Les polysaccharides de jujube ont atténué l'anémie chez les rats atteints d'insuffisance rénale chronique

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Shiying Huang, et al

Résumé

Les polysaccharides de jujube (JP) sont l'un des glycanes actifs d'origine alimentaire dans le fruit diététique de Ziziphus jujuba, qui a été envisagé pour le traitement de la carence en sang. Dans cette étude, unchroniqueun reinmaladie(CKD) modèle de rat a été utilisé pour évaluer l'effet de JP et son mécanisme sur l'anémie associée CKD. Chez les rats CKD, le traitement JP a significativement amélioréun reinfonction, un reinpathologiqueblessure, et les paramètres hématologiques, y compris l'augmentation des globules rouges, de l'hémoglobine, de l'hématocrite et du nombre de plaquettes. De plus, les résultats de la métabolomique ciblée par LC-MS/MS ont montré que JP favorisait la libération d'acides gras à chaîne courte (AGCC) chez les rats CKD. En outre, JP a alterné le taux sérique d'érythropoïétine (EPO), l'ARNm de l'EPO rénale etun reinProtéine EPO via la signalisation HIF. Ensemble, ces résultats fournissent la preuve que l'effet du JP sur l'anémie associée à l'IRC peut être impliqué dans la régulation de la libération des AGCC et de la production d'érythropoïétine, soutenant le développement ultérieur du JP en tant que compléments alimentaires dans le traitement de l'anémie associée à l'IRC.

Mots-clés : Polysaccharides de JujubeChroniqueun rein maladieAnémie Érythropoïétine Facteur inductible par l'hypoxie - Acides gras à chaîne courte

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1. Introduction

Chroniqueun rein maladie(CKD) est défini comme un syndrome clinique d'anomalies structurelles rénales ou de déficiences fonctionnelles et devient un fardeau de plus en plus important pour la santé publique dans le monde (Webster, Nagler, Morton et Masson, 2017). L'anémie rénale est l'une des complications les plus courantes de l'IRC qui contribue au risque accru de décès (Locatelli et al., 2019). L'insuffisance de la production d'érythropoïétine (EPO) est un facteur déterminant majeur reconnu de l'anémie dans l'IRC (Pappa, Dounousi, Duni et Katopodis, 2015). L'EPO est produite dans le foie etun rein, essentielle à la production d'érythrocytes (Lappin & Lee, 2019). Dans des conditions hypoxiques, le facteur inductible par l'hypoxie (HIF) peut activer l'expression de l'EPO (Sch¨odel & Ratcliffe, 2019). Cibler le HIF pour induire la production d'EPO a donc été considéré comme une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter l'anémie associée à l'IRC.

Le jujube est le fruit du moulin Ziziphus jujuba. (Rhamnaceae), également connue sous le nom de datte chinoise. Le jujube a une longue utilisation traditionnelle qui s'étend sur des milliers d'années en tant qu'herbe médicinale et complément alimentaire. Jujube est utilisé comme complément de santé pour les personnes souffrant de malnutrition hématogène ou de malnutrition chronique. Les polysaccharides de jujube (JP), un composant hydrosoluble composé de différents ratios de monosaccharide et d'acide uronique (Ji, Hou, Yan, Shi et Liu, 2020), sont l'un des ingrédients actifs du jujube (Ji et al., 2017 ), qui a été bien accepté pour présenter un effet hépatoprotecteur et une activité immunomodulatrice et améliorer la fonction de barrière intestinale (Liu et al., 2015, Yue et al., 2015). En effet, le JP est aussi communément considéré comme ayant des effets potentiels sur l'anémie. Cependant, le mécanisme moléculaire de JP dans le traitement de l'anémie est encore moins connu.

Ces dernières années, la métabolomique a été largement utilisée pour comprendre les facteurs potentiels qui contribuent à la progression de la maladie. La métabolomique ciblée a été largement utilisée pour identifier des marqueurs moléculaires de maladies humaines complexes telles que l'IRC. Le sulfate d'indoxyle (IS) et le sulfate de p-crésyle (PCS) ont été vérifiés comme étant le biomarqueur de la progression de l'IRC (Meijers et Evenepoel, 2011), et l'augmentation du degré de triméthylamine-N-oxyde (TMAO) pourrait directement entraîner une fibrose et un dysfonctionnement tubulo-interstitiel rénal (Tang et al., 2015). Les acides gras à chaîne courte (SCFA), les métabolites dépendants des microbes intestinaux, sont les substrats énergétiques capables d'affecter divers processus physiologiques (LeBlanc et al., 2017), et il a été rapporté que la réduction des SCFA contribue à la progression de l'IRC. (Koh, De Vader, Kovatcheva-Datchary, & B¨ ackhed, 2016, Wang et al., 2019). De plus, les SCFA ont pu protéger la structure rénale des dommages grâce à l'inhibition du stress oxydatif (Li, Ma et Fu, 2017). De manière concomitante, il a été démontré que les SCFA ont un effet bénéfique sur l'absorption du fer et régulent à la hausse l'expression des gènes de la globine embryonnaire/fœtale, ce qui induit l'érythropoïèse et corrige l'anémie (Tako, Glahn, Knez et Stangoulis, 2014). Le mécanisme des AGCC dans l'anémie rénale reste cependant à élucider.

Dans cette étude, nous émettons l'hypothèse que JP pourrait réguler la libération d'AGCC et stimuler la production d'EPO médiée par HIF, dont le résultat est de corriger l'anémie rénale. Ici, nous étudierons l'effet de JP dans l'amélioration de l'anémie rénale chez 5/6 rats CKD induits par néphrectomie, y compris les fonctions rénales et les paramètres hématologiques. Une approche métabolomique ciblée utilisant LC-MS/MS est développée pour déterminer huit AGCC, dont l'acide acétique, l'acide propanoïque, l'acide isobutyrique, l'acide butyrique, l'acide 2-méthylbutyrique, l'acide isovalérique, l'acide valérique et l'acide hexanoïque dans les matières fécales et des échantillons de rein et les niveaux d'AGCC ciblés sont évalués chez des rats sains et CKD. De plus, l'implication de la signalisation HIF chez les rats traités au JP est également révélée.

