Extrait de cellules de jasminum sambac comme booster antioxydant contre le vieillissement cutané Partie 1

Abstrait: Le stress oxydatif joue un rôle majeur dans le processus de vieillissement cutané par la production d'espèces réactives de l'oxygène et la formation de produits terminaux de glycation avancée (AGE). Les ingrédients antioxydants sont donc nécessaires sur le marché des soins de la peau et l'utilisation de molécules issues de cultures de cellules végétales offre une opportunité unique. Dans cet article, les caractéristiques d'un extrait hydroéthanolique obtenu par des cellules de Jasminum sambac (JasHEx) ont été explorées. Les propriétés antioxydantes et anti-AGE ont été étudiées par une approche multidisciplinaire combinant spectrométrie de masse et expériences bio-informatiques in vitro et ex vivo. JasHEx contient des dérivés d'acide phénolique, des lignanes et des triterpènes et il s'est avéré qu'il réduisait la production d'espèces réactives de l'oxygène cytosolique dans les kératinocytes exposés à un stress exogène. Il a également montré la capacité de réduire la formation d'AGE et d'augmenter la production de collagène de type I dans la matrice extracellulaire. Les données ont démontré que les propriétés antioxydantes de JasHEx étaient liées à ses activités de piégeage des radicaux libres et de chélation des métaux et à l'activation de la voie Nrf2/ARE. Cela peut bien expliquer l'activité anti-inflammatoire de JasHEx liée à la diminution des niveaux de NO dans les macrophages stimulés par le LPS. Ainsi, JasHEx peut être considéré comme un puissant booster antioxydant contre le vieillissement cutané induit par le stress oxydatif.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une capacité de piégeage robuste des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à celle de la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et peut piéger les espèces réactives de l'oxygène, empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

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Mots clés: vieillissement cutané ; espèces réactives de l'oxygène (ROS); les produits finaux de glycation avancée (AGE) ; Extrait hydroéthanolique de Jasminum sambac (JasHEx) ; spectrométrie de masse; métabolomique; Réseau mondial de molécules sociales de produits naturels (GNPS); facteur nucléaire érythroïde 2-facteur lié 2 (Nrf2)

1. Introduction

Des facteurs génétiques intrinsèques et des agents extrinsèques tels que l'irradiation ultraviolette, l'irradiation infrarouge, les xénobiotiques et les polluants environnementaux provoquent la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Ils sont générés par l'activation de la chaîne respiratoire mitochondriale, du cytochrome p450 et des NADPH oxydases [1]. Les ROS comprennent des radicaux libres (anion superoxyde, radical hydroperoxyle, radical alcoxy et radical hydroxyle) et des molécules non radicalaires (peroxyde d'hydrogène et oxygène singulet) [2]. Lorsque les systèmes antioxydants sont débordés, les ROS s'accumulent dans les cellules et génèrent ce que l'on appelle le stress oxydatif qui est l'un des principaux contributeurs au vieillissement cutané [3].

En effet, le stress oxydatif provoque à la fois des dommages à l'ADN et une oxydation des lipides et des protéines ainsi que le déclenchement de la voie des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) (AKT, JNK, ERK et p38) [4]. Ceci, à son tour, favorise l'expression de cytokines pro-inflammatoires, de facteurs de croissance et de molécules adhésives par la stimulation des facteurs de transcription AP-1 et NF-κB. De plus, l'activation de la voie MAPK provoque des altérations de la matrice dermique en réduisant les niveaux de collagène. Il accélère la dégradation du collagène en modulant l'expression des métalloprotéinases matricielles (MMP) et de leurs inhibiteurs tissulaires TIMP et il réduit la synthèse de nouveau collagène en bloquant la signalisation récepteur TGF-type II/Smad. De plus, le stress oxydatif altère les conditions cutanées en perturbant le gradient de calcium épidermique, essentiel à l'intégrité et au fonctionnement de l'enveloppe cornée, en stimulant le fonctionnement des glandes sébacées et en induisant la dégénérescence des mélanocytes [5].

