Les variantes associées aux maladies rénales de l'apolipoprotéine L1 montrent un gain de fonction dans l'activité des canaux cationiques

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Jonathan Bruno et John C. Edwards

Les variants de l'apolipoprotéine L1 (ApoL1) sont connus pour être responsables d'un risque accru de certainsun reinmaladiesparmi les personnes d'ascendance africaine. ApoL1 est une protéine amphitrope qui peut s'insérer dans des membranes phospholipidiques et conférer une perméabilité sélective d'anions ou de cations aux membranes phospholipidiques en fonction du pH. On ne sait pas si ces activités diffèrent parmi les variantes ou si elles contribuent à la pathogenèse de la maladie. Nous avons utilisé des dosages de flux d'ions pilotés par la tension à partir de vésicules phospholipidiques et d'association membranaire stable pour évaluer les différences entre les isoformes ApoL1. Il y a une augmentation significative (environ deux fois) de l'activité perméase ionique sélective des cations des deux variantes associées à la maladie rénale par rapport à la protéine de référence. En revanche, nous ne trouvons aucune différence dans l'activité perméase sélective des anions à faible pH parmi les isoformes. Par rapport à la séquence de référence, les deux variants associés à la maladie montrent une association stable accrue avec les vésicules phospholipidiques dans des conditions qui soutiennent l'activité cationperméase, suggérant que la une activité accrue peut être due à une association et une insertion membranaires plus efficaces. Ces données soutiennent un modèle dans lequel une perméabilité accrue aux cations peut contribuer aux maladies rénales progressives associées aux allèles ApoL1 à haut risque.

Deux variantes distinctes de la protéine ApoL1 sont connues pour être responsables du risque accru reconnu de maladie protéinurique progressive.un reinmaladiechez les personnes d'ascendance africaine, en particulier en raison de la glomérulosclérose segmentaire focale, de la néphrosclérose hypertensive et de la néphropathie associée au VIH (1–3). Les rôles fonctionnels de l'ApoL1 dans les cellules humaines, l'impact des variants associés à la maladie sur ces fonctions, et comment de telles altérations de l'inactivité peuvent accélérermaladie du reinne sont pas claires (4, 5).

La seule activité biochimique que la protéine ApoL1 est connue pour posséder est de fonctionner comme un canal ionique. Il a été noté que le domaine N-terminal d'ApoL1 avait une similitude structurelle avec la colicine bactérienne A1 (6). Comme la colicine A1, ApoL1 est une protéine amphitrope qui, dans certaines circonstances, peut pénétrer dans une membrane lipidique à partir d'une solution aqueuse, puis fonctionner comme une perméase ionique (6–9). L'ApoL1 recombinante de type sauvage purifiée est stable dans une solution détergente à pH neutre (8, 9). À un pH faible, l'ApoL1 peut pénétrer dans les membranes phospholipidiques et augmenter la perméabilité sélective des anions des membranes (6, 7, 9). Lorsque le pH cis est ramené à la neutralité, la perméabilité sélective des anions est supprimée et un canal sélectif des cations est activé (8, 9). Ces données soutiennent un modèle dans lequel l'ApoL1, présentée à un compartiment acide le long des voies exocytaires ou endocytaires, pourrait s'insérer dans la membrane limitante de l'organelle, ce qui entraînerait une augmentation de la perméabilité aux anions. Le trafic ultérieur de la protéine vers d'autres compartiments membranaires où le pH cis serait neutre (comme la membrane plasmique ou les membranes mitochondriales) supprimerait la perméabilité anionique et activerait la perméase cationique. Si ces activités de perméase ionique jouent un rôle dans la pathogenèse de l'ApoL1-associéerénalmaladiesn'est pas clair.

Nous avons utilisé des méthodes basées sur les vésicules pour analyser les différences d'activités de perméase inionique et de liaison membranaire entre la séquence de référence (type sauvage), désignée G0, et les deux variantes associées à la maladie, désignées G1 et G2. Nous constatons que par rapport à G0, les isoformes G1 et G2 montrent une activité spécifique accrue de l'activité perméase cationique à pH neutre sans altérer l'activité perméase sélective des anions à pH bas. En outre, les isoformes G1 et G2 associées à la maladie présentent une association membranaire stable accrue par rapport à G 0 dans des conditions qui soutiennent l'activité cationpermease mais pas dans des conditions qui soutiennent l'activité anion permease. Nous ne trouvons aucun effet sur le schéma de sensibilité au pH de l'étape de liaison ou de l'étape d'efflux de l'activité du canal cationique, et nous ne trouvons aucun effet sur la sensibilité au pH de l'activité perméase sélective des anions. Nous concluons que les variants d'ApoL1 associés à la maladie améliorent sélectivement l'activité du canal cationique de la protéine, probablement au moins partiellement en améliorant l'insertion membranaire. Nous proposons que cette activité de canal améliorée contribue à uneun reinmaladiechez les personnes porteuses de génotypes à haut risque.

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Résultats

Les isoformes recombinantes d'ApoL1 avec la séquence signal N-terminale retirée et remplacée par une étiquette d'épitope 6His/T7 ont été exprimées et purifiées. Tous les trois ont montré des propriétés chromatographiques identiques grâce à la purification et étaient impossibles à distinguer par électrophorèse sur gel Figure 1.

