L'inhibition de Kv1.3 atténue la neuroinflammation par la perturbation de la signalisation du calcium microglial

ABSTRAIT

Au cours des 5 dernières années, il a été démontré que les inhibiteurs du canal potassique KV1.3 réduisent la neuroinflammation dans des modèles de rongeurs d'AVC ischémique, de maladie d'Alzheimer, de maladie de Parkinson et de lésion cérébrale traumatique. Au niveau systémique, ces actions bénéfiques sont médiées par une réduction de l'activation de la microglie et une suppression de la production de cytokines pro-inflammatoires et d'oxyde nitrique.

Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action suppressive des bloqueurs de KV1.3 sur les fonctions de la microglie pro-inflammatoire n'étaient pas connus jusqu'à ce que notre groupe ait récemment démontré que les canaux KV1.3 ne régulent pas seulement le potentiel membranaire, comme on pourrait s'y attendre d'un canal potassique voltage-dépendant. , mais jouent également un rôle crucial en permettant à la microglie de résister aux dépolarisations produites par le signal de danger ATP, régulant ainsi l'influx de calcium via les récepteurs P2X4. Nous passons ici en revue le rôle de KV1.3 dans la signalisation microgliale et montrons que, de la même manière que leur rôle dans les cellules T, les canaux KV1.3 régulent également l'influx de calcium stocké dans la microglie.

Le canal potassique KV1.3 est un canal ionique largement exprimé dans les cellules immunitaires, qui joue un rôle important dans la régulation du potentiel de la membrane cellulaire, de la migration cellulaire et de la fonction des cellules immunitaires. Des recherches récentes suggèrent que les composés qui inhibent le canal potassique KV1.3 peuvent aider à renforcer l'immunité du corps.

La régulation du système immunitaire est un élément important du maintien d'une bonne santé. Cependant, de nombreuses maladies, telles que les maladies auto-immunes, le cancer et les maladies infectieuses, entraînent un système immunitaire dysfonctionnel. Par conséquent, les chercheurs ont cherché des moyens de renforcer l'immunité. Des études récentes suggèrent que les inhibiteurs du canal potassique KV1.3 pourraient être une option prometteuse.

Dans les cellules immunitaires, le canal potassique KV1.3 régule le potentiel membranaire, affectant ainsi la fonction cellulaire. L'étude a révélé qu'en inhibant le canal potassique KV1.3, il était possible de réduire la migration des lymphocytes T et de les empêcher davantage d'attaquer les cellules saines, protégeant ainsi le système immunitaire d'une destruction inutile.

De plus, certaines expériences ont montré que l'inhibition du canal potassique KV1.3 peut également favoriser d'autres aspects du système immunitaire. Par exemple, des études ont montré qu'en inhibant ce canal, la qualité et la quantité des cellules immunitaires peuvent être améliorées, augmentant ainsi la résistance de l'organisme aux agents pathogènes et autres menaces externes. Par conséquent, l'inhibition du canal potassique KV1.3 peut être un moyen efficace de renforcer l'immunité.

En conclusion, l'étude actuelle suggère que l'inhibition du canal potassique KV1.3 peut être une approche prometteuse pour améliorer la fonction du système immunitaire et augmenter l'immunité globale du corps. Mais bien que ces résultats soient prometteurs, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer la sécurité et la faisabilité de l'utilisation de cette approche. De ce point de vue, nous devons améliorer notre immunité. Cistanche peut améliorer considérablement l'immunité. La cendre de viande contient une variété d'ingrédients biologiquement actifs, tels que des polysaccharides, deux champignons et Huang Li, qui peuvent stimuler le système immunitaire. différents types de cellules, augmentant leur activité immunitaire.

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Introduction

Le canal potassique voltage-dépendant KV1.3 a été décrit à l'origine dans les cellules T [1] et a ensuite été poursuivi comme cible pour le traitement des maladies auto-immunes médiées par les cellules T telles que la sclérose en plaques, la polyarthrite rhumatoïde et le psoriasis [2–4]. Plus récemment, KV1.3 est apparu comme une cible pharmacologique attrayante pour réduire ce que l'on appelle la « neuroinflammation » en modulant l'activation de la microglie. Dans les modèles d'AVC ischémique chez la souris et le rat, nous et d'autres avons montré que les bloqueurs de KV1.3 réduisaient la zone d'infarctus et amélioraient le déficit neurologique [5,6]. Dans des modèles de souris transgéniques de la maladie d'Alzheimer, le blocage de KV1.3 a diminué la charge amyloïde cérébrale, amélioré la plasticité neuronale de l'hippocampe et amélioré les déficits comportementaux [7].