En parallèle, la formation de biomolécules modifiées appelées produits terminaux de glycation avancée (AGE) favorise le stress oxydatif dans les cellules et les tissus [6]. Le développement de ces biomarqueurs du vieillissement est induit par divers facteurs environnementaux tels que la fumée de cigarette, des régimes riches en glucides raffinés et simples, des aliments cuits à haute température et un mode de vie sédentaire ; Les AGE sont des produits stables et irréversibles issus de la réaction non enzymatique entre des sucres réducteurs et des protéines, des acides nucléiques ou des lipides, suivie de réarrangements ultérieurs [7]. En effet, le point de départ de la formation des AGE est la réaction de Maillard dans laquelle les groupes carbonyle des sucres réducteurs réagissent de manière réversible avec les groupes amino libres des protéines, des acides nucléiques ou des aminophospholipides pour former des bases de Schiff. Ces imines se réarrangent spontanément en kétamine plus stable, appelée produits Amadori. Ils produisent des dicarbonyles réactifs (comme le glyoxal ou le méthylglyoxal) qui réagissent avec les groupes fonctionnels lysine et arginine des protéines, donnant une grande variété d'AGE [8,9]. Ils sont classés en différents groupes en fonction de leur capacité à émettre de la fluorescence et à former des réticulations.

L'action des AGE est médiée par les récepteurs des AGE (RAGE) qui sont des protéines transmembranaires appartenant à la superfamille des immunoglobulines des molécules de surface cellulaire de type I, exprimées dans différents types de cellules, notamment les kératinocytes, les fibroblastes et les macrophages. La liaison des AGE/RAGE augmente la production de ROS principalement par l'activation des NADPH oxydases (NOX) et de la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant un stress oxydatif et tous les effets conséquents décrits ci-dessus [6,8].

De plus, les protéines de la matrice extracellulaire (ECM), en particulier le collagène, sont très sensibles à la glycation. En effet, les taux de pentosidine de structure AGE, issue du collagène, sont significativement plus élevés chez les sujets âgés que chez les sujets jeunes [10]. La glycation du collagène modifie non seulement les propriétés mécaniques du collagène lui-même, qui devient plus rigide et plus cassant [11], mais également celles de la matrice extracellulaire, affectant le comportement des cellules résidentes (croissance, différenciation, motilité, expression des gènes et réponse aux cytokines) et les interactions matrice-cellule [12].

Dans ce scénario, les ingrédients antioxydants sont très demandés dans le domaine cosmétique pour réduire la formation d'AGE et leur cascade oxydative associée : les extraits dérivés de l'espèce Jasminum sambac, appartenant à la famille des Oleaceae, sont intéressants pour leurs propriétés antioxydantes et leur utilisation conjointe dans la médecine populaire. médicament pour traiter les maladies de la peau [13]. Cependant, les extraits de plantes présentent plusieurs inconvénients tels qu'une faible biodurabilité, la contamination potentielle par des pesticides, des engrais ou des agents pathogènes, et la variabilité de leur composition qualitative et quantitative, affectée par les saisons et les conditions environnementales. Une alternative valable aux plantes, en tant que source d'ingrédients cosmétiques bioactifs, est représentée par les cultures de cellules végétales qui offrent plusieurs avantages : (i) haute durabilité du processus de production, puisqu'aucune terre agricole n'est nécessaire ; (ii) un approvisionnement continu en produits naturels sans dépendance géographique, saisonnière et du cycle de reproduction des plantes ; (iii) aucun risque de contamination par des agents pathogènes, des polluants environnementaux et des résidus agrochimiques ; (iv) des conditions de croissance standardisées qui permettent d'obtenir des taux de biomasse et de rendement en métabolites plus élevés et plus reproductibles ; (v) une grande polyvalence, puisque la concentration des composés peut être optimisée en modifiant les conditions de culture et (vi) des protocoles d'extraction plus faciles et moins longs, réduisant le besoin de solvants agressifs [14,15].