Les fractions de pic ont été diluées à 100 ug/ml et soumises à des dosages d'efflux de vésicules pour la capacité à conférer une perméabilité au chlorure et au potassium. Le test se compose de deux étapes distinctes. Au stade de l'association, ApoL1 est mélangé avec des vésicules phospholipidiques chargées de KCl et autorisé à s'insérer dans les membranes. Le KCl extravéhiculaire et le tampon sont ensuite éliminés par passage dans une colonne de dessalement équilibrée dans du saccharose isotonique, générant de grands gradients intérieur-extérieur des deux Kand ions Cl. Dans l'étape d'efflux, l'éluat de la colonne de centrifugation est dilué dans une solution de saccharose tamponnée isotonique qui maintient le gradient de KCl au pH souhaité. La concentration extravéhiculaire de Cl est surveillée avec une électrode sélective au chlorure. Même si une perméabilité sélective au K ou au Cl est présente, aucun ion ne pourra sortir des vésicules en raison du manque de mouvement des contre-ions. L'efflux d'ions piloté par la tension est initié par l'ajout d'une concentration saturante d'un ionophore de contre-ion. L'ajout de l'ionophore K-sélectif, la valinomycine (Val), induira un grand potentiel de membrane négatif à l'intérieur qui, si la perméabilité au Cl est présente, entraînera un efflux de KCl qui sera détecté par l'électrode sélective au chlorure ; ainsi après Val, le taux d'efflux de Cl reflète la perméabilité au Cl. À l'inverse, l'ajout de l'ionophore sélectif pour le Cl, Chloride Ionophore 1 (CI1), induira un potentiel de membrane positif à l'intérieur qui entraînera un efflux de KCl si une perméabilité au K est présente. Par conséquent, après l'ajout de CI1, le taux d'efflux de Cl reflète la perméabilité au K. Ce test peut donc servir de test de perméabilité au Cl ou au K, selon l'ionophore utilisé. Le taux initial d'efflux ionique suivant l'ajout d'ionophore est considéré comme la perméabilité ionique spécifique des vésicules. Notez que l'efflux de Cl avant l'ajout d'ionophore indique une certaine perméabilité à la fois à K et à Cl. Même dans cette circonstance, le taux d'efflux de Cl après addition d'un excès de l'ionophore de contre-ion représente la perméabilité à l'ion d'intérêt—Cl après addition de Val, et K après addition de CI1.

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Activité chlorure perméase

Nos études précédentes ont montré que la perméabilité anionique est la plus élevée lorsque l'étape d'association membranaire et l'étape d'efflux sont effectuées à pH 5. 0, et ces conditions ont été utilisées pour comparer l'activité de perméabilité Cl des trois isoformes, en utilisant Val pour initier Efflux dépendant de la perméabilité au Cl. Des exemples de données brutes sont illustrés à la figure 2A, qui montre la sortie de l'électrode sélective de Cl en millivolts tracée en fonction du temps. L'enregistrement commence avant l'ajout de l'éluat de la colonne de spin contenant des vésicules et des protéines, la valeur mV reflétant la concentration de 10 μM Cl. L'éluat de la colonne de spin sans Cl est ajouté à la première flèche, diluant le Cl, ce qui se reflète dans la déviation vers le haut du tracé mV. Val est ajouté à la deuxième flèche, déclenchant un efflux de Cl si la perméabilité au Cl est présente, ce qui se traduit par la chute progressive de mV. Triton X-100 est ajouté à la troisième flèche, libérant tout le chlorure intravésiculaire restant. Après conversion de mV en concentration de chlorure en utilisant une courbe standard générée pour l'électrode dans les conditions de l'essai, le taux initial fractionnel de libération de Cl après addition de Val est déterminé et pris comme perméabilité au chlorure. Comparé au contrôle sans protéine (tracé bleu), le taux élevé de libération de Cl après l'ajout de Val indique que l'ApoL1 confère une perméabilité substantielle au Cl qui semble comparable entre les trois isoformes (tracés rouge, vert et jaune). Le très faible débit d'efflux avant Val indique que la perméabilité au potassium est bien inférieure à la perméabilité au Cl. Une gamme de concentrations des isoformes ApoL1 a été testée pour l'activité de la perméase Cl (Fig. 2B). Comme indiqué précédemment pour G0, nous trouvons que l'activité Clpermease est linéairement liée à la masse de protéine dans le dosage pour les trois isoformes. L'activité de perméase à chaque concentration n'est pas différente parmi les trois isoformes. La courbe de concentration a été réalisée deux fois en utilisant deux ensembles différents de préparations de protéines, donnant le même résultat.

Six préparations indépendantes des trois protéines ont été dosées pour l'activité de la perméase Cl à pH 5. 0 comme résumé dans la Figure 2C. Dans aucun des ensembles de préparations, nous n'avons trouvé de différence significative dans l'activité de la perméase Cl entre les isoformes (p > 0.05 pour la comparaison de G0 avec G1 ou G2 dans chaque ensemble) . Les taux d'efflux moyens des six préparations (appelées ALL sur la Fig. 2C) étaient de 1,21 ± 0.32 % /s pour la séquence de référence G0, 1,36 ± 0.41 % /s pour G1, et 1,18 ± 0.34 pour G2 (moyenne ± SD, n=6 pour chacun ; p=0.47 et 0.94 pour la comparaison de G0 avec G1 et G2, respectivement). Pour déterminer si les mutations associées à la maladie modifient la sensibilité au pH de la perméase anionique, la perméabilité au Cl conférée par chaque isoforme a été dosée à travers une gamme de valeurs de pH, en utilisant le pH indiqué pour les étapes d'association et d'efflux du test (Fig. 2D). Nous n'avons trouvé aucun différences significatives entre les isoformes. Cette expérience a été réalisée deux fois en utilisant deux ensembles différents de préparations de protéines, donnant le même résultat. Ainsi, l'activité Clperméase n'est pas significativement différente entre les deux variants associés à la maladie et la séquence de référence.

Activité de perméase de potassium

Nos études précédentes ont indiqué que la perméabilité cationique est la plus élevée lorsque l'étape d'association membranaire est effectuée à pH 6. 0 et l'étape d'efflux est effectuée à pH 7,5, et nous avons utilisé ces conditions sauf indication contraire. Des exemples de données brutes d'un dosage de perméase K sont présentés à la figure 3. Comme pour les dosages de perméabilité au Cl, l'éluat de la colonne de centrifugation est ajouté à la première flèche, l'ionophore (dans ce cas, Chloride Ionophore1, CI1) est ajouté à la deuxième flèche, et le détergent est ajouté à la troisième flèche. Les taux initiaux d'efflux après l'ajout d'ionophore, représentant la perméabilité K, sont représentés par les lignes pointillées grises. Le tracé bleu provient du contrôle sans protéine, montrant la perméabilité de fond endogène des vésicules seules. Le tracé rouge montre l'activité du variant G0(type sauvage), démontrant clairement la présence d'une Kperméabilité supérieure aux vésicules témoins conférées par la protéine comme précédemment rapporté (9). Les traces jaune et verte montrent l'activité des variantes G1 et G2, respectivement. Les pentes initiales après l'ajout d'ionophore sont nettement plus grandes pour les G1 et G2 que pour G0, ce qui indique que les variants associés à la maladie supportent une plus grande activité de perméase K que G0.