De même, dans plusieurs modèles animaux de la maladie de Parkinson, l'administration de la petite molécule KV1.3 bloqueur PAP -1 a inhibé la dégénérescence des neurones dopaminergiques et amélioré les résultats comportementaux [8]. Il a en outre été démontré que l'inhibition ou la suppression génétique de KV1.3 améliore la pathologie de la substance blanche après une lésion cérébrale traumatique [9], un déclin cognitif postopératoire [10] et une lésion cérébrale radio-induite [11]. Dans tous ces modèles animaux de maladie neurologique, une expression accrue de KV1.3 a été observée sur la microglie associée à la pathologie et le traitement avec des bloqueurs de KV1.3 a entraîné une réduction de l'activation de la microglie et une réduction des niveaux de cytokines inflammatoires dans le cerveau des animaux.

L'augmentation de l'expression de KV1.3 associée à la maladie semble se traduire chez l'homme, car une forte expression de KV 1.3 a également été trouvée dans des cerveaux humains post-mortem sur la microglie dans les zones infarcies après un AVC ischémique [5,12], sur la microglie entourant les plaques amyloïdes dans la maladie d'Alzheimer [ 7,13], et sur la microglie dans le cortex préfrontal et la substantia nigra dans la maladie de Parkinson [8]. Pris ensemble, ces résultats encourageants dans des modèles humains et animaux suggèrent fortement que les canaux microgliaux KV1.3 sont une cible thérapeutique pour réduire les réponses inflammatoires néfastes dans le cerveau. Mais comment fonctionnent les bloqueurs KV1.3 ? Comment le blocage d'un canal potassique voltage-dépendant dans la microglie, et probablement aussi des macrophages dérivés de monocytes infiltrant le cerveau, réduit-il la production de cytokines inflammatoires et les lésions tissulaires induites par l'inflammation ?

Effets des bloqueurs de KV1.3 sur la fonction de la microglie

Il a été démontré que des microglies néonatales de souris et de rats cultivées, ainsi que des microglies isolées de manière aiguë du cerveau de souris ou des microglies imprimées sur tissu de cerveau de rat, expriment des courants KV1.3 par patch-clamp de cellules entières qui augmentent considérablement après une stimulation in vitro ou in vivo injection intracérébroventriculaire avec le lipopolysaccharide (LPS) ligand du TLR-4 [14–18]. La stimulation avec le composant de paroi cellulaire gram-négatif LPS est largement utilisée pour induire un état "classiquement" activé "de type M1-" de la microglie simulant une inflammation générale qui serait associée à une infection bactérienne [19,20]. Dans le domaine de la neuroimmunologie, la microglie stimulée par le LPS devrait idéalement être appelée microglie M (LPS) en fonction du stimulus utilisé pour induire la polarisation pour éviter d'utiliser la terminologie M1/M2, considérée comme trop simplifiée [21], mais largement utilisée en raison de son intérêt thérapeutique. attraction.

Après stimulation avec le LPS, une expression accrue de KV1.3 peut être observée au niveau de l'ARNm et au niveau des protéines par Western blot, immunohistochimie et augmentation de la densité de courant mesurée par patch-clamp de cellules entières [15-18]. Une augmentation similaire, mais légèrement moins intense, de l'expression de Kv1.3 se produit lorsque la microglie néonatale cultivée est stimulée avec de l'amyloïde oligomérique (AO) ou de la synucléine [7,8], deux protéines mal repliées et agrégées dans la maladie d'Alzheimer ou de Parkinson, et qui sont souvent utilisés pour créer un modèle in vitro des réponses de la microglie associées à la maladie respective.

Dans ces types de systèmes in vitro, l'inhibition ou la suppression génétique de KV1.3 réduit l'expression et la production de plusieurs médiateurs inflammatoires mesurés à 24- ou 48- heures après l'activation de la microglie. Il y a environ 20 ans, le laboratoire de Lyanne Schlichter a rapporté que les inhibiteurs de KV1.3 suppriment l'éclatement respiratoire stimulé par l'ester de phorbol [22] et la production de NO dans la microglie de rat néonatal en culture, réduisant ainsi la destruction neuronale médiée par la microglie dans un système de culture transwell [16].

Dans une étude plus récente de notre laboratoire [17], qui a comparé les effets des bloqueurs de KV1.3 et KCa3.1 avec la minocycline, un inhibiteur de la microglie largement utilisé, sur la microglie de souris néonatale à polarisation différentielle, nous avons observé que l'inhibition de Kv1.3 réduisait l'expression et la production. des cytokines pro-inflammatoires IL-1 et TNF- à 24 et 28 heures et a empêché la régulation à la hausse des enzymes associées à l'inflammation, la cyclooxygénase2 (COX-2) et l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS). Ce dernier effet était probablement responsable de la production réduite de NO observée dans la microglie traitée avec des inhibiteurs de KV1.3 à 24 et 48 heures après la stimulation par le LPS. Semblable aux travaux antérieurs, nous avons également observé que les inhibiteurs de KV1.3 empêchent la destruction neuronale médiée par la microglie dans les cultures de tranches d'hippocampe organotypiques 3 jours après l'activation de la microglie soit par 1- heure d'hypoxie/glycémie pour simuler un AVC ischémique [5] ou par traitement avec de l'amyloïde oligomère pour simuler l'activation de la microglie dans la MA [7].