Ici, un extrait hydroéthanolique dérivé de cultures cellulaires de Jasminum sambac (JasHEx) a été étudié. L'objectif de notre étude est une large caractérisation chimique et biologique de JasHEx, explorant en particulier ses propriétés anti-glycation et anti-âge. Tout d'abord, des approches avancées basées sur la spectrométrie de masse ont été utilisées pour obtenir une caractérisation structurelle détaillée de l'extrait. Ensuite, des expériences in vitro et ex vivo ont été réalisées pour prouver l'activité biologique de JasHEx en tant qu'anti-oxydant.

2. Matériels et méthodes

2.1. Cultures de tissus végétaux et préparation d'extraits

Le jasmin arabe certifié (Jasminum sambac) a été obtenu auprès d'une pépinière locale ("Ladre di Piante", Pistoia, région de Toscane, Italie). Les feuilles de Jasminum sambac ont été trempées dans 70 % d'éthanol (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) pendant 1 minute et stérilisées en surface avec 1 % (v/v) d'eau de javel commerciale additionnée de Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) pendant 8 min, suivi de trois rinçages dans de l'eau distillée stérile. Ensuite, les feuilles ont été excisées en morceaux de 0.5–1.0 cm et cultivées sur un milieu MS à pleine concentration [16] contenant 3 % (p/v) de saccharose, 0 .2 mg/L de 2,4D et 8 g/L de phyto-agar. Les explants ont été repiqués mensuellement sur un milieu frais pendant trois mois. Une fois qu'un cal jaune-vert, friable et à croissance rapide a été obtenu, les cellules végétales ont été transférées dans le milieu MS liquide, additionné de 3 % (p/v) de saccharose et de 0,2 mg/L de 2,4D. La suspension a été agitée dans un agitateur giratoire à 23h et 27°C dans une chambre à climat sombre. Les cellules foncées ont été mises à l'échelle chaque semaine de flacons à petite échelle à des flacons à grande échelle jusqu'à ce que des cultures en suspension liquide d'environ 177 g/L aient été atteintes. La préparation de l'extrait hydro-éthanolique de culture cellulaire de Jasminum sambac (JasHEx) a été réalisée par addition de 2000 mL d'une solution d'éthanol/eau (90/10, v/v) à 500 g de cellules. Le mélange a été homogénéisé pendant 3 min à 1500 tr/min et 6 min à 3800 tr/min en utilisant un broyeur à couteaux Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Allemagne). La suspension obtenue a été agitée à 400 tr/min pendant 2 h à 25 ◦C, en évitant l'exposition à la lumière. La suspension a ensuite été centrifugée à 6300 rpm pendant 10 min à 4 ◦C. Le surnageant a été prélevé, filtré, puis concentré sous vide dans un évaporateur rotatif (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Allemagne) réglé à 25°C. Enfin, le pH a été amené à 7,0 avec NaOH 10 N puis lyophilisé jusqu'à obtention d'une poudre fine.

2.2. Analyse UPLC–MS/MS pour la caractérisation chimique JasHEx

Une extraction biphasique butanol/eau a été réalisée. La fraction butanol a été desséchée et décongelée dans du méthanol (10 mg/mL) avant l'analyse UPLC–MS/MS effectuée sur un spectromètre de masse Q-Exactive Classic équipé d'un système UltiMate™ 3000 UPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ). Tous les passages chromatographiques ont été réalisés comme déjà décrit par Ceccacci et al. [17].

2.3. Analyses mondiales des réseaux moléculaires sociaux des produits naturels

Pour l'identification des métabolites, le Global Natural Products Social Molecular Networking a été utilisé [18]. Tous ces signaux MS et MSMS non attribués par GNPS ont été judicieusement examinés et attribués en conséquence à la littérature. Les fichiers bruts ont été convertis au format mzXML par le logiciel MS Converter General User Interface, avant la recherche dans la bibliothèque spectrale GNPS. Elle a été réalisée en utilisant une tolérance de masse des ions précurseurs de 0.025 Da, une tolérance de masse des ions fragments de 0.02 Da, des pics correspondants minimum de 2 et un seuil de score de 0,7. Les résultats ont été confirmés manuellement.