Contrairement à l'essai de perméabilité au Cl, et comme indiqué précédemment pour l'isoforme G0 (9), dans les conditions d'essai de la perméase K, il y a un certain efflux avant l'ionophore dans les vésicules contenant l'une des trois isoformes, représentée par la pente descendante des enregistrements après ajout d'échantillon et avant ajout d'ionophore. Alors que le taux élevé d'efflux après l'ajout d'ionophore indique la présence d'une perméabilité substantielle au K, l'efflux avant l'ionophore indique également la présence d'une certaine perméabilité au Cl, permettant aux deux ions de s'échapper des vésicules en l'absence d'ionophore. Cette fuite explique probablement à la fois l'augmentation émoussée de la sortie de l'électrode immédiatement après l'ajout de l'éluat de la colonne de centrifugation et la pente descendante ultérieure avant CI1 qui est observée avec tous les enregistrements contenant ApoL1. En supposant que cette fuite commence lorsque l'échantillon passe à travers la colonne de centrifugation, cela expliquerait également les différences de concentration finale de Cl après l'ajout de détergent, car toute perte de KCl sur la colonne de centrifugation signifierait moins de KCl total ajouté au dosage. L'interprétation quantitative du taux d'ionophore n'est pas simple, sinon qu'elle doit être fonction des perméabilités à la fois à K et à Cl. Comme précédemment (9), nous attribuons cette activité à l'activité résiduelle de perméase Cl que nous observons à pH 7,5 comme sur la figure 2D (voir également Bruno et al. (9), figure 4D).

Des dosages de permease de potassium ont été effectués sur une plage de concentrations de protéines (Fig. 4A). L'activité était linéairement liée à la masse de protéine dans le test pour chaque isoforme, mais les deux isoformes associées à la maladie ont montré une activité d'efflux substantiellement accrue par rapport à G0. Cette courbe de concentration a été reproduite avec trois ensembles séparés de préparation de protéines donnant des résultats très similaires.

Six préparations indépendantes des trois isoformes ont été dosées pour l'activité d'efflux de K en utilisant 2 ug de protéine dans chaque dosage. Dans chacun des six ensembles, l'activité des isoformes G1 et G2 était significativement supérieure à celle de G0 (Fig. 4B). La moyenne des six ensembles de données a donné des taux d'efflux de 0.349 ± 0.063 % /s pour G{{10}}, {{15} }.709 ± 0.176 %/s pour G1, et 0.673 ± 0.142 %/s pour G2 (moyenne ± SD, n=6 pour chacun ; p < 0,00001="" pour="" la="" comparaison="" de="" g0="" avec="" g1="" ou="" g2).="" les="" activités="" spécifiques="" de="" la="" perméase="" k="" de="" g1="" et="" g2="" sont="" respectivement="" 2,03-="" et="" 1,93-="" fois="" supérieures="" à="" celles="" de="" g0="" par="" ce="">

La dépendance de l'activité perméase K sur le pH de l'étape d'association membranaire et de l'étape d'efflux ionique a été analysée séparément. Bien que nous ayons confirmé que l'activité d'efflux totale de G1 et G2 est supérieure à celle de G0 dans des conditions "standard" (liaison à pH 6, efflux à pH 7,5), nous n'avons trouvé aucune différence significative dans la forme de la courbe d'activité par rapport au pH externe (cis) de l'étape d'association membranaire (Fig. 4C) ou de l'étape d'efflux d'ions (Fig. 4D). Nous n'avons également trouvé aucune différence entre les isoformes dans la dépendance de l'activité au pH intravésiculaire élevé (trans) ou la nécessité de la présence de cation divalent (Fig. 4E), et notons en outre que le calcium ou le magnésium est tout aussi efficace pour fournir le cation divalent nécessaire pour une pleine activité. Chacune de ces expériences a été réalisée deux fois en utilisant différents ensembles de protéines purifiées, donnant des résultats identiques.

Association membranaire stable

Nous avons précédemment démontré que l'ApoL1 recombinante purifiée se lie spontanément aux membranes phospholipidiques montrant une dépendance similaire au pH et à la composition des phospholipides comme celle des activités ion perméase (9). À l'aide de méthodes similaires, nous avons comparé les propriétés de liaison aux vésicules lipidiques de la version de référence d'ApoL1 avec les variantes associées à la maladie rénale dans des conditions favorisant des activités optimales de perméase Cl ou K (Fig. 5). Pour les conditions Clpermease, la protéine a été incubée avec des vésicules lipidiques à pH 5. 0 avant l'extraction chaotropique pour éliminer les protéines qui n'étaient pas associées de manière stable aux vésicules. La protéine liée à la membrane a été isolée par flottation à travers un sucrosecushion et évaluée par western blot quantitatif. Les résultats sont présentés sur la figure 5A. Il n'y avait pas de différence significative dans la quantité de protéines liées aux vésicules entre G{{10}} et les isoformes G1 ou G2. Sur les 500 ng de protéine dans chaque réaction, la quantité liée aux vésicules était de 223 ± 33 ng pour G0, 239 ± 38 ng pour G1 et 191 ± 28 ng pour G2 (moyenne ± SD ; n=8 pour chaque groupe, p=0.35 et 0.076 pour la comparaison de G0 avec G1 et G2, respectivement). Environ 40 à 50 % de la protéine du test est liée aux membranes dans ces conditions. Cette expérience a été réalisée deux fois et a donné des résultats très similaires.