En plus de réduire l'activation de la microglie induite par l'AO, un phénomène qui peut être clairement démontré en colorant la microglie pour CD11b ou Iba-1 et en évaluant l'intensité de la fluorescence, l'inhibiteur de KV1.3 PAP-1 s'est également avéré prévenir Une altération de la potentialisation à long terme (LPT) induite par l'O et médiée par la microglie dans des tranches d'hippocampe et pour réduire la production induite par A O d'IL-1, de TNF- et de NO dans la microglie de souris en culture [7], très similaire à ce qui avait été trouvé pour les inhibiteurs de KV1.3 avec la microglie stimulée par le LPS [17,18]. Dans des expériences où des microglies de souris néonatales cultivées provenant de souris de type sauvage et KV1.3−/- ont été stimulées avec l'agrégat -synucléine (SynAgg), qui active la microglie en se liant aux récepteurs de reconnaissance de formes TLR2 et CD36 [23], tous deux pharmacologiques KV1. 3 l'inhibition avec PAP-1 et la suppression génétique du canal ont entraîné une réduction de la production d'IL-1, d'IL-6, d'IL-12 et de TNF et ont empêché la régulation positive de la protéine inflammasome NLRP3 à 24 ans heures après la stimulation de la microglie [8]. Inversement, la surexpression de KV 1.3 dans une lignée cellulaire microgliale a augmenté l'expression ou la sécrétion induite par SynAgg de IL-1, TNF-, IL-6 et IL-12 24 heures après la stimulation [8].

Diverses études menées par d'autres groupes ont confirmé que les bloqueurs de KV1.3 réduisent les fonctions de la microglie pro-inflammatoire lors de l'utilisation de stimuli similaires ou associés à d'autres pathologies inflammatoires. Par exemple, dans la microglie de rat en culture activée avec la protéine Tat du VIH ou avec la glycoprotéine 120 (gp120) pour simuler un trouble neurocognitif associé au VIH1-, l'inhibition ou l'inactivation de KV1.3 avec l'ARNsi s'est avérée réduire l'IL-1 , TNF- et NO et suppression de la neurotoxicité [24,25]. À l'aide d'un modèle d'AVC ischémique et de privation d'oxygène/glucose de microglie en culture, Ma et al. ont rapporté que l'inhibition de KV1.3 faisait passer le phénotype microglial d'une réponse pro-inflammatoire de type M1- à une réponse de type M2- et réduisait l'activation de l'inflammasome NLRP3 [5,6], similaire aux études décrites ci-dessus dans des modèles de la maladie de Parkinson [8].

À l'aide de cellules CD11b plus fraîchement isolées, constituées à la fois de macrophages infiltrant le SNC et de microglies résidentes cérébrales provenant du cerveau de souris traitées systématiquement avec du LPS en présence et en l'absence du peptide bloquant KV1.3 ShK-223, Rangaraju et coll. a confirmé que l'inhibition de KV 1.3 réduit l'expression de cytokines inflammatoires telles que IL -1, mais a montré que l'inhibition de KV1.3 réduisait également l'expression de TAP1 et empêchait la régulation à la hausse d'EHD1 dans la microglie CD11b plus CD45low, telle que mesurée par cytométrie en flux [26]. TAP1 et EDH1 sont toutes deux des protéines impliquées dans l'assemblage et le trafic du CMH de classe I vers la surface cellulaire. Les auteurs ont donc ensuite étudié l'effet du traitement ShK -223 sur l'expression de la classe MHC -1 sur la microglie isolée de manière aiguë et, sur la base de l'expression réduite du MHC, ont émis l'hypothèse que les augmentations induites par le LPS de la capacité de présentation d'antigène de les microglies sont des processus dépendants de KV 1.3-, ce qui suggère que l'inhibition de KV1.3 pourrait réduire la présentation de l'antigène aux cellules CD8 plus cytotoxiques.

Dans une analyse de réseau de co-expression pondérée ultérieure appliquée à des ensembles de données transcriptomiques microgliales provenant de modèles murins de maladies neuro-inflammatoires et neurodégénératives, le même groupe a identifié KV1.3 comme faisant partie d'une signature génétique pro-inflammatoire qui comprenait également Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 et RelA [27]. Le blocage de KV1.3 avec ShK-223 pourrait déplacer cette signature pro-inflammatoire vers une signature avec une expression accrue de gènes anti-inflammatoires dans la microglie associée à la maladie. Ce qui est intéressant dans ce contexte, c'est que les inhibiteurs de Kv1.3 ont été rapportés dans d'autres études pour augmenter encore la migration de la microglie cultivée stimulée avec les cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-10 [28] et de ne pas affecter la phagocytose microgliale des microbilles [26] ou même d'augmenter la phagocytose de l'amyloïde [7].

