme actéoside et isoactéoside.

Les données LC-ESI-MS du pic 5 sont présentées dans le tableau 2. Un ion moléculaire déprotoné [MH]— (m/z 665) était le seul ion trouvé en mode négatif, impliquant une masse moléculaire de 666. Trois ions filles ont été observés à m/z 623, 503 et 461 dans l'expérience MS2 (tableau 2). Les ions filles à m/z 623 et 503 ont été formés directement à partir de l'ion parent par perte d'un groupe COCH2 et d'une fraction caféoyle, respectivement. L'ion à m/z 461 provenait de la perte à la fois du groupement caféoyle et du groupement COCH2 [M 162 42 H] - de l'ion parent. Dans l'expérience MS, m/z 623 a produit m/z 461 et m/z 503 a produit trois ions à m/z 485, 461 et 315. Le spectre MS3 de l'ion fille m/z 461 a donné deux ions à 443 et 315. En comparant le modèle de fragmentation LC-MSN du pic 5 avec d'autres composés rapportés dans cette étude et avec d'autres rapportés (Li et al., 2005; Wang et al., 2000), nous avons conclu que le pic 5 était structurellement très lié à l'actéoside, la seule différence étant l'unité COCH3 en position R3. Une identité provisoire a donc été donnée au pic 5 en tant que 20- acétylactéoside (Fig. 1).

Les structures des deux composés provisoirement identifiés, le pic 2 (sous forme de cistanoside A) et le pic 5 (sous forme de 20-acétyl-actéoside) ont été confirmées par leurs structures par RMN 1H. Les déplacements chimiques et les constantes de couplage de tous les protons des composés 2 et 5, comme indiqué dans le tableau 3, correspondent aux données RMN rapportées pour le cistanoside A et le 20- acétylactéoside, respectivement (Kobayashi et al., 1984, 1987) . Des expériences de RMN 2D (corrélation COSY, ROESY et CH à longue portée) ont également été menées dans la présente étude et elles ont en outre confirmé l'identification (données non présentées).

Actéoside de Cistanche deserticola

4. Conclusions

Dans le présent article, le HSCCC a été utilisé avec succès pour l'isolement et la purification de l'échinacoside, du cistanoside A, de l'actéoside, de l'isoactéoside et du 20-acétylactéoside à partir de l'extrait de n-butanol de C. deserticola. C'est donc un moyen éprouvé de séparation semi-préparative des bioactifs. Pendant ce temps, les structures des cinq PhG de C. deserticola ont été étudiées au moyen de LC-ESI-MSN ; certaines caractéristiques des PhG ont été trouvées, ce qui nous a permis de déterminer les groupes fonctionnels dans les structures. La méthode LC-ESI-MSN est donc un outil puissant pour l'identification rapide des phényléthanoïdes et de leurs glycosides dans les extraits de C. deserticola, en particulier lorsqu'ils sont étayés par des données RMN.

Reconnaissance

Les auteurs tiennent à remercier Jun Gu du Centre de résonance magnétique nucléaire, Université de Guelph, Ontario, Canada pour son aide dans les expériences de RMN. Ce projet a été partiellement soutenu par un financement de la province de Jilin, Chine (n° 20060904).

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