Pour évaluer la liaison dans des conditions optimales pour l'activité Kpermease, la protéine a été incubée avec des vésicules à pH6.0, puis déplacée à pH 7,5 avant l'extraction chaotropique pour éliminer la protéine insérée de manière non stable. La protéine liée à la membrane a été isolée par flottation des vésicules membranaires à travers un coussin de saccharose et évaluée par Western blot quantitatif. Les résultats sont présentés à la figure 5B. Les variants associés à la maladie montrent une liaison significativement plus efficace par rapport au G0. Sur les 500 ng de protéines ajoutées à chaque réaction, la quantité liée aux vésicules était de 43,5 ± 14,5 ng (n=8) pour G{{30}} ,73.0 ± 17,7 ng (n=7) pour G1 et 69,3 ± 10,3 ng (n=8) pour G2 (moyenne ± SD ; p=0.00076 et 0,0018 pour la comparaison de G0 avec G1 et G2, respectivement). Environ 9 pour cent de la protéine G0 dans la réaction étaient associés de manière stable aux vésicules par rapport à environ 14 pour cent de G1 et G2 dans ces conditions. Cette expérience a été réalisée deux fois en utilisant des préparations indépendantes donnant des résultats similaires.

Discussion

Nous présentons ici les résultats d'études des activités perméases ioniques d'ApoL1 et de sesun rein-maladie-variantes associées qui ont donné plusieurs résultats significatifs. Premièrement, nous constatons que les variants d'ApoL1 associés à la maladie ont considérablement augmenté l'activité de la Kpermease, qui est environ le double de celle de l'isoforme G0 dans nos tests. Deuxièmement, contrairement à la Kpermease, il n'y a pas de différences significatives dans l'activité spécifique de l'activité Cl permease à pH 5. 0 parmi les isoformes. Troisièmement, il n'y a pas de différences dans la sensibilité au pH des activités de permease K ou Cl, ou l'exigence d'un pH trans élevé et la nécessité d'un cation divalent pour l'activité Kpermease parmi les isoformes. Quatrièmement, dans des conditions optimales soutenant la perméase K, les variants associés à la maladie montrent une association membranaire stable améliorée par rapport à G0, mais aucune différence dans l'association membranaire dans des conditions optimales pour l'activité perméase Cl.

Nos résultats démontrant une augmentation de la perméase K sans effet sur la perméase Cl sont très robustes. En utilisant des conditions optimales pour chaque activité de perméase, nous avons trouvé des résultats essentiellement identiques parmi six ensembles indépendants de préparations, l'activité Kperméase des variants associés à la maladie étant significativement supérieure à G0 dans chacun. Chaque ensemble a été préparé et dosé en même temps en utilisant des réactifs communs. La validité des concentrations de protéines déterminées par le test BCA a été confirmée par l'intensité comparable de la coloration de Coomassie sur SDS-PAGE. Ces données incluent toutes les tentatives réussies de purification simultanée - nous n'avons jamais réussi à générer un ensemble des trois variantes dans lesquelles ces activités relatives n'ont pas été observées.

De même, l'absence de différences dans l'activité spécifique de l'anion-perméase à pH 5 était cohérente parmi tous les ensembles de préparations. Ainsi, notre principale conclusion est que les variants d'ApoL1 associés à la maladie confèrent un gain sélectif de fonction dans l'activité de la perméase K sans affecter l'activité de la perméase Cl, telle qu'elle est testée dans des conditions optimales pour chacune de ces activités. La présence de différences substantielles dans l'activité des canaux cationiques des variants d'ApoL1 qui sont en corrélation avec la capacité à conduire la maladie a des implications pour les mécanismes pathogènes possibles. La nature sélective de l'augmentation de la perméabilité aux ions indique qu'une activité accrue de la perméase cationique des variants associés à la maladie pourrait contribuer à la maladie, mais que l'activité de la perméase anionique à faible pH, qui n'est pas différente entre les isoformes, ne jouera probablement pas un rôle critique.

Les recherches des effets des variants sur les sensibilités au pH des activités et sur l'étendue de la liaison membranaire stable par la protéine ont mis en lumière le mécanisme par lequel l'activité de la perméase K peut être augmentée. Tout d'abord, à part la confirmation de l'activité accrue de la perméase K dans des conditions optimales, nous n'avons trouvé aucune différence dans les formes des courbes montrant les effets du pH sur l'association membranaire et les étapes d'efflux de l'activité de la perméase K ou de l'effet du pH sur l'activité globale de la perméase Cl. En outre, il n'y avait aucune différence dans l'exigence d'un pH élevé de l'intérieur des vésicules ou dans l'exigence de la présence de cation divalent dans la réaction pour l'activité de la perméase K parmi toutes les isoformes. Ainsi, nous n'avons trouvé aucune preuve d'une différence dans les propriétés intrinsèques du canal lui-même. En revanche, les variants ont montré une association stable significativement accrue avec les vésicules phospholipidiques dans des conditions qui soutiennent l'activité de la Kperméase, l'échelle de cet effet étant à peu près la même gamme que le changement d'inactivité. Prises ensemble, les données suggèrent que la base de l'activité accrue de la perméase K est simplement une insertion membranaire plus efficace dans les conditions soutenant l'activité, sans qu'il soit nécessaire d'invoquer un changement fondamental dans les propriétés de la protéine insérée.

Trois domaines ont été identifiés dans la structure ApoL1(6). On pense que l'activité du canal ionique se situe dans le domaine "formateur de pores" homologue de la colicine, qui occupe environ 60% de la protéine à son extrémité N-terminale. Les variations de séquence associées à la maladie ne se trouvent pas dans le domaine de formation de pores mais se trouvent à une distance de celui-ci dans un domaine enroulé, qui comprend environ 16 % de la protéine à l'extrémité C-terminale. La délétion de ce domaine n'a aucun effet sur l'activité trypanolytique mais est hautement conservée parmi les isoformes d'Apol à la fois au sein et entre les espèces (10). Il a été suggéré que cette région fonctionne comme un domaine contrôlé (10), et nos données indiquent que les mutants pathogènes dans ce domaine ont effectivement une liaison membranaire accrue dans des conditions qui soutiennent l'activité des canaux cationiques et une activité accrue des canaux cationiques. Une interprétation est que le domaine C-terminal sert à supprimer l'association/insertion membranaire nécessaire à l'activité de perméase cationique, et la mutation de ce domaine relâche cette suppression.