Pris ensemble, il existe donc de nombreuses preuves que la microglie exprime KV1.3 et que les bloqueurs de KV1.3 suppriment les fonctions microgliales pro-inflammatoires et neurotoxiques et pourraient même déplacer la microglie vers un phénotype plus neuroprotecteur. Nous nous sommes principalement concentrés ici sur la synthèse des données obtenues avec des cultures microgliales ou en tranches car, dans ces systèmes réductionnistes, il ne fait aucun doute que le knock-out, le knock-down ou le blocage pharmacologique exerce son effet directement par l'inhibition des canaux microgliaux KV1.3 et non indirectement en affectant Canaux KV1.3 dans les cellules T, les cellules B, les cellules dendritiques ou les monocytes, qui expriment tous KV1.3 [29], et pourraient ainsi contribuer aux effets in vivo des bloqueurs de KV1.3 ou aux découvertes faites avec KV1.3−/- souris. Cependant, nous tenons à souligner ici qu'en plus de nombreuses études montrant l'expression de KV1.3 sur la microglie chez les rongeurs et les humains par immunohistochimie, le laboratoire Kettenmann et notre groupe ont montré à plusieurs reprises que l'augmentation de l'expression de KV1.3 sur la microglie activée n'est pas seulement un phénomène de culture tissulaire et que les courants Kv1.3 peuvent être enregistrés à partir de la microglie dans des tranches aiguës [30, 31] et de la microglie aiguë isolée du cerveau de souris 5xFAD [7] ou de la zone infarcie après occlusion de l'artère cérébrale moyenne [5, 12], un modèle d'AVC ischémique.

Voies de signalisation affectées par l'inhibition de KV1.3 ou la modulation de l'expression de Kv1.3

Des études portant sur les voies de signalisation (Figure 1) qui sont affectées par les bloqueurs de KV1.3 pour produire ces réductions bénéfiques des fonctions de la microglie pro-inflammatoire 24 ou 48 heures plus tard ont donné des résultats quelque peu contradictoires, suggérant que les effets des bloqueurs de KV1.3 dépendent sur le stimulus et peut-être sur l'espèce. Alors que Fordyce et al. ont rapporté que les bloqueurs de KV1.3 n'affectent pas la phosphorylation de p38MAPK dans la microglie de rat nouveau-né traitée au LPS [16], plusieurs autres études utilisant la microglie de souris ont montré que les bloqueurs de KV1.3 réduisent fortement la phosphorylation de p38MAPK ainsi que l'activation de NF-κB suite à une stimulation avec LPS, AO, SynAgg ou glycoprotéine 120 du VIH-1 [7,8,24]. Dans la lignée cellulaire microgliale, il a également été démontré que BV2 KV1.3 régule la phosphorylation de S727 de STAT1 [26]. Fait intéressant, si les bloqueurs de KV1.3 inhibent la translocation de NFAT, l'un des effets les mieux étudiés des bloqueurs de KV1.3 dans les cellules T [2, 32, 33] n'a pas encore été étudié dans la microglie.

Les augmentations de l'expression de KV1.3 suite à la stimulation de la microglie avec LPS, AO ou SynAgg semblent impliquer plusieurs des mêmes cascades de signalisation qui sont affectées par l'inhibition de KV1.3, et les bloqueurs de KV1.3 empêchent généralement les augmentations de l'expression de Kv1.3. Le promoteur KV1.3 contient plusieurs sites de liaison NF-κB et SP1 et les inhibiteurs de NF-κB ou p38MAPK réduisent indépendamment la régulation à la hausse de Kv1.3 stimulée par SynAgg dans la microglie [8], démontrant que les voies p38MAPK et NF-κB classique interviennent dans la régulation transcriptionnelle de KV1.3 (Figure 1). La kinase Fyn de la famille Src agit en amont du facteur de transcription NF-κB en régulant la translocation nucléaire de son composant p65 [34] et en phosphorylant l'isoforme PKC PKCδ. Sarkar et al. ont rapporté que l'inactivation de Fyn réduit à la fois les augmentations induites par LPS et SynAgg de la densité de courant KV1.3 dans la microglie cultivée, un effet qui peut être imité par le traitement de la microglie avec l'inhibiteur de Fyn saracatinib ou par une déficience en PKCδ, suggérant que la signalisation de la kinase Fyn/PKCδ cascade est impliqué dans la médiation de la régulation à la hausse de KV1.3 en réponse à des stimuli inflammatoires [8]. Comme démontré dans un test de ligature de proximité Duolink, Fyn interagit directement avec Kv1.3 et phosphoryle le canal à Y135 pour augmenter son activité.