Fig. 1. Chromatographie GC–MS typique de JP. (A) Formules structurales de monosaccharide après dérivatisation de l'acétate d'aldononitrile ; (B) Les profils représentatifs de chromatographie ionique mixte (MIC) GC-MS du mélange standard de monosaccharides et des monosaccharides hydrolysés JP. Les pics des profils de chromatographie correspondaient au marqueur chimique indiqué en (A): 1. rhamnose, 2. arabinose, 3. fucose, 4. xylose, 5. mannose, 6. glucose, 7. galactose, 8. inositol (ISTD ).

2. Matériels et méthodes

2.1. Préparation de polysaccharide de jujube

Les fruits de Z. jujuba ont été achetés auprès de Shenzhen Huahui Pharmaceutical Co., Ltd. Les matériaux ont été authentifiés par le Dr Jianping Chen conformément à l'édition 2015 de la Pharmacopée de la République populaire de Chine. Les spécimens de référence ont été conservés à l'hôpital de médecine traditionnelle chinoise de Shenzhen sous le numéro 18100601.

Le JP brut a été extrait du jujube comme décrit précédemment, avec des modifications mineures (Ji et al., 2020). En bref, les jujubes ont été incubés avec 10 vol d'eau (v/w) dans un bain-marie à 80 ◦C pendant 3 h et extraits 3 fois. Après filtration, réunir les filtrats et condenser cet ensemble dans un évaporateur rotatif sous vide contrôlé. La solution concentrée a ensuite été précipitée en ajoutant quatre fois de l'éthanol (v/v) à 4 °C pendant 12 h. Le précipité a été recueilli par centrifugation et a été séché sous pression réduite jusqu'à siccité pour obtenir le JP brut. La pureté du JP a été déterminée à 80 % en utilisant la calorimétrie.

2.2. Caractérisation de la composition monosaccharidique du polysaccharide de jujube

Un système Shimadzu GC–MS (Shimadzu GC–MS TQ8040 interfacé avec Shimadzu GC 2010 plus) équipé d'une source EI, SH-Rxi-5colonne capillaire Sil MS (30 m × 0,25 mm DI, 0,25 µm d'épaisseur de film, Shimadzu) a été utilisé pour déterminer la dérivatisation des monosaccharides hydrolysés avec un rapport de fractionnement de 10:1. La température d'injection, la source d'ions et l'interface étaient de 250 ◦C, 200 ◦C et 250 ◦C. La température initiale de la colonne a été maintenue à 120 ◦C pendant 1 min, puis augmentée de 15 ◦C/min à 160 ◦C et maintenue pendant 4 min, 2 ◦C/min à 165 ◦C et maintenue pendant 2 min, 20 ◦C /

min à 195 ◦C, 5 ◦C/min à 250 ◦C, et maintenu pendant 3 min. Le débit de gaz porteur d'hélium a été maintenu à 46 cm/s et 2 μL de chaque échantillon ont été injectés dans l'instrument. Les analytes ont été quantifiés dans le mode de surveillance des ions sélectionnés (SIM), l'ion cible : rhamnose (m/z 129.00), arabinose (m/z 115.00), fucose (m/ z 103.00), xylose (m/z 115.00), mannose (m/z 115.00), glucose (m/z 115.00 ), galactose (m/z 115.00), inositol (m/z 126.00). Les normes de monosaccharides ont été répertoriées comme suit : L (plus)-arabinose (1506–200202), fucose (112014–201902), D-xylose (111508–201605), D-glucose (110833–201908), rhamnose (111683–201502 ), le galactose (100226–201807), le D-mannose (140651–201805) ont été achetés auprès des National Institutes for Food and Drug Control. L'inositol a été obtenu auprès de Sigma (I 7508-50 g).

Le JP extrait (10 mg) a été hydrolysé en monosaccharides avec 10 mL d'acide trifluoroacétique (TFA) 2 mol/L à 105 ◦C pendant 3 h, et les monosaccharides hydrolysés de JP ont été concentrés et lavés sous pression réduite à 60 ◦C pour éliminer le TFA et le résidu a été reconstitué avec 2 ml d'eau. Ajouter 250 µL de solution de chlorhydrate d'hydroxylamine/pyridine à 20 mg/mL dans 100 µL de solution de monosaccharides hydrolysés et conserver dans un bain-marie à 90 °C pendant 45 min. Ensuite, 250 µL d'anhydride acétique ont été ajoutés et maintenus dans un bain-marie à 90 ◦C pendant encore 45 minutes. A la fin de la réaction, le mélange a été extrait par 1 ml de cyclohexane 5 fois, et la couche de cyclohexane a été concentrée à 1 ml. Injecté 1 µL de surnageant dans GC-MS pour analyse (Li & Shi, 2013).

2.3. Animaux

Toutes les expériences ont été réalisées avec des protocoles approuvés par le Comité institutionnel d'utilisation des soins aux animaux de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou. Des rats Sprague-Dawley, mâles et femelles, pesant 180-220 g, ont été obtenus auprès du Guangdong Medical Laboratory Animal Center (Foshan, Chine, Permission No. SCXK (Yue) 2008-0002) et maintenus dans un environnement exempt d'agents pathogènes (SPF ) animalerie sous un cycle lumière-obscurité de 12 h, avec de la nourriture et de l'eau librement.

En cas d'insuffisance rénale induite, une néphrectomie 5/6 a été réalisée selon la description précédente (Chen et al., 2019). Toute l'intervention chirurgicale a été réalisée sous anesthésie avec 10 % d'hydrate de chloral. Le groupe d'opérations factices (n=6) a suivi les mêmes étapes pour ouvrir la cavité abdominale et exposer le rein. Les rats de néphrectomie 5/6 ont été divisés au hasard en deux groupes. Rats sans traitement (groupe CKD, n=6) et rats recevant JP (groupe CKD plus JP, n=6) ​​par voie orale par gavage à une dose de 1,2 g/kg/j. Après 90 jours de fonctionnement, 90 jours d'administration ont commencé. Le 90e jour était le moment de l'administration finale de JP aux rats, et après 24 h, les animaux ont été sacrifiés en prélevant du sang de l'aorte abdominale, et les échantillons d'urine, de matières fécales, de sérum et de reins ont été prélevés sur chaque rat. Tous les échantillons ont été stockés à − 80 ◦C avant une analyse plus approfondie.