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Les observations sur la liaison membranaire ont d'autres implications et éclairent certains aspects de la relation entre les activités de perméase anionique et cationique. Nous constatons ici que beaucoup plus de protéines sont liées aux membranes dans des conditions optimales d'activité de perméase anionique (pH 5.0) que dans des conditions de liaison optimales soutenant l'activité de perméase cationique (pH 6.0), et cela est vrai pour tous isoformes (Fig. 5). Notez la différence dans les sensibilités au pH de l'activité de la perméase anionique (Fig. 2D) et de l'étape de liaison à la membrane de l'activité de la perméase cationique (Fig. 4C) : la perméase anionique augmente considérablement en dessous de pH 6, tandis que la capacité de la protéine insérée dans la membrane pour soutenir le cation l'activité de la perméase chute de manière significative. Nos données précédemment rapportées ont montré que l'association membranaire stable de G 0 augmente considérablement lorsque le pH chute dans cette même plage de pH, et c'est la plage dans laquelle la fluorescence des protéines intrinsèques est supprimée de la manière la plus spectaculaire (9), indiquant une transition significative dans la structure de la protéine. . Dans l'ensemble, les données suggèrent que l'insertion de la membrane à pH 6.0 est fondamentalement différente de l'insertion de la membrane à pH 5.0. À pH 6.0, une plus petite fraction de la protéine s'associe aux membranes, accompagnée d'un changement mineur de la fluorescence intrinsèque et d'une activité de perméase anionique limitée, mais avec la capacité de passer à une forme perméable aux cations lorsque le compartiment cis est titré à pH 7 .5. En outre, l'efficacité de cette liaison est supérieure pour les variants associés à la maladie, parallèlement à l'activité accrue de la cationpermease après un changement de pH. En revanche, à pH 5.0 une fraction beaucoup plus importante de la protéine est associée aux membranes ; cette liaison s'accompagne d'un changement important de la fluorescence intrinsèque et de l'apparition d'une activité anionperméase beaucoup plus importante. Ni la liaison membranaire ni l'activité anionperméase ne sont différentes entre les isoformes. La capacité de cette protéine insérée à passer à la confirmation de la perméase cationique est fortement diminuée. Nous émettons l'hypothèse que le changement de fluorescence intrinsèque signalé précédemment lorsque le pH chute de 6 à 5 reflète une transformation structurelle en une forme incapable de passer à la conformation de perméase cationique, et les différences entre les isoformes n'ont aucun effet sur les propriétés de perméase ionique de cette conformation.

Une nouvelle observation supplémentaire est que les ions calcium et magnésium sont également efficaces pour soutenir l'activité du canal cationique d'ApoL1. Cela suggère fortement que le rôle du cation divalent n'est pas lié à une liaison de haute affinité par la protéine, mais plus probablement à un effet de pontage de charge moins spécifique permettant à la protéine chargée négativement d'interagir avec la surface chargée négativement des membranes phospholipidiques.

D'autres enquêtes évaluant les différences d'activité des canaux ioniques des isoformes ApoL1 ont été publiées. Thompson et Finkelstein (8) ont utilisé des méthodes électrophysiologiques avec des techniques de bicouche lipidique planaire pour évaluer l'activité du canal de l'ApoL1 recombinante purifiée, ne signalant aucune différence dans les caractéristiques du canal parmi les isoformes. Il est important de noter que les méthodes de bicouche lipidique planaire et les tests d'efflux à base de vésicules, tout en étant tous deux des tests de canaux, produisent différents types d'informations et peuvent être considérés comme des systèmes expérimentaux complémentaires. Les méthodes de bicouche lipidique sont une approche sans précédent pour définir les propriétés à canal unique de la protéine purifiée, mais sont des outils moins puissants pour quantifier une activité spécifique, tandis que les tests d'efflux de vésicules peuvent fournir des données quantitatives sur l'activité d'une population, mais peu d'informations sur les propriétés à canal unique. Ainsi, les observations de Thompson et Finkelstein ne sont pas incompatibles avec les nôtres, qui ne montrent pas non plus de différences apparentes dans les propriétés intrinsèques du canal, mais seulement une différence d'activité spécifique d'environ le double, une échelle de différence qu'il serait assez difficile d'évaluer. détecter dans les systèmes bicouches lipidiques.

Les recherches utilisant des protéines et des lipides purifiés ont la vertu de révéler des propriétés qui sont clairement dues à la protéine elle-même et non altérées par d'autres composants, la cinétique d'expression ou le trafic membranaire qui compromettent des systèmes plus complexes. Cependant, ils sont nécessairement silencieux sur l'effet ultime que ces activités ont sur les cellules vivantes. Des études utilisant des systèmes d'expression à base de cellules pour démêler les activités des canaux ioniques d'ApoL1 ont été rapportées (examinées dans Friedman et Pollak, 2019 (3)). Olabisi et al.(11) ont exprimé les isoformes ApoL1 dans les cellules HEK et évalué la concentration de potassium intracellulaire à l'état d'équilibre. Ils ont trouvé un potassium intracellulaire inférieur dans les cellules exprimant G1 et G2 par rapport aux cellules exprimant G0. Bien que cette observation puisse être cohérente avec une augmentation de la perméabilité au K de la membrane plasmique, le K intracellulaire inférieur pourrait également être une conséquence non spécifique de l'effet cytotoxique plus important du variant par n'importe quel mécanisme, entraînant une activité NaK ATPase moins active et / ou une dégradation de l'intégrité de la membrane plasmique. O'Toole et al. (12) ont soigneusement calibré les niveaux d'expression dans les cellules HEK et évalué l'apparence de l'activité des canaux cationiques de la membrane plasmique, ne trouvant aucune différence entre les isoformes. Shah et al. (13) ont signalé le ciblage de l'ApoL1 sur les mitochondries où les variantes associées à la maladie induisaient l'ouverture du pore de transition de la perméabilité mitochondriale, ce qui est cohérent avec les preuves récentes de la cytotoxicité des trypanosomes. Que cet effet nécessite une activité de canal ionique d'ApoL1 n'est pas clair. Avec chacune de ces études, en raison de la complexité des systèmes d'expression à base de cellules, il ne peut être certain que les différences notées soient dues aux propriétés intrinsèques de la protéine ou à d'autres composants en interaction présents dans les cellules.