Kv1.3 régule le potentiel membranaire et résiste à la dépolarisation'

Malgré les effets d'amélioration bien documentés décrits ci-dessus des bloqueurs de KV1.3 sur la neuroinflammation in vivo et sur les cascades de signalisation microgliale et l'expression et la sécrétion de médiateurs inflammatoires in vitro, les mécanismes moléculaires fondamentaux de la façon dont les bloqueurs de KV1.3 affectent les fonctions microgliales sont restés longtemps incertains. De nombreux chercheurs, y compris notre laboratoire, ont simplement supposé que KV1.3 remplissait la même fonction dans la microglie qu'il remplissait dans les cellules T, à savoir la régulation du potentiel membranaire et de l'influx de calcium [29,32,33].

Dans les cellules T, l'inhibition de KV1.3 entraîne une dépolarisation membranaire et réduit l'afflux de calcium par les canaux calciques activés par la libération de calcium (CRAC) après la stimulation des récepteurs des cellules T [33, 35, 36]. L'afflux de calcium via les canaux CRAC est indispensable à la déphosphorylation et à la translocation nucléaire ultérieure du facteur de transcription dépendant du calcium/calmoduline NFAT [29], qui déclenche la transcription de la cytokine IL-2 [29,33]. IL-2 est libéré des lymphocytes T activés lors de la synthèse et stimule l'expansion clonale des lymphocytes T de manière autocrine et paracrine. En inhibant l'efflux de potassium qui contrebalance qui est nécessaire pour maintenir l'influx de calcium à travers les canaux CRAC, les bloqueurs de KV1.3 perturbent l'activation des cellules T, empêchent la déphosphorylation de NFAT et la translocation nucléaire [32] conduisant à une prolifération réduite des cellules T et à une production et une sécrétion réduites de cytokines inflammatoires à 48 heures [5,33,35,36].

Cependant, il n'avait jamais été testé dans la microglie qui, contrairement aux lymphocytes T, exprime également le redresseur interne Kir2.1 [17,37,38] et le canal potassique à deux pores THIK-1 (K2P 13.1) [39], si les bloqueurs de KV1.3 auraient les mêmes effets moléculaires ou si le rôle de KV1.3 était repris par ces autres canaux potassiques. Dans une étude récente, notre groupe a donc abordé cette question en réexaminant d'abord l'importance fondamentale de KV1.3 dans le maintien du potentiel de membrane au repos et la résistance à la dépolarisation [40]. Comme prévu, la surexpression de KV1.3 dans les cellules CHO a abaissé le potentiel de membrane au repos généralement très dépolarisé de ces cellules de -20 mV à -50 mV, tandis que l'inhibition de KV1.3 avec la microglie dépolarisée ShK -223, qui maintient intrinsèquement une un potentiel de membrane au repos plus hyperpolarisé, qui dans nos mains était en moyenne d'environ -90 mV dans la microglie indifférenciée exprimant principalement Kir2.1 et d'environ -65 mV dans la microglie stimulée par le LPS exprimant des densités de courant KV1.3 plus élevées et Kir2.1 plus faibles [40].

Alors que KV1.3 contribue donc certainement à réguler le potentiel membranaire au repos dans la microglie (Figure 2), nous pensons que son rôle le plus important, et la raison pour laquelle l'expression de Kv1.3 augmente dans la microglie activée, est la capacité du canal à compenser les extrêmes et prolongés. dépolarisation membranaire qui peut potentiellement avoir un impact négatif sur la santé et la physiologie de la microglie, comme l'ont révélé les expériences d'injection actuelles. Alors que les injections de courant de 25 pA ne sont pas capables de dépolariser la microglie exprimant KV 1.3 au-delà de -30 mV en l'absence de bloqueurs, la microglie prétraitée avec des bloqueurs de KV 1.3 se dépolarise à des potentiels de plus 50 mV en réponse aux mêmes injections de courant de 25 pA [40] , suggérant que KV1.3 peut "serrer" le potentiel de membrane près du potentiel de seuil d'activation du canal pour empêcher les dépolarisations excessives de la membrane (Figure 2).

La situation dans la physiologie microgliale où cette capacité est importante est lorsque la microglie est exposée à l'ATP extracellulaire, un signal de danger qui peut atteindre des concentrations dans la gamme micromolaire élevée en raison de la libération d'ATP cytosolique à partir de neurones endommagés ou de vésicules synaptiques contenant de l'ATP [41], qui activent les canaux récepteurs P2X conduisant à des dépolarisations intenses [42]. Dans nos propres mains, des expériences de pince de courant réalisées sur des microglies indifférenciées et stimulées par le LPS ont montré qu'une exposition aiguë à 100 μM d'ATP, qui parmi les récepteurs P2X exprimés dans la microglie active principalement P2X4, conduit à des dépolarisations plus prononcées dans la microglie indifférenciée, malgré leur plus potentiel de membrane au repos hyperpolarisé que dans la microglie stimulée par le LPS KV1.3high, qui ne se dépolarise pas au-dessus de -40 mV. Les bloqueurs de KV1.3 ont altéré cette capacité à résister aux dépolarisations induites par l'ATP et à la microglie dépolarisée en leur présence [40].