2.4. Analyse biochimique

Conformément aux instructions du fabricant, l'azote uréique du sang (BUN) et la créatinine sérique (Scr) ont été mesurés par le kit de détection de sérum de créatinine et le kit de détection de BUN (WAKO, Ginza, Japon), et la protéine urinaire a été mesurée par le kit Elisa (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institution, Nankin, Chine). Les globules rouges (RBC), l'hémoglobine (Hb), l'hématocrite (HCT) et la numération plaquettaire (PLT) ont été analysés par Hematology Systems (Siemens 2021i, Erlangen, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant.

2.5. Examen histologique

L'acide périodique Schiff (PAS) et la coloration de Masson ont été utilisés pour évaluer la lésion pathologique rénale, parmi eux, la coloration PAS a été utilisée pour révéler l'atrophie tubulaire rénale et la zone glomérulaire, et la coloration de Masson était pour la fibrose interstitielle rénale (Xie et al. , 2020). La méthode d'analyse quantitative a été menée selon des études antérieures (Chen et al., 2019). En bref, le score d'atrophie tubulaire dans la coloration PAS a été défini comme suit : 1. tubule atrophique unique rare ; 2. plusieurs grappes de tubules atrophiques ; 3. atrophie massive. La zone glomérulaire a été mesurée par le logiciel ZEN 3.1 (Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Allemagne). La zone fibrotique dans la coloration de Masson a été mesurée à l'aide du logiciel Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Au moins dix champs microscopiques (200×) de 6 rats par groupe ont été capturés au hasard pour mesurer le score d'atrophie, la zone glomérulaire et la zone fibrotique, avec au moins un glomérule dans chaque champ microscopique.

2.6. Analyse immunohistochimique

La section de paraffine rénale (4 μm) de chaque échantillon a été déshydratée graduellement par du xylène deux fois, et un gradient d'éthanol (100–95–90–80–70 pour cent), l'antigène a été récupéré avec un tampon d'acide citrique (pH 6,0 ) pendant 30 min, bloqué par du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 10 min et du sérum de chèvre pendant 30 min à température ambiante. Les coupes de tissus ont été incubées séparément par l'anticorps primaire HIF-1 (Bioss, bs-0737R, 1 : 500, Lot : BA01279129), HIF-2 (Bioss, bs-1447 R, 1: 500, Lot: BJ2044786) à 4 ◦C pendant 10 h et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la HRP (Abcam, ab6712, 1: 1000) à température ambiante pendant 30 min, du DAB (diaminobezid in) a été utilisé pour détecter l'activité HRP, le noyau a été contre-coloré par l'hématoxyline. la. L'immunohistochimie a été analysée sous des champs microscopiques 400 × de chaque groupe et a fixé la barre d'échelle=20 μm par Axio Scope A1, ZEISS, Jena, Allemagne. Le nucléaire était une coloration bleue par l'hématoxyline et l'immunopositivité du DAB était brune, la coloration DAB plus profonde signifie une immunohistochimie plus forte.

2.7. Détection d'EPO

La teneur en EPO sérique a été détectée par le kit ELISA (Abcam, ab274398) et l'expérience faisait référence au protocole du kit ELISA. Comme résumé, ajouter un cocktail d'anticorps EPO dans l'échantillon et incuber pendant 1 h. après incubation, laver chaque puits par du tampon de lavage 3 fois, ajouter du TMB au second incubé pendant 15 min et stopper la réaction.

L'ARNm total du rein a été extrait du tissu rénal congelé à l'aide de Trizol et traduit l'ARNm en ADNc. La PCR en temps réel a été réalisée avec Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA, K0223) selon le protocole du fabricant. Le signal vert SYBR a été acquis et mesuré par le système de détection de séquence ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les amorces étaient : 5′-CCG TCC CAG ATA CCA AAG TC-3′ et 5′-ACC CGA AGC AGT GAA GTG-3′ pour les rats EPO (214 bps, NM_017001. 2); 5′- GTC GGT GTG AAC GGA TTT G-3′ et 5′-TCC CAT TCT CAG CCT TGA C- 3′ pour GAPDH (181 bps, NM_017008.3), le gens de ménage comme contrôle interne dans tous les cas. Et la quantification relative de l'expression génique a été calculée par la méthode d'expression génique normalisée (2− ΔΔCT).

Des quantités égales de protéines de lysats de cortex rénal ont été chargées et séparées par un gel SDS à 10 %, puis transférées sur des membranes de nitrocellulose. Après avoir été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 2 h à température ambiante, les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit. Ensuite, les membranes ont été incubées avec de l'IgG anti-souris conjuguée à la HRP (peroxydase de raifort) (Life Technologies) à température ambiante pendant 45 min. L'activité HRP a été visualisée à l'aide du substrat Clarity Western ECL et analysée par le système d'imagerie Tanon. L'anticorps primaire suivant a été utilisé dans cette étude : l'EPO monoclonale (B- 4) de souris (Santa Cruz Biotechnology, sc-5290, dilution 1/500), l'actine monoclonale de souris (Cell signaling technology, 8H10D10, dilution 1/1000).

2.8. Analyse des acides gras à chaîne courte

Un système Shimadzu UHPLC-LCMS/MS (Shimadzu LC-MS 8045 interfacé avec Shimadzu LC-20AD) équipé d'une source ESI.