Les mutations pathogènes de gain de fonction présentent généralement un modèle d'hérédité dominant, tandis que lesphénotype de la maladie rénaleassocié aux variants ApoL1 est récessif. Un mécanisme par lequel une mutation de gain de fonction peut être récessive est si la protéine fonctionne comme un homomultimère, et le WT peut exercer un effet négatif dominant sur la variante activée. On ignore actuellement si ApoL1 fonctionne comme un canal en tant que monomère ou multimère.

Nos données suggèrent qu'une perméabilité accrue aux cations à des niveaux similaires d'expression de protéines pourrait contribuer à la cytotoxicité dans les podocytes ou d'autres cellules. Cependant, il peut sembler peu probable qu'une simple double augmentation de l'activité puisse convertir une molécule apparemment bénigne en une seule maladie motrice. Néanmoins, les maladies associées aux variantes de l'ApoL1 ont tendance à évoluer lentement, et des différences subtiles sur une période prolongée (des mois à des années) pourraient éventuellement avoir un effet cumulatif important. D'autres mécanismes potentiels d'ApoL1action responsables deun reinblessureont été proposées et sont étayées par des preuves (3-5, 11-16), y compris les effets sur l'apoptose, l'autophagie, la fonction mitochondriale, le trafic intracellulaire de la membrane et les effets médiateurs des molécules de signalisation extracellulaires, entre autres. L'importance relative des différences dans l'activité du canal ApoL1 décrites ici par rapport à d'autres mécanismes d'action potentiels dans la conduite de la maladie reste à déterminer.

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Procédures expérimentales

Constructions d'expression

pET-ApoWT codant pour le N-terminal 6His et l'ApoL1 marqué par l'épitope T7 (version G0) ont été décrits précédemment (9). La protéine codée est identique à celle de Genbank accession # BC143038 (haplotype 150K, 228I, 255K) des acides aminés 28 à 398, éliminant la séquence signal dans les acides aminés 1–27 et avec l'ajout de N-terminal {{ 17}}Étiquettes d'épitopes His et T7 codées par le plasmide pET28a. Les plasmides codant pour les variants G1 et G2 ont été générés à partir de pET-ApoWT par substitution du fragment de restriction AleI à XhoI par des fragments contenant les séquences variantes, synthétisés par Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, et l'identité des plasmides résultants a été confirmée par séquençage direct. Les trois constructions étaient identiques à l'exception des substitutions d'acides aminés S342G et I384M dans l'isoforme G1 et de la délétion N388-Y389 dans l'isoforme G2. Les isoformes ApoL1 recombinantes ont été exprimées dans des bactéries et purifiées comme décrit (8), sauf que le tampon de la colonne S200 contenait 0,03 % de n dodécyl- -D-maltoside (DDM) (Millipore-Sigma). Pour toutes les séries d'expériences comparant les isoformes, les matériaux ont été préparés en même temps dans des conditions identiques en utilisant les mêmes réactifs. La concentration en protéines a été déterminée avec le kit d'analyse de protéines BCA (Thermo Fisher Scientific) en utilisant l'étalon d'albumine de sérum bovin. Pour les protéines totales comme sur la figure 1, les gels ont été colorés avec Instant Blue (Expedeon Inc). La protéine dans le tampon S200 a été congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à -80 C. Les aliquotes ont été décongelées sur de la glace et diluées dans du tampon S200 avant les dosages.

Ionophores

La valinomycine (Millipore Sigma) a été dissoute à 50 mM dans de l'éthanol absolu et diluée à 1 mM dans de l'éthanol absolu immédiatement avant utilisation. Le chlorure d'ionophore 1 (MilliporeSigma) a été dissous à 100 mM dans du 1-hexanol et dilué à 0,2 mM dans de l'éthanol absolu immédiatement avant utilisation.

Vésicules membranaires

L'asolectine (phosphatidylcholine de soja de type II, Sigma) a été extraite à l'acétone comme décrit (30), séchée, puis dissoute dans du chloroforme et stockée à -20 C. Une aliquote de phospholipides dans du chloroforme a été séchée sous un courant d'azote et mise en suspension. à 20 mg/ml dans du KCl 200 mM, HEPES 5 mM pH 8,0 par cinq cycles de congélation-décongélation et un vortex vigoureux. Cette suspension a été stockée à -20 degrés. Pour générer des vésicules unilamellaires chargées de KCl d'environ 200 nm de diamètre, la suspension lipidique a été passée 15 fois à travers un filtre à membrane en polycarbonate à pores de 200 nm en utilisant une chambre d'extrudeuse (Avanti Polar Lipids) et le protocole fourni par le fabricant (17, 18). Les vésicules extrudées ont été conservées sur de la glace et utilisées dans les 24 h.