KV1.3 module l'influx de calcium médié par les récepteurs P2X4 dans la microglie

Des expériences d'imagerie calcique ont révélé que cette capacité des canaux KV1.3 à résister aux dépolarisations médiées par P2X 4- induites par l'ATP améliore l'entrée de Ca2 plus dans la microglie via les récepteurs P2X4 stimulés avec 100 μM d'ATP [40]. Par exemple, nous avons observé que les bloqueurs de KV1.3 ShK-223 et PAP-1 réduisaient l'afflux de Ca2 plus induit par l'ATP via les récepteurs P2X4 dans la microglie différenciée en LPS qui expriment des densités de courant KV1.3 élevées, bien plus fortement que dans la microglie non stimulée, même si la stimulation par le LPS régule à la baisse l'expression du récepteur P2X4 dans la microglie cultivée. En revanche, le blocage de KV1.3 n'a eu aucun effet sur les transitoires calciques induits par l'ATP dans la microglie stimulée par l'IL-4, qui exprime de très faibles niveaux de KV1.3. Fait intéressant, alors que le LPS augmente également KV1.3 et réduit l'expression de P2X4 sur la microglie in vivo, l'expression de KV1.3 et P2X4 augmente en parallèle dans le cadre d'un AVC ischémique, comme le montre notre laboratoire sur la microglie isolée de manière aiguë de l'hémisphère cérébral infarci de souris. soumis à un AVC ischémique et par d'autres groupes sur la microglie de rongeurs et humains par immunohistochimie ou qPCR [5,12,43–46]. Cela suggère qu'à la suite d'un AVC ischémique, KV1.3 pourrait réguler plus fortement la signalisation calcique microgliale purinergique plus complexe initiée par le signal de danger ATP plus fortement qu'in vitro. L'ATP et d'autres débris neuronaux dans la zone infarcie du cerveau activent la microglie, qui produit et libère ensuite continuellement plus de médiateurs inflammatoires dans les 24 à 72 heures et endommage et tue ainsi plus de neurones dans la pénombre, entraînant une expansion inflammatoire de l'infarctus.

L'expression accrue de KV1.3 observée sur la microglie à la frontière de l'infarctus dans les 2 à 5 jours [5] permet vraisemblablement à la microglie activée de maintenir des signaux calciques plus forts grâce au nombre accru de récepteurs P2X4 et ainsi de produire plus de médiateurs inflammatoires, endommageant plus de neurones. et activer plus de microglie. Cette hypothèse serait conforme à la découverte selon laquelle le bloqueur KV1.3 PAP-1 réduisait l'activation de la microglie et les niveaux cérébraux d'IL-1 et d'IFN-, entraînant une réduction d'environ 40 % des zones d'infarctus et une amélioration du déficit neurologique scores dans les modèles souris et rat d'AVC ischémique [5]. En dépolarisant la microglie, les bloqueurs de Kv1.3 réduisent l'afflux de calcium via les récepteurs P2X4 déclenchés par l'ATP libéré par les neurones endommagés et atténuent ainsi l'activation dépendante du calcium de l'inflammasome NLRP3, du NF-κB et d'autres facteurs de transcription conduisant à une réduction de la production de médiateurs inflammatoires (Figure 1) et une pathologie réduite.

Quelles autres voies d'influx de calcium dans la microglie sont régulées par KV1.3 ?

Alors que le blocage de KV1.3 a clairement réduit l'influx de calcium induit par l'ATP via les récepteurs P2X4 [40] et constitue ainsi un régulateur important de cette voie d'influx de calcium dans la microglie (Figure 2), ce n'est pas la seule voie de signalisation calcique dépendante de KV1.3 ou de l'ATP. processus dans la microglie. En plus des canaux récepteurs P2X, la microglie exprime également des récepteurs purinergiques métabotropiques P2Y qui, après activation par l'ATP ou l'UTP, peuvent induire la libération de calcium à partir des réserves internes [47] et activer l'entrée de Ca2 plus opérée par la réserve (SOCE) suite à l'épuisement des réserves de calcium intracellulaires relativement petites. dans la microglie [38]. Il est donc certainement possible que des SOCE supplémentaires aient contribué aux signaux Ca2 plus induits par l'ATP que nous avions imagés et que certains des effets bloquants de KV1.3 aient été médiés par une réduction supplémentaire de SOCE.