Les séparations chromatographiques ont été effectuées sur une colonne Shim-pack GIST C18 (2,1 × 100 mm, 2 μm), en utilisant {{10}},1 % d'acide formique dans de l'eau ( solvant A) et acétonitrile (solvant B) à un débit de 0,3 mL/min par une élution en gradient : 0–9 min, 25–30 % B ; 9–11 min, 30–40 % B ; 11–20 min, 40–50 % B ; 20–20,1 min, 50–100 % B ; 20,1–23 min, 100 % B ; 23,1 min–25 % B pour le rééquilibrage. La température de la colonne était de 35 ◦C et l'échantillonneur automatique a été maintenu à 4 ◦C pendant l'analyse, 1 μL de chaque échantillon a été injecté dans l'instrument. La détection de l'analyte a été effectuée en mode de surveillance de réactions multiples (MRM), fonctionnant en mode ions positifs. Les paramètres MS : Gaz de nébulisation circulant : 3,0 L/min ; Gaz de séchage circulant : 10 L/min ; Gaz de chauffage circulant : 10 L/min ; Température DL : 250 ◦C ; température d'interface : 300 ◦C ; Bloc chauffant : 400 ◦C. Les transitions MRM et l'énergie de collision (CE) ont été sélectionnées et optimisées par infusion directe de chaque dérivé standard. Les transitions MRM des quantités d'analytes ont été résumées dans le tableau S1.

AGCC fécaux : Ajout de 100 μL d'acétonitrile à 50 % dans 3 mg de matières fécales lyophilisées et vortex pendant 2 min. Puis le mélange a été centrifugé à 12000 rpm pendant 10 min à 4°C et pipeté le surnageant.

AGCC rénaux : Peser 100 mg de tissu rénal et vortexer sur de la glace avec 4 fois une solution saline normale (100 mg/400 μL) pour préparer l'homogénat tissulaire. On ajoute 3 fois du méthanol froid dans 300 μL d'homogénat tissulaire et on agite au vortex pendant 2 min, puis le mélange est centrifugé à 12000 tr/min pendant 10 min à 4 ◦C et on pipette le surnageant. Le surnageant a été séché par N2 et reconstitué par 100 μL d'acétonitrile à 50 %.

Ajout de 500 mmol/L de chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-Ń -éthyl carbodiimide (EDC, Aladdin, Shanghai, Chine), 50 mmol/L de 3H-[1,2,3]-Triazolo[4, 5-b] pyridine-3-ol (HOAT, Aladdin, Shanghai, Chine) et 50 mg/mL de 12C-Dansylhydrazine (12C-DnsHz, J&K, Pékin, Chine) dans 20 μL de l'échantillon d'extraction dans séquence avec le même volume. L'EDC et le HOAT ont été préparés avec de l'acide éthanesulfonique 2-(N-Morpholino) frais de 500 mmol/L (MES, Macklin, Shanghai, Chine). Après incubation à 20 ◦C pendant 90 min, 20 μL 50 mmol/L CuCl2 (Macklin, Shanghai, Chine) ont été ajoutés au mélange pour désactiver la réaction de dérivatisation à 40 ◦C pendant 30 min (Zhao & Li, 2018). A la fin de la dérivatisation, le mélange a été dilué 10 fois avec 25 % d'acétonitrile. Avant l'analyse, 100 μL de surnageant ont été mélangés avec une solution d'étalon interne de 100 μL. Le marqueur 13C-DnsHz a été utilisé comme étalon interne (ISTD1-8) conformément à la même réaction de dérivatisation. La norme SCFA : acide acétique (AA, A116173), acide propanoïque (PA, P110446), acide isobutyrique (IBA, I103524), acide butyrique (BA, B110438), 2-acide méthylbutyrique (2- BA, M107377), l'acide isovalérique (IVA, I108280), l'acide valérique (VA, V108271), l'acide hexanoïque (HA, H103632) ont été fournis par Aladdin (Shanghai, Chine).

2.9. analyses statistiques

Les données de chaque groupe ont été exprimées en moyenne ± écart type (SD). La signification statistique entre les groupes a été réalisée par ANOVA unidirectionnelle et analyse post hoc avec le test de Student-Newman-Keuls (SNK) ou le test T3 de Dunnett. La valeur de P < 0.05="" a="" été="" considérée="" comme="" statistiquement="" significative.="" toutes="" les="" données="" ont="" été="" obtenues="" à="" l'aide="" du="" logiciel="" de="" statistiques="" spss="" (version="" 22.0,="" spss="" inc.,="" chicago,="" il,="">

3. Résultats

3.1. JP a amélioré la fonction rénale des rats CKD

Le monosaccharide de JP a été caractérisé avant traitement sur des animaux. Le JP utilisé dans la présente étude était composé de sept monosaccharides, à savoir le rhamnose (1,62 %), l'arabinose (15,79 %), le fucose (0.21 %), le xylose (4,56 %), le mannose (3. 00 pour cent), glucose (73,44 pour cent) et galactose (4,99 pour cent) (Fig. 1). Notre méthode d'analyse a été validée par la linéarité, la précision, la répétabilité, la stabilité et la récupération (tableaux S2–S3). Les analytes ont été confirmés stables à température ambiante pendant 24 h. Le rendement en JP doit être supérieur à 8,63 % et la pureté ne doit pas être inférieure à 77,16 %. L'analyse chimique susmentionnée de JP a servi d'approche de contrôle de la qualité pour assurer la reproductibilité des études animales ci-dessous.

Scr, BUN et les protéines urinaires étaient les plus représentatives des fonctions rénales. Les niveaux de Scr, BUN et de protéines urinaires chez les rats CKD étaient significativement plus élevés que ceux du groupe fictif (P <{0}}.01). après="" 90="" jours="" de="" traitement="" avec="" jp,="" les="" niveaux="" de="" scr,="" bun="" et="" de="" protéines="" urinaires="" ont="" diminué="" par="" rapport="" au="" groupe="" ckd="" (p=""><0, 01)="" (fig.="" 2a="" –="">