Dosages d'activité

Des dosages d'activité ion perméase utilisant un efflux de KCl entraîné par le potentiel membranaire détecté avec une électrode sélective au chlorure ont été effectués comme décrit précédemment (9). Vingt microlitres d'ApoL1 dans du tampon S200 (15{{20}} mM de NaCl, 10 mM de Tris pH8,3, 0,3 % de DDM) sont ajoutés à 380 ul de mélange réactionnel composé de KCl 82 mM, de saccharose 127 mM, de tampon 42,1 mM au pH indiqué (MES pour pH 5–6,5, HEPES pour pH 7,0–8,0), 2,63 mMCa(gluconate)2 et 1,84 mg/ml d'isolectine extrudée vésicules. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 4 min avant passage dans une colonne de 3 ml Bio-Gel P-6DG (Bio-Rad) équilibrée dans 330 mM de saccharose. L'éluat est immédiatement ajouté à 2 ml de saccharose 330 mM, 10-5 M KCl, Ca(gluconate)2 2,5 mM et tampon 10 mM (MES pour pH 5–6,5 ; HEPES pour pH 7–8) comme indiqué, avec surveillance continue avec une électrode sélective de chlorure et enregistrée comme décrit.Après 20 s, l'efflux commandé par la tension a été initié par l'ajout d'un ionophore (2,5 ul de valinomycine 1 mM ou 0,2 mMChloride Ionophore 1 dans l'éthanol) et a permis de procéder pendant 30 s suivi de l'ajout de Triton X-100 à 0,1 % pour libérer le chlorure intravésiculaire restant. Les données brutes en mV ont été converties en concentration de Cl en utilisant une courbe standard générée pour l'électrode dans les conditions de l'essai. Les taux fractionnaires initiaux de libération de chlorure ont été dérivés de 3 s pendant la réponse immédiate maximale à l'ajout d'ionophore.

Toutes les comparaisons d'activité ont été effectuées en utilisant du matériel provenant de préparations simultanées des trois isoformes qui avaient été diluées à 100 ug/ml de protéine dans du tampon S200 avant le test. Tous les tests utilisés pour la comparaison directe entre les variants ont été effectués le même jour en utilisant les mêmes réactifs fraîchement préparés.

Essai d'association membranaire

Des essais d'association membranaire ont été réalisés séparément dans des conditions optimales pour l'activité perméase Cl et pour l'activité perméase K. Pour les conditions favorisant l'activité Clpermease, 5 ul de 100 ug/ml de protéine dans 1{{30}} mM de Tris pH8,2, 150 mM de NaCl , 0.03 % de DDM a été ajouté à 95 ul de mélange réactionnel (3,4 mg/ml de vésicules d'isolectine (chargées avec 200 mM de KCl, 5 mM d'HEPES pH 8), 20 mM de MES pH 5,0, 2,5 mM de Ca(gluconate) 2, KCl 100 mM, saccharose 100 mM) et incubé à température ambiante pendant 1 min. Le rapport protéine/lipide dans le test est de 1:680 masse/masse. L'échantillon a été dilué sans changement de pH par addition de 200 ul de MES 60 mM pH 5,0, 2,5 mMCa(gluconate)2, KCl 100 mM, saccharose 100 mM et incubé pendant 20 s. Cent microlitres d'urée 8 M ont été ajoutés, mélangés, puis incubés à température ambiante pendant 15 min. La concentration de saccharose a été portée à 40 % par addition de 1,6 ml de 50 % de saccharose. L'échantillon de 2 ml a été étalé en dessous de 1 ml de 30 pour cent de saccharose dans du MES 8 mM pH 5,0, qui était à son tour en dessous de 1,7 ml de MES 8 mM sans saccharose pH 5,0. Les gradients abrupts ont été centrifugés à 200,000g dans un rotor Beckman Coulter TLA-110 pendant 90 min à 4 C. Les vésicules ont été recueillies à partir de l'interface de 0 à 30 % de saccharose. Des fractions égales d'échantillons ont été diluées 4 fois et centrifugées à 100,000g pendant 1 h. Les pastilles de membrane ont été séchées, séparées par SDS-PAGE, transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène et sondées par Western blot avec un anticorps dirigé contre l'épitope T7 (produit MilliporeSigma n° 69522-3) avec détection par chimioluminescence à l'aide d'un système d'imagerie numérique. Des dilutions en série de protéines purifiées ont été incluses sur le gel pour générer une courbe standard spécifique à l'isotype et au transfert pour chaque protéine.

Pour les conditions supportant l'activité de la perméase K, 5 ul de 100 ug/ml de protéine dans 10 mM de Tris pH 8,2, 150 mM de NaCl, 0,03 % de DDM ont été ajoutés à 95 ul de mélange réactionnel (vésicules isolées de 3,4 ug/ml (chargées de KCl 200 mM, HEPES 5 mM pH 8), MES 20 mM pH 6,0, Ca(gluconate)2 2,5 mM, KCl 100 mM, saccharose 100 mM) et incubées à température ambiante pendant 1 min. L'échantillon a été dilué avec un changement de pH à 7,5 par addition de 200 ul d'HEPES 60 mM pH 8,0, Ca(gluconate) 2,5 mM, KCl 100 mM, saccharose 100 mM et incubé pendant 20 s. Cent microlitres de 500 mM de Na2CO3 ont été ajoutés et incubés à température ambiante pendant 15 min. La concentration en saccharose a été portée à 40 % par addition de 1,6 ml de saccharose à 50 %. L'échantillon de 2 ml a été étalé en dessous de 1 ml de 30 pour cent de saccharose dans du Tris 8 mM pH 8,3, qui était à son tour en dessous de 1,7 ml de Tris 8 mM sans saccharose pH 8,3. Des coussins de saccharose ont été centrifugés et un échantillon a été recueilli et traité comme ci-dessus.

Statistiques

La signification des différences entre les paires de moyennes dans les ensembles de données a été déterminée à l'aide d'une analyse de la variance (ANOVA)(19). Les paramètres statistiques ont été déterminés à l'aide d'une fonction intégrée dans Excel. Les valeurs P ont été calculées à l'aide de socscistatistics.com. Tous les points de données sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (SD), déterminé avec la fonction STDEV.S d'Excel pour chaque groupe individuel de répliques.

Disponibilité des donnéesToutes les données à l'appui de cet article seront partagées sur demande au Dr John C. Edwards, john.edwards@health.slu.edu.

Cistanche peut traiterun reinmaladie

Remerciements—Nous remercions la Division de Néphrologie et le Département de Médecine Interne de l'Université Saint Louis pour le soutien indispensable à la réalisation de ce travail.