Il s'agit d'une hypothèse très probable puisque le mécanisme moléculaire "classique" des bloqueurs de KV1.3 dans les lymphocytes T est la réduction de SOCE par les canaux CRAC suite à l'activation des récepteurs des lymphocytes T et par la suite une réduction de l'activation du facteur de transcription et de la production et de la libération de cytokines [29,33, 36,48]. Il a été rapporté à plusieurs reprises que la microglie de rat et de souris présentait des courants avec des propriétés biophysiques typiques des courants CRAC [49, 50] et exprime les composants moléculaires des canaux CRAC, Orai et STIM [51, 52]. Il existe en outre des preuves que la suppression génétique d'Orai1, STIM1 et STIM2 réduit le courant CRAC et / ou SOCE et inhibe la migration et la phagocytose dans la microglie de souris en culture [52], tandis que le bloqueur de canaux CRAC à petite molécule CM-EX -137 a ont récemment été rapportés pour diminuer l'activation de la microglie et la taille des lésions dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique [53].

Le blocage des canaux KV1.3 atténue l'entrée de calcium stockée dans la microglie stimulée par le LPS

Dans le cadre d'une expérience de suivi de notre article précédent sur le rôle de KV1.3 dans la régulation de l'influx de calcium médié par P2X4, nous avons spécifiquement posé ici la question de savoir si le bloqueur KV1.3 ShK -223 réduirait également SOCE dans la microglie différenciée LPS , la même condition de stimulation, où nous avions observé les densités de courant KV1.3 les plus élevées et les effets les plus importants de l'inhibition de KV1.3 sur la signalisation calcique induite par l'ATP [40]. En utilisant l'indicateur de calcium ratiométrique Fura-2 pour suivre les changements dans la concentration de calcium intracellulaire libre ([Ca2 plus ]i), nous avons constaté que la microglie différenciée en LPS avait une concentration de calcium cytosolique au repos [Ca2 plus ] I qui variait entre 60 nM et 370 nM, avec une moyenne de 150 ± 8,8 nM (n=50 ; Figure 3a,c,g), ce qui est cohérent avec un rapport précédent [54]. Pour susciter la SOCE, les réserves de calcium intracellulaires ont d'abord été épuisées avec de la thapsigargine (Tg), un bloqueur du réticulum endoplasmique Ca2 plus -ATPase, appliqué dans une solution de bain nominalement sans Ca2 plus.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) élévations asynchrones de [Ca2 plus] I dues à la mobilisation passive du calcium à partir des réserves. La réaddition de calcium dans la solution du bain a provoqué une élévation rapide de [Ca2 plus ] I au-dessus des niveaux de repos causés par SOCE. L'ampleur des transitoires [Ca2 plus ] I induits par la SOCE (« pic SOCE ») mesurés comme la différence entre le niveau de [Ca2 plus ] I dans la solution de bain sans Ca2 plus et l'élévation maximale de [Ca2 plus ] I après réajout de calcium variait de manière significative parmi les cellules individuelles avec une distribution maximale de SOCE affichant un maximum à 120 nM et une queue jusqu'à 1800 nM (Figure 1b). Cette hétérogénéité dans la force de SOCE est probablement causée par des variations du potentiel de membrane au repos, qui fournit la force motrice pour l'entrée de calcium pendant SOCE. Il a été constaté que le potentiel de membrane au repos de la microglie différenciée en LPS varie entre -90 mV et -40 mV dans des cellules individuelles [40, 55] et pourrait donc expliquer les différences observées dans le SOCE.

Une étude précédente a rapporté que l'élévation du [Ca2 plus] I au repos était associée à une capacité réduite des stimuli externes tels que l'UTP, agoniste du récepteur P2Y ou le facteur 5a du complément, à provoquer des transitoires [Ca2 plus] I dans la microglie activée par le LPS [54]. Étant donné que dans notre étude, les niveaux de [Ca2 plus ]i au repos et les valeurs maximales de SOCE variaient d'une cellule à l'autre, nous avons examiné si la variation du [Ca2 plus ]i au repos pouvait expliquer l'hétérogénéité des valeurs maximales de SOCE. Le tracé des valeurs maximales de SOCE par rapport au repos [Ca2 plus] I a révélé une corrélation positive entre le pic de SOCE et le repos [Ca2 plus] I (Figure 3c). Lorsque nous avons divisé les données en deux groupes avec une valeur seuil de 600 nM pour le pic de SOCE, les relations entre [Ca2 plus ] I au repos et le pic de SOCE dans chaque groupe étaient plus fortes que dans l'ensemble de la population, indiquant la présence d'au moins deux cellules populations, qui diffèrent à la fois par l'ampleur de la SOCE et la force de la corrélation entre [Ca2 plus ] I au repos et la SOCE maximale. Ainsi, au sein de la population de cellules traitées au LPS, une élévation du [Ca2 plus ]i au repos n'est pas liée de manière causale à la capacité réduite de la microglie activée à répondre aux stimuli externes avec un [Ca 2 plus ] I transitoire, comme cela a été suggéré précédemment. par Hoffmann et al. Nos données suggèrent qu'une influence commune, telle que le niveau de potentiel membranaire, qui est contrôlé par une variété de canaux, y compris KV1.3, Kir2.1 et THIK-1, peut être responsable de la corrélation positive entre [Ca2 plus ] I au repos et le pic de SOCE observé dans notre étude. Par exemple, la surexpression ou la régulation positive fonctionnelle des canaux hyperpolarisants pourrait hyperpolariser la membrane et augmenter la force motrice pour l'entrée du calcium via des canaux perméables au calcium constitutivement actifs tels que les canaux de potentiel de récepteur transitoire (TRP) activés métaboliquement et les canaux actionnés par le magasin activés après l'épuisement du magasin. tels que les canaux CRAC.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Les caractéristiques spécifiques des cellules à SOCE pic haut et bas restent à déterminer.