3.2. JP a amélioré la lésion pathologique rénale chez les rats CKD

Le poids du rein droit entier pour le groupe fictif et le rein droit restant pour le groupe CKD et CKD plus JP ont été utilisés pour l'évaluation de la morphologie rénale par le poids du rein (KW) et le poids du rein / poids corporel (KW / BW). À la fin des expériences, les KW et KW/BW du groupe CKD ont été augmentés par rapport au groupe fictif (tous P < {{0}}.05).="" dans="" le="" modèle="" ckd="" induit="" par="" la="" néphrectomie="" 5/6,="" la="" réduction="" des="" activités="" protéinases="" rénales="" a="" provoqué="" une="" croissance="" rénale="" compensatoire="" chez="" les="" entreprises="" atteintes="" d'hypertrophie="" rénale="" (morton="" &="" griffiths,="" 1985),="" et="" nous="" avons="" confirmé="" cette="" affirmation.="" après="" le="" traitement="" jp,="" kw="" a="" diminué="" de="" manière="" significative="" (p=""><0.05) et="" fermé="" à="" un="" groupe="" fictif="" (p="" ˃="" 0,05) ;="" tandis="" que="" le="" kw/bw="" était="" légèrement="" diminué="" (p="" ˃="" 0,05).="" (fig.="">

Fig. 2. JP a protégé la fonction rénale chez les rats CKD. Le niveau de Scr (A), BUN (B) et de protéines urinaires (C) dans différents groupes. (D) poids des reins, (E) KW/BW. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± ET, n=6 par groupe (**P < 0.01="" par="" rapport="" au="" groupe="" fictif ;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" au="" groupe="">

Dans le groupe CKD, les tubules rénaux présentaient une atrophie massive par rapport au groupe fictif (P <{0}}.01), et="" la="" zone="" glomérulaire="" et="" la="" fibrose="" interstitielle="" rénale="" étaient="" près="" de="" deux="" fois="" supérieures="" à="" celle="" du="" groupe="" fictif="" en="" analyse="" quantitative="" (p="">< 0.01).="" après="" le="" traitement="" jp,="" le="" score="" d'atrophie="" tubulaire="" a="" diminué="" de="" près="" de="" deux="" fois="" (p="">< 0,01),="" la="" zone="" glomérulaire="" a="" été="" presque="" récupérée="" dans="" un="" groupe="" fictif="" (p="">< 0,01)="" et="" la="" fibrose="" interstitielle="" rénale="" a="" diminué="" d'un="" tiers="" (p="">< 0,01)="" comme="" par="" rapport="" au="" groupe="" ckd="" (fig.="">

Fig. 3. JP a protégé la structure rénale chez les rats CKD. (A) coloration PAS. (B) Coloration de Masson. (C) Score d'atrophie tubulaire. (D) Zone glomérulaire (E) Zone fibrotique. Toutes les images sont présentées à un grossissement identique, 200×, barre d'échelle=100 μm. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SD, n=6 par groupe (**P < 0.01="" par="" rapport="" au="" groupe="" fictif ;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" au="" groupe="" ckd="">

3.3. JP a modulé les paramètres hématologiques chez des rats CKD

Pour l'analyse biochimique des paramètres hématologiques, RBC, Hb, HCT et PLT ont été mesurés. Chez les rats CKD, le niveau de RBC est passé de 9,06 à 7,20 × 1012/L, Hb de 15,28 à 13,22 g/dL, HCT de 47,1 à 40,4 % et PLT augmenté de 1012 à 1526 × 109/L par rapport à un groupe fictif (P < 0,01),="" ce="" qui="" indique="" que="" les="" signes="" d'anémie="" ont="" été="" observés="" chez="" les="" rats="" ckd.="" les="" taux="" réduits="" de="" rbc,="" hb,="" hct="" et="" plt="" chez="" les="" rats="" ckd="" traités="" par="" jp="" ont="" été="" restaurés="" (p=""><0, 01)="" (fig.="">

Fig. 4. JP a réhabilité les paramètres hématologiques chez des rats CKD. Le niveau de PLT (A), RBC (B), Hb (C), HCT (D). Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± ET, n=6 par groupe (**P < 0.01="" par="" rapport="" au="" groupe="" fictif ;="" #p="">< 0.05="" ,="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" au="" groupe="">

3.4. JP a stimulé l'expression de l'EPO

Par rapport au groupe fictif, le taux sérique d'EPO et la quantité d'ARNm d'EPO rénale ont été significativement diminués chez les rats atteints d'anémie CKD (P <0.01). l'analyse="" western="" blot="" a="" révélé="" que="" le="" niveau="" de="" protéine="" epo="" présentait="" de="" légères="" diminutions="" dans="" le="" groupe="" ckd="" sans="" différence="" significative.="" après="" le="" traitement="" jp,="" le="" taux="" sérique="" d'epo,="" l'arnm="" de="" l'epo="" rénale="" et="" les="" protéines="" ont="" été="" significativement="" améliorés="" par="" rapport="" au="" groupe="" ckd="" (p=""><0.01 ou="" p=""><0,05) (fig.="" 5a="" –="">

Dans le cortex rénal, HIF-1 était principalement produit par les cellules épithéliales tubulaires rénales, HIF-2 était principalement exprimé dans les cellules endothéliales et les fibroblastes interstitiels rénaux (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). L'analyse immunohistochimique a montré que, comme pour HIF-1, chez les rats CKD, les tubulaires étaient plus colorés que le groupe fictif. Après le traitement JP, le tubule rénal présentait une coloration de surface plus forte et plus grande par rapport au groupe CKD, comme l'indique la flèche rouge sur la figure 5E. HIF -2 a montré une immunohistochimie relativement faible positive à l'interstitiel rénal dans le groupe Sham. Dans le groupe CKD, HIF -2 a montré une immunohistochimie positive. Après le traitement JP, HIF -2 a montré une immunohistochimie plus forte par rapport au groupe CKD (Fig. 5F).