Les contributions de l'auteur—JCE a conçu et supervisé l'étude, obtenu un financement, effectué les tests d'efflux, interprété les données et rédigé l'article ; JB a purifié les protéines, effectué les tests d'association membranaire, interprété les données, préparé les figures et édité l'article.

Financement et informations complémentaires—Le travail a été financé par les ressources institutionnelles de l'Université Saint Louis et par la subvention R01 DK120651 des National Institutes of Health à JCE. Le contenu de cet article relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Conflit d'intérêt—Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêt avec le contenu de cet article.

Abréviations—Les abréviations utilisées sont : ApoL1, apolipoprotéineL1 ; CI1, chlorure ionophore 1; DDM, n-dodécyl- -D-maltoside ;PVDF, fluorure de polyvinylidène ; ET, écart type ; Val,valinomycine.

De: 'Un rein-maladie-les variantes associées de l'apolipoprotéine L1 montrent un gain de fonction dans l'activité des canaux cationiques' parJonathan Bruno et John C. Edwards

---J Biol. Chim. (2021) 296 100238

Références

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks, PJ, Nelson, GW, Vanhollebeke, B., Winkler, CA, et al. (2010) Association des variants trypanolytiques ApoL1 avecun reinmaladiechez les Afro-Américains. Sciences 329, 841–845
2. Parsa, A., Kao, WH, Xie, D., Astor, BC, Li, M., Hsu, CY, Feldman, HI, Parekh, RS, Kusek, JW, Greene, TH, Fink, JC, Anderson , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) Variantes de risque APOL1, race et progression de la maladie chroniqueun reinmaladie. N. Engl. J. Med. 369, 2183–2196
3. Friedman, DJ, et Pollak, MR (2020) APOL1 etun reinmaladie: De la génétique à la biologie. Annu. Rév. Physiol. 82, 323–342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF et Sedor, JR (2017) Identification de la fonction intracellulaire d'APOL1. Confiture. Soc. Néphrol. 28, 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H. et Okamoto, K. (2018) Néphropathies à apolipoprotéine L1 : 2017 en revue. Courant. Avis. Néphrol. Hypertens. 27, 153–158
6. Perez-Morga, D., Vanhollebeke, B., Paturiaux-Hanocq, F., Nolan, DP, Lins, L., Homble, F., Vanhamme, L., Tebabi, P., Pays, A., Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R. et Pays, E. (2005) L'apolipoprotéine LI favorise la lyse des trypanosomes en formant des pores dans les membranes lysosomales. Sciences 309, 469–472
7. Harrington, JM, Howell, S. et Hajduk, SL (2009) Perméabilisation de la membrane par le facteur lytique du trypanosome, une lipoprotéine humaine de haute densité cytolytique. J. Biol. Chim. 284, 13505–13512
8. Thomson, R., et Finkelstein, A. (2015) Le facteur trypanolytique humain APOL1 forme des canaux sélectifs pour les cations dépendant du pH dans les bicouches lipidiques planes : Pertinence pour la lyse des trypanosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J. et Edwards, JC (2017) L'apolipoprotéine L1 confère une perméabilité aux ions à pH commutable aux vésicules phospholipidiques. J. Biol. Chim. 292, 18344–18353
10. Vanhollebeke, B. et Pays, E. (2006) La fonction des apolipoprotéines L. Cell Mol. Vie Sci. 63 ans, 1937-1944
11. Olabisi, OA, Zhang, JY, Verplank, L., Zahler, N., DiBartolo, S., 3rd, Heneghan, JF, Schlondorff, JS, Suh, JH, Yan, P., Alper, SL, Friedman, DJ et Pollak, M. (2016) APOL1un reinmaladieles variants de risque provoquent une cytotoxicité en appauvrissant le potassium cellulaire et en induisant
protéines kinases activées par le stress. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 113, 830–837
12. O'Toole, JF, Schilling, W., Kunze, D., Madhavan, SM, Konieczkowski, M., Gu, Y., Luo, L., Wu, Z., Bruggeman, LA et Sedor, JR (2018) La surexpression d'ApoL1 entraîne une cytotoxicité indépendante de la variante. Confiture. Soc. Néphrol. 29, 869–879
13. Shah, SS, Lannon, H., Dias, L., Zhang, JY, Alper, SL, Pollak, MR et Friedman, DJ (2019) APOL1un reinles variants de risque induisent la mort cellulaire via la translocation mitochondriale et l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale. Confiture. Soc. Néphrol. 30, 2355–2368
14. Hayek, SS, Koh, KH, Grams, ME, Wei, C., Ko, YA, Li, J., Samelko, B., Lee, H., Dande, RR, Lee, HW, Hahm, E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) Un complexe tripartite de suPAR, de variants de risque APOL1 et d'intégrine alphavbeta3 sur les podocytes médie chroniqueun rein maladie. Nat. Méd. 23, 945–953
15. Ma, L., Chou, JW, Snipes, JA, Bharadwaj, MS, Craddock, AL, Cheng, D., Weckerle, A., Petrovic, S., Hicks, PJ, Hemal, AK, Hawkins, GA, Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) Les variants APOL1 à risque rénal induisent un dysfonctionnement mitochondrial. Confiture. Soc. Néphrol. 28, 1093–1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z. et Hu, CA (2008) Apolipoprotéine L1, un nouveau domaine d'homologie Bcl-2 {{4 }} seule protéine de liaison aux lipides, induit la mort cellulaire autophagique. J. Biol. Chim. 283, 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G. et Cullis, PR (1985) Production de grandes vésicules unilamellaires par une procédure d'extrusion rapide : Caractérisation de la distribution de taille, du volume piégé et de la capacité à maintenir un potentiel de membrane. Biochim. Biophys. Acta 812, 55–65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ et Papahadjopoulos, D. (1979) Préparation de liposomes de distribution de taille définie par extrusion à travers des membranes en polycarbonate. Biochim. Biophys. Acta 557, 9–23
19. Armitage, P. (1971) Statistical Methods in Medical Research, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Royaume-Uni