Dans des conditions physiologiques, la SOCE peut être déclenchée ultérieurement pour stocker l'épuisement après l'activation des récepteurs P2Y couplés aux protéines G et contribue à l'élévation [Ca2 plus ] I combinée lors de l'activation des récepteurs P2Y et P2X provoquée par des agonistes purinergiques courants, tels que l'ATP. L'ampleur de la SOCE varie considérablement parmi les cellules différenciées LPS, ce qui peut être fonction de la combinaison unique d'expression différentielle de canaux exploités en magasin et de canaux contrôlant le potentiel membranaire, tels que KV1.3. La réduction du pic de SOCE par ShK-223 indique que les canaux KV1.3 sont de puissants régulateurs de SOCE et découvrent un mécanisme supplémentaire par lequel les bloqueurs de KV1.3 atténuent la signalisation calcique et les réponses fonctionnelles ultérieures (par exemple, la production de cytokines) après la transcription dépendante du calcium activation du facteur dans la microglie.

conclusion

Bien qu'il soit certainement difficile de trier les effets de la contribution sur les cellules du système immunitaire périphérique, en particulier sur les cellules T mémoire et les macrophages dérivés des monocytes, aux effets bénéfiques des inhibiteurs de KV1.3 sur l'inflammation dans le SNC, il est clair que KV1.3 joue un rôle important dans la régulation du potentiel membranaire, la prévention de la dépolarisation et le contrôle des événements de signalisation du calcium qui conduisent ensuite à l'activation de la microglie et à la production de médiateurs inflammatoires. Nous aimerions suggérer que d'un point de vue thérapeutique, il est probablement souhaitable d'inhiber KV1.3 dans plusieurs types de cellules du système immunitaire. Cependant, il serait intellectuellement très satisfaisant et utile pour le développement de thérapies de clarifier quelle est la principale cible cellulaire des inhibiteurs de KV1.3 et si les thérapeutiques doivent être pénétrantes dans le cerveau pour exercer des effets d'amélioration optimaux dans les maladies du SNC. Ces questions devraient idéalement être abordées sur le plan pharmacologique en testant de petites molécules pénétrant dans le cerveau côte à côte avec des inhibiteurs peptidiques restreints de KV1.3 ou des anticorps anti-KV1.3 [58, 59] dans des modèles animaux de la maladie d'Alzheimer et de Parkinson. Il serait en outre très instructif de comparer les effets de la suppression conditionnelle de KV1.3 dans la microglie, les macrophages dérivés de monocytes et différents sous-ensembles de lymphocytes T aux effets du traitement médicamenteux afin de mieux comprendre le rôle de KV1.3 dans la neuroinflammation. et la cible cellulaire des inhibiteurs de KV1.3. Cependant, nous pensons qu'au niveau cellulaire, le rôle fondamental de KV1.3 sera toujours ce qui a été décrit pour la première fois dans les cellules T, à savoir la régulation du potentiel membranaire et de l'influx de calcium et l'activation ultérieure des facteurs de transcription dépendants du calcium. Ce qui n'est parfois pas assez souligné à cet égard, c'est probablement que les propriétés biophysiques de KV1.3, comme sa tension de demi-activation et son inactivation relativement lente [60,61], "qualifient" parfaitement le canal pour résister aux dépolarisations membranaires et permettent ainsi à KV1 .3 pour réguler non seulement SOCE, comme cela a été décrit il y a 30 ans dans les cellules T, mais également l'influx de calcium médié par les récepteurs P2X.

Déclaration de divulgation

Aucun conflit d'intérêt potentiel n'a été signalé par les auteurs.

Financement

Ce travail a été soutenu par un prix NS100294 de l'Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (à HW) et une subvention de partenariat de recherche de l'UC Davis School of Medicine (à l'AFF).

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