Le prétraitement des données a été effectué par Mzmine (Version 2.53, Softpedia, Bucarest, Roumanie) [19] et un travail de réseautage moléculaire basé sur les fonctionnalités (FBMN) [20] a été effectué comme indiqué par Ceccacci et al. [17]. Les fichiers réseau obtenus ont été importés dans Cytoscape (Version 3.9.1, US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Bethesda, MD, USA) [21].

2.4. Analyse quantitative des lignanes et des triterpènes

Les mêmes paramètres UPLC indiqués pour les expériences qualitatives ont été utilisés pour l'analyse quantitative des lignanes, tandis que pour celle des triterpènes, ils ont été améliorés pour séparer deux paires d'isomères, l'acide arjunolique/asiatique et l'acide oléanolique/ursolique. L'analyse a été réalisée sur un spectromètre de masse Q-Exactive Classic tel que défini précédemment. La séparation a été réalisée par un Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, USA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, granulométrie 5 µm). La phase mobile consistait en A (solution aqueuse d'acétate d'ammonium 5 mM, pH 9.00 ajusté par de l'hydroxyde d'ammonium) et B (1{{40}}0 pour cent d'acétonitrile) en utilisant une élution en gradient de 13 à 28 % de B à 0 à 20 min, 28 à 65 % de B à 20 à 24 min, 65 à 75 % de B à 24 à 28 min, 75 à 95 % à 28 à 28,5 min, 95 % à 28,5 –32 min, 95–13 % à 32–32,1 min et 13 % à 32,1–44 min. Le débit était de 0,450 mL/min et le volume d'injection était de 5 µL. Pour les lignanes et les triterpènes, les données ont été acquises avec la méthode de masse décrite par Ceccacci et al. [17]. Nous avons acheté de la nortachelogène (#LCA52174) de Biosynth Carbosynth, du matairesinol (#80497) et de l'acide maslinique (#83209) de PhytoLab GmbH & Co.KG, du secoisolariciresinol (#60372) et de l'acide arjunolique (#SMB00119) de Sigma-Aldrich (Saint Louis , MI, USA), acide asiatique (#0027), acide oléanolique (#0041 S) et acide ursolique (#0037 S) d'Extrasynthèse (Genay, France). Les courbes d'étalonnage ont été obtenues en injectant des étalons à la concentration de 0,05 à 25 µM pour les lignanes et de 0,1 à 25/250 µM pour les triterpènes. La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) des étalons ont été déterminées en fonction du rapport signal sur bruit (S/N).

2.5. Cultures de cellules cutanées et explants

Des kératinocytes humains immortalisés (HaCaT), achetés auprès d'Addexbio Technologies (San Diego, Californie, États-Unis), ont été conservés dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) qui a été complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) dans 95 % d'air, 5 % de CO2 et une atmosphère humidifiée à 37 °C. Les fibroblastes dermiques humains (HDF) ont été conservés dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM ; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis ) dans 95 % d'air, 5 % de CO2 et une atmosphère humidifiée à 37 ◦C. Des explants de peau, obtenus à partir de la peau de donneuses en bonne santé (âgées de 31 et 40 ans) au centre de chirurgie Villa Cinzia (Naples, Italie), ont été cultivés dans des plaques 24-transwell dans du DMEM/FBS plus des antibiotiques dans des conditions air-liquide à 37 ◦C dans de l'air humidifié à 5 % de CO2. Tous les donneurs avaient donné leur consentement éclairé écrit pour l'utilisation des tissus cutanés, conformément à la Déclaration d'Helsinki.

2.6. Essai de ROS cytosolique dans des cellules HaCaT stressées par H2O2-

Pour ce processus, 1,8 × 104 HaCaT ont été ensemencés dans des plaques 96-puits et cultivés pendant 20 h. Les cellules ont ensuite été traitées pendant 2 h avec différentes concentrations de JasHEx (0 0,0006 %, 0,002 % et 0,006 % p/v) ou avec de l'acide ascorbique 500 µM, utilisé comme contrôle positif. Après cela, ils ont été lavés dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) et incubés à 37 ◦C avec 100 µL/puits d'une solution contenant : 10 mM d'Hepes, 1,3 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4, 5 mM de glucose et 5 mM de glucose. µM CM-H2DCFDA (5-(et-6)-chlorométhyl-20,70 -diacétate de dichlorodihydrofluorescéine, Invitrogen). Après 45 min, un lavage au PBS a été effectué et l'intensité de fluorescence de base des cellules a été mesurée à 535 nm (excitation 485 nm), à l'aide de l'instrument EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Ensuite, le stress oxydatif a été induit en ajoutant 450 µM H2O2, et la fluorescence des échantillons a été mesurée après 30 min.