Fig. 5. JP a stimulé l'expression de l'EPO. (A) Teneur en EPO sérique. (B)Un reinARNm relatif à l'EPO. GAPDH était considéré comme un gène de ménage. (C) Les images Western blot représentatives de l'expression de la protéine EPO. (D) Analyse densitométrique de l'EPO. (E) Immunohistochimie de HIF{{0}}. (F) Immunohistochimie de HIF- 2 normalisée à la teneur en -actine. Les images d'immunohistochimie sont présentées à un grossissement identique, 400×, barre d'échelle=20 μm. Le nucléaire était une coloration bleue par l'hématoxyline et l'immunopositivité du DAB était brune, la coloration DAB plus profonde signifie une immunohistochimie plus forte. La flèche rouge indique que l'immunohistochimie est positive. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SD, n=6 par groupe (*P < 0,05="" par="" rapport="" au="" groupe="" fictif ;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" par="" rapport="" au="" groupe="">

3.5. JP a induit la libération de SCFA

Une approche métabolomique ciblée basée sur la LC-MS a été développée pour quantifier la libération de huit AGCC dans les échantillons fécaux. La méthode établie a été validée en évaluant la linéarité, la sensibilité, la précision, l'effet de matrice, l'exactitude et la stabilité. Des échantillons de contrôle de qualité à faible, moyenne et haute concentration (LQC, QMC, HQC) pour la validation de la sensibilité, de la précision, de l'exactitude et de la stabilité ont été sélectionnés en fonction des points de concentration les plus bas, moyens et les plus élevés de la courbe standard de la matrice, et les résultats ont été présentés dans les tableaux S4 à S6. Les analytes ont été confirmés stables à 4 ◦C pendant 48 h. Le chromatogramme LC-MS/MS des SCFA est illustré à la Fig. 6.

Fig. 6. Chromatographie UHPLC-MS/MS des AGCC. (A) La partie supérieure était l'équation chimique de dérivation SCFAs; le dessous était la formule structurale des SCFA après dérivation dansylhydrazine ; (B) Le chromatogramme UHPLC/MRM-MS des normes de mélange et de l'échantillon fécal, les pics chromatographiques en (B) ont été cor répondu au marqueur chimique indiqué en (A):1. acide 12C-acétique; 2. Acide 13C-acétique (ISTD1); 3. Acide 12C-propanoïque; 4. Acide 13C-propanoïque (ISTD2); 5. Acide 12C-isobutyrique; 6. Acide 12C-butyrique; 7. Acide 13C-isobutyrique (ISTD3); 8. Acide 13C-butyrique (ISTD4); 9. Acide 12C-2-méthylbutyrique ; 10. Acide 12C-isovalérique; 11. Acide valérique 12C ; 12. Acide 13C-2-méthylbutyrique (ISTD5) ; 13. Acide 13C-isovalérique (ISTD6); 14. Acide 13C-valérique (ISTD7); 15. Acide 12C-hexanoïque; 16. Acide 13C-hexanoïque (ISTD8).

En ce qui concerne l'échantillon fécal, dans le groupe CKD, les niveaux d'AA et de PA ont été nettement diminués de près de 4 fois et 5 fois par rapport à un groupe fictif (P <0.01) ; tandis="" qu'après="" le="" traitement="" jp,="" les="" quantités="" d'aa="" et="" de="" pa="" ont="" été="" restaurées="" à="" 4/5="" du="" groupe="" fictif="" (p=""><{{10}}.01). de="" même,="" les="" niveaux="" de="" ba="" et="" va="" ont="" été="" fortement="" diminués="" près="" de="" 30="" fois="" et="" 4="" fois="" dans="" le="" groupe="" ckd="" par="" rapport="" à="" un="" groupe="" fictif="" (p=""><0.01). le="" traitement="" jp="" a="" montré="" une="" tendance="" à="" la="" hausse="" mais="" pas="" une="" amélioration="" significative.="" le="" contenu="" de="" iba,="" iva="" et="" 2-ba="" n'a="" pas="" montré="" de="" changement="" notable="" entre="" ckd="" et="" groupe="" fictif.="" après="" le="" traitement="" jp,="" les="" niveaux="" d'iba,="" d'iva="" et="" de="" 2-ba="" ont="" été="" augmentés="" (p="">< 0,01). cependant,="" ha="" n'a="" pas="" montré="" de="" changement="" évident="" parmi="" les="" trois="" groupes="" (fig.="" 7a).="" de="" plus,="" comme="" pour="" le="" tissu="" rénal,="" dans="" le="" groupe="" ckd,="" les="" quantités="" de="" huit="" agcc="" étaient="" toutes="" significativement="" diminuées="" (p="">< 0,01),="" tandis="" qu'après="" le="" traitement="" jp,="" les="" niveaux="" d'agcc="" étaient="" augmentés="" sauf="" pour="" ba="" et="" ha="" (p="">< 0,01="" ou="" p="">< 0,5).="" ba="" a="" été="" légèrement="" augmenté="" sans="" significativement,="" et="" ha="" n'a="" pas="" montré="" de="" changement="" après="" le="" traitement="" jp="" (fig.="">

Fig. 7. Contenu des SCFA dans différents groupes. (A) AGCC fécaux. (B) AGCC rénaux. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SD, n=6 par groupe (**P < 0.01="" par="" rapport="" au="" groupe="" fictif ;="" ##p="">< 0.="" 01,="" #p="">< 0,05="" par="" rapport="" au="" groupe="">

4. Discussion

Dans le présent modèle de rat CKD néphrectomie 5/6, leun reinfonctionindicateurs (Scr, BUN et protéines urinaires) ont été significativement augmentés, l'hypertrophie rénale résiduelle et l'atteinte rénale pathologique sont apparues, accompagnées de paramètres hématologiques modifiés. Ces données étaient conformes aux études précédentes (Garrido et al., 2015, Morton & Griffiths, 1985). Les indicateurs ci-dessus ont montré que les rats atteints d'anémie CKD induite par la néphrectomie 5/6 ont été établis avec succès et ont pu être vérifiés pour l'effet bénéfique de JP dans le traitement des rats atteints d'anémie CKD. Avec leun reinfonctionencore détériorée, l'anémie a été reconnue comme une complication opportuniste connue de l'IRC, qui a eu un impact négatif sur la qualité de vie des patients (Locatelli, Fishbane, Block et Macdougall, 2017). Comprendre les facteurs de risque liés à l'évolution de l'anémie rénale permettra de développer des approches thérapeutiques. De nos jours, le lien entre la maladie et le métabolisme du microbiote intestinal attire de plus en plus l'attention, tandis que la relation entre les AGCC et l'anémie rénale est encore moins connue. Les SCFA, principalement métabolisés par Clostridium, Coprococcus et Bacteroides (Koh et al., 2016), ciblent des récepteurs spécifiques liés à la membrane, qui jouent un rôle important dans le maintien de l'équilibre de l'environnement intestinal et de la santé de tout le corps. Il a déjà été prouvé que les SCFA ont une relation inséparable avec la MRC, et les niveaux d'acide acétique, d'acide propionique et d'acide butyrique ont été réduits dans la MRC (Wang et al., 2019). Chez les rats CKD induits par l'adénine, l'abondance et la diversité du microbiote intestinal ont été considérablement modifiées, les entreprises ont réduit le niveau d'acide propanoïque, d'acide butyrique et d'acide valérique (Lakshmanan, Al, Ali et Terranegra, 2021). Sur la base de notre étude précédente, le séquençage de l'ADNr 16S a montré que la dysbiose du microbiote intestinal était présente chez 5/6 rats CKD induits par néphrectomisation par rapport au groupe fictif. Certains des SCFA produisant des genres, en particulier l'acide butyrique de Clostridium, Coprococcus ont réalisé des différences chez les rats CKD (Zheng et al., 2020). Dans cette optique, nos résultats ont montré que les quantités d'acide acétique, d'acide propionique, d'acide butyrique et d'acide valérique étaient diminuées d'environ 60 %, 80 %, 85 % et 60 % chez les rats CKD, indiquant que la diminution des SCFA correspondait avec le déséquilibre de l'environnement intestinal. Il convient de noter que le trouble de l'environnement intestinal induit par la MRC a déclenché un métabolisme anormal du microbiote intestinal (Feng et al., 2019). De plus, nous avons constaté que, chez les rats atteints d'anémie CKD, huit types de niveaux d'AGCC étaient diminués. Par exemple, l'anomalie des produits finaux métaboliques, c'est-à-dire les AGCC, pourrait résulter de la progression de la MRC.

Des polysaccharides, l'un des ingrédients actifs, ont été trouvés dans diverses herbes, telles que Dioscoreae Rhizoma, Schisandra Chinensis, Astragali Radix et Jujubae Fructus. Les polysaccharides peuvent être fermentés et dégradés par le microbiote intestinal. En conséquence, les polysaccharides sont présentés comme un substrat permettant au microbiote intestinal de se métaboliser en AGCC ou sont considérés comme possédant un effet de type prébiotique pour améliorer la composition du microbiote intestinal afin de faciliter la production d'AGCC (Cai et al., 2019). Dans cette étude, nos résultats ont révélé que les polysaccharides du jujube stimulaient la libération d'AGCC par le microbiote intestinal, tels que l'acide acétique, l'acide propanoïque, l'acide isobutyrique, l'acide 2-méthylbutyrique chez les rats CKD. De plus, après le traitement JP, le niveau d'AGCC dans les reins de rats souffrant d'anémie CKD a été amélioré et la tendance au changement était cohérente avec l'échantillon fécal. Sur la base des recherches existantes, la relation entre les AGCC et l'IRC est devenue progressivement claire. Par exemple, il a été rapporté que l'acide acétique module le système immunitaire et améliore lesun reinblessureen inhibant la signalisation de la NADPH oxydase dans les lymphocytes T (Al-Harbi et al., 2018). Il a été prouvé que l'acide propanoïque empêche la progression de l'IRC induite par l'adénine via le récepteur 2 des acides gras libres (FFA2) et FFA3 (Mikami et al., 2020). Par conséquent, nous avons déduit que la récupération du niveau d'AGCC rénal était bénéfique pour un rein malade. Il a été rapporté que JP augmentait la diversité du microbiote intestinal et augmentait l'abondance relative du microbiote actif des AGCC (Bacteroides) chez les souris atteintes d'un cancer colorectal (Ji et al., 2020). De plus, JP a augmenté la concentration d'AGCC totaux dans les échantillons fécaux (Ji et al., 2019). Par conséquent, nous avons déduit que JP pourrait stimuler la production d'AGCC pour atteindre l'objectif de retarder la progression de la MRC. JP pourrait également être un substrat métabolique pour le microbiote dominant des SCFA afin de stimuler la production de SCFA dans l'IRC, ou un composant de type prébiotique pour restaurer l'environnement intestinal, en particulier la diversité du microbiote dominant des SCFA, et favoriser davantage la libération des SCFA, de manière à empêcher la progression de la MRC.

En général, les AGCC (autocopiants supérieurs à 6) de faible poids moléculaire et de polarité chimique élevée sont difficiles à analyser directement par des approches chromatographiques. Une stratégie de dérivatisation chimique marquée par isotope des SCFA pourrait améliorer la sensibilité de l'instrument et réduire les erreurs d'analyse, ce qui a fourni une stratégie utile pour la détermination des SCFA dans l'analyse LC-MS/MS (Higashi & Ogawa, 2016). Récemment, des approches marquées à la dansyl hydrazine ont été utilisées de manière satisfaisante pour détecter les métabolites plasmatiques humains cibles contenant de l'acide carboxylique (Chen & Zhang, 2020). À l'appui de cela, dans cette étude, nous avons développé une dérivatisation chimique basée sur l'approche LC-MS/MS pour la détermination de 8 SCFA dans les fèces de rat. Les AGCC sont produits par le microbiote intestinal et près de 10 % des AGCC sont excrétés par les matières fécales (Boets et al., 2015). Par conséquent, une analyse d'échantillons fécaux d'AGCC peut refléter directement les changements dans l'environnement intestinal et a plus de référence dans l'analyse conjointe multi-omique entre les AGCC et le microbiote intestinal. Notamment, validation de l'instabilité, nous avons constaté que les SCFA marqués à la dansyl hydrazine étaient instables à température ambiante et que leur intensité sur le spectre de masse montrait une tendance à la baisse avec le temps, mais qu'elle pouvait rester stable pendant 48 h à 4 ◦C. Ainsi, après la dérivatisation des SCFA, les analytes doivent être conservés à 4 ◦C avant l'analyse.