2.7. Dosage immuno-enzymatique (ELISA) pour la détection d'AGE dans des cellules de fibroblastes dermiques humains (HDF) stressées par le glyoxal

Pour cette étape, 1,5 × 104 HDF ont été ensemencés dans des plaques 96-puits et cultivés pendant 2 jours. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été fixées pendant 1{{10}} min avec 100 µL de formaldéhyde à 4 % dans du PBS. Par la suite, ils ont été traités avec du JasHEx (0,0006 % et 0,002 % p/v) ou le contrôle positif de 1 µM d'aminoguanidine en présence de 0,5 % de glyoxal à 50 °C pendant 1 semaine. Après incubation, ils ont été traités pour un dosage immuno-enzymatique (ELISA) en utilisant un anticorps spécifique contre l'AGE (Abcam ab23722).

2.8. Test d'immunohistofluorescence sur des explants de peau stressés au méthyl-glyoxal pour la détection de la fibrilline-1

Les explants de peau provenaient de deux patients, âgés de 31 et 40 ans. À partir de chaque biopsie cutanée, trois poinçons ont été générés pour chaque traitement effectué à l'interface air-liquide. Le premier jour, les poinçons ont été traités avec JasHEx (0.002 % et 0,006 % p/v) ou le contrôle positif (Aminoguanidine 1 mM) et après 24 h, 500 μM de méthyl- du glyoxal a été ajouté. Les traitements ont été renouvelés tous les deux jours pour un total de sept jours. À la fin de la période, les poinçons ont été traités pour analyse histologique, fixés dans du PFA à 4 %, incubés dans du saccharose à 15 %, puis dans du saccharose à 30 % et cryo-stockés dans un composé OCT (température de coupe optimale) à -80 °C . Une cryosection de 5 µm a été obtenue avec le cryostat CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, USA). Les lames avec cryosections ont été hydratées pendant 30 min dans du PBS et placées dans une solution "bloquante" (6% BSA, 5% sérum, 20 mM MgCl2, 0,2% Tween) pendant 1 h. Par la suite, ils ont été incubés avec l'anticorps primaire anti-fibrilline 1 (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). pendant 16 h à 4 ◦C. Les lames ont été lavées avec du PBS pendant 30 min puis incubées avec l'anticorps secondaire anti-lapin Alexa-Fluor 546 (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) pendant 1 h. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (40, 6-5 diamidino-2-phénylindole) 1 g/mL dans du PBS pendant 10 min. Les images ont été acquises avec un microscope à fluorescence et analysées avec le logiciel ImageJ (Version 1.53a, National Institutes of Health, USA).

2.9. Dosage AlphaLISA pour mesurer la teneur en peptide C (PIP) du procollagène de type I

Dans cette étape, 8 × 103 HDF ont été ensemencés dans une plaque 96-puits et traités pendant 24 h avec JasHEx (0.0006 %, 0,002 %, et 0,006 pour cent p/v) ou avec TGF- (2,5 ng/mL). Après traitement, les cellules ont été traitées selon les instructions du fournisseur du kit de collagène alpha LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)).