Aux stades 4 à 5 avancés de l'IRC, le déficit de production d'EPO limite l'érythropoïèse, qui contribue au facteur le plus critique du développement de l'anémie rénale (Sakashita, Tanaka et Nangaku, 2019). Le traitement de routine avec des agents stimulant l'érythropoïèse (ASE) pour l'anémie est suggéré par les directives de pratique clinique. Cependant, la sécurité des ASE qui est associée à un risque accru de décès et d'événements cardiovasculaires doit être prise en compte (Thavarajah & Choi, 2019). Chez les patients atteints d'anémie rénale, l'expression de l'EPO devait être constante ou élevée à vue par rapport aux corps sains (Babitt & Lin, 2012). À un stade précoce, le niveau d'EPO a présenté la tendance à la mise à niveau, tandis qu'à un stade avancé, le niveau d'EPO a montré une tendance à la baisse par rapport au stade précoce, même inférieur à la normale (Panjeta, Tahirovi´c, Sofi's, ´ Cori's, & Derviˇsevi ´c, 2017). Correspondant aux expériences précédentes (Chen et al., 2019; Wang et al., 2020), nos résultats ont indiqué que le taux sérique d'EPO était diminué chez les rats atteints d'anémie CKD. Nous avons respectivement détecté le niveau d'ARNm et de protéines d'EPO rénale chez les rats CKD, et le niveau de protéines d'EPO rénale a légèrement diminué par rapport au groupe fictif, tandis que la quantité d'ARNm d'EPO rénale était dégradée et son degré était supérieur au niveau d'EPO sérique. Le rein est la principale source de synthèse d'EPO chez les adultes et les patients ERSD.reinsconserve toujours la capacité de produire de l'érythropoïétine (Bernhardt et al., 2010). Pour corriger les taux sériques endogènes d'EPO et s'adapter à l'anémie rénale, la production rénale d'EPO a été activée, bien queun reinblessureréduction de l'expression de l'ARNm de l'EPO (Sch¨ odel & Ratcliffe, 2019). Après le traitement JP, le niveau d'EPO sérique a été augmenté, ainsi que les niveaux d'ARNm et de protéines d'EPO rénale ont tous deux été améliorés. Dans notre étude précédente, JP pouvait stimuler l'activité transcriptionnelle HRE et améliorer le gène EPO (Chen et al., 2014). Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que JP pourrait récupérer le niveau d'EPO sérique de rat CKD à une anémie rénale régulée, ce qui pourrait être dû à l'expression stimulée du gène de l'EPO rénale au niveau de l'ARNm.

Dans le cortex, HIF-1 a été trouvé principalement dans les tubules et HIF-2 dans l'interstitium rénal. Étant donné que l'EPO est principalement produite par des fibroblastes dans lesquels HIF-2 est co-localisé, cela confirme que HIF-2 peut être responsable de la régulation de la production d'EPO (Maxwell, 2003). Dans notre étude, nous avons constaté que HIF-1 et HIF-2 pouvaient être activés par l'IRC, et que le traitement JP pouvait stimuler l'activité HIF-1 et HIF-2 par rapport aux rats CKD . Il a été prouvé que le HIF-2 a un rôle majeur dans la régulation de la production d'EPO (Kapitsinou et al., 2010), tandis que la régulation positive du HIF-1 peut jouer un effet de protection rénale dans le rein (Jiang et al., 2020), qui améliore indirectement la production d'EPO. La production rénale d'EPO était d'abord régulée au niveau de l'ARNm, sous anémie ou hypoxie, l'expression de l'ARNm d'EPO pouvait être augmentée par la stimulation de la protéine HIF. Auparavant, des recherches pharmacologiques ont montré que le jujube stimulait l'expression de l'EPO via la régulation du niveau de protéine HIF dans le modèle cellulaire (Chen et al., 2014, Lam et al., 2016). Par conséquent, nous avons déduit que JP peut réguler à la hausse l'expression de l'ARNm de l'EPO via la protéine HIF pour atteindre l'objectif de soulager l'anémie rénale.

En outre, sur la base des résultats actuels, nous supposons que la réduction des SCFA peut jouer un rôle crucial dans l'expression de l'EPO médiée par HIF, qui contribue à l'anémie CKD. Contrairement à cela, il a été démontré que l'augmentation du niveau d'acide acétique était bénéfique pour l'acétylation de HIF-2 et la génération du complexe CREB-binding protein-HIF 2, et induisait davantage l'expression de l'EPO (Xu et al., 2014). L'acide propionique a atténué la perturbation mitochondriale, l'apoptose hippocampique et les déficits neurologiques via la voie HIF-1/ERK (Cheng et al., 2019). De plus, il a été constaté que l'acide butyrique stabilisait le HIF-1, activait les gènes cibles du HIF sur les cellules du côlon et atténuait la réponse inflammatoire du côlon (Kelly et al., 2015). Dans notre étude, nous avons constaté que les niveaux d'acide acétique, d'acide propanoïque et d'acide butyrique étaient significativement diminués, accompagnés d'une expression anormale de la protéine HIF- chez les rats CKD, ce qui indiquait que la stabilité de HIF- pourrait être liée à la diminution des SCFA, et les SCFA pourraient avoir l'effet de stabilisation du HIF pour réguler l'expression de l'EPO.

5. Conclusions

En conclusion, nous avons prouvé que JP améliorait l'IRC et son anémie associée, dont le mécanisme était impliqué dans la régulation de la libération d'AGCC et de la production d'EPO. Et JP pourrait être l'ingrédient bioactif du jujube pour le traitement de l'anémie. Ces résultats peuvent fournir des preuves pour le développement ultérieur de JP en tant que compléments alimentaires pour le traitement de l'anémie associée à la MRC.

Déclaration éthique

Toutes les expérimentations animales dans notre recherche ont été menées avec des protocoles approuvés par le comité d'éthique de l'Université de médecine chinoise de Guangzhou et conformément aux directives des National Institutes of Health pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications No. 80-23, révisé 1996). Il n'y a aucune violation des directives ci-dessus dans notre recherche.

Remerciements

Ce travail est soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (2018A030313305), la Fondation des sciences naturelles de Chine (81804052, 81973577 et 82004248), le projet de plan scientifique et technologique de Shenzhen (JSGG20191129102216637 et ZDSYS201606081515458), le Bureau de la médecine traditionnelle chinoise de la province du Guangdong ( 20201320).

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