2.10. Essai d'activation de la transcription basé sur la luciférase Nrf2

Ici, 6 × 103 cellules HaCaT dans une plaque 96-puits ont été ensemencées et cultivées pendant 16 h. Après cela, ils ont été soumis à un test d'activation de la transcription basé sur la luciférase Nrf2, à l'aide du kit de reportage ARE BPS Bioscience (San Diego, CA, USA, #60514). Un vecteur rapporteur de luciférase ARE prêt pour la transfection (contenant un gène de luciférase de luciole sous le contrôle d'éléments sensibles à ARE situés en amont d'un promoteur minimal) ainsi qu'un contrôle interne (un vecteur de luciférase de Renilla à expression constitutive) ont été co-transfectés de manière transitoire dans des cellules HaCaT en utilisant X-TREME gene HP DNA transfection reagent (Roche, Basilea, Suisse, #6366244001). Après transduction pendant 24 h, les cellules ont été traitées pendant 2 h avec l'extrait (0,0006 %, 0,002 % et 0,006 % p/v) ou le contrôle positif Resveratrol (50 µM). Après cela, ils ont été soumis au dosage de la luciférase avec le système de dosage Dual-Glo Luciferase (Promega, Rome, Italie #E2920). En bref, les cellules ont été incubées avec un substrat de luciférase de luciole pendant 10 min avant de mesurer la luminescence dans un 96-lecteur de plaque à puits (Victor Nivo, Waltham, MA, USA). Le rapport de luminescence de la luciole et de Renilla a été calculé pour normaliser et comparer l'activité transcriptionnelle de Nrf2.

2.11. Analyse de l'expression des gènes SOD-1(NM_000454.5) et OH-1(NM_002133.3) dans les cellules HaCaT

Pour ce processus, 1,5 × 105 cellules HaCaT par puits ont été cultivées dans des plaques 6-puits pendant 16 h et incubées pendant 6 h avec l'extrait (0,002 % et 0,006 % p/v) ou Resvératrol 50 µM comme contrôle positif. A la fin de l'incubation, l'ARN total a été extrait à l'aide du kit "GenElute™ Total RNA Purification" (de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, USA) et traité avec de la DNase I (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) à 37 ◦C pendant 30 min, pour éliminer le contaminant de l'ADN génomique. 500 ng d'ARN total ont été rétrotranscrits à l'aide de l'enzyme Reverse transcriptase (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Des RT-PCR semi-quantitatives ont été réalisées à l'aide de la paire de amorces amorce/concurrent 18S (Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis) comme étalons internes Les produits de PCR ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 % et visualisés à l'aide de l'instrument iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification étaient les suivantes : HsSOD1Fw : GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG ; HsSOD1Rv : ATTGGGCGATCCCAATTACACC ; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG ; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Dosage d'oxyde nitrique dans RAW 264.7 stimulé par LPS

La concentration de NO a été déterminée dans les macrophages murins RAW 264.7, ensemencés à une concentration de 1,5 × 105 cellules/puits dans des plaques 96-puits pendant 24 h et prétraités avec l'extrait ({{1 0}}.0006 %, 0,002 % et 0,006 % p/v) ou avec 10 μM de TPCK (contrôle positif) pendant 2 h, avant l'incubation avec 2 μg/mL de LPS pendant 18 h. La quantité de NO, convertie en nitrite, a été calculée en ajoutant le réactif de Griess (solution de N-(1-naphtyl)éthylènediamine et d'acide sulfanilique, Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) et, après 30 min, l'absorbance a été mesurée à 540 nm par le lecteur de plaques multipuits (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)

3. Résultats

3.1. Analyse qualitative et quantitative de l'extrait hydro-éthanolique de culture cellulaire de Jasminum sambac (JasHEx)

Une analyse UPLC-MS/MS de JasHEx a été réalisée et des données spectrométriques à haute résolution ont été analysées à l'aide du Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), un système de spectrométrie de masse basé sur le Web qui facilite l'annotation des produits naturels (NP) [18] . En particulier, une bibliothèque spectrale GNPS a été réalisée pour réaliser une déréplication en ligne. Les espèces chimiques non identifiées par GNPS ont été assignées en conséquence à la littérature. Comme le montrent les figures 1 et 2 et le tableau 1, plus de 50 composés appartenant à plusieurs classes de métabolites secondaires, principalement des polyphénols et des terpènes, ont été identifiés. En effet, l'extrait de JasHEx contient des dérivés d'acide phénolique, des lignanes (sécoisolariciresinol, nortrachélogénine et matairesinol) et des triterpénoïdes (acide arjunolique, acide aspartique, acide maslinique, acide oléanolique et acide ursolique).

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