Production de lipase par Yarrowia Lipolytica en fermentation à l'état solide en utilisant des sous-produits de fruits d'Amazonie et de la farine de soja comme substrat Partie 2

2.5. Hydrolyse d'huile de poisson

Les lipases ont été utilisées dans l'hydrolyse des acides gras pour concentrer les acides gras polyinsaturés (AGPI) [44,45]. Le principal avantage de l'application des lipases dans la production d'acides gras polyinsaturés est la spécificité de l'enzyme et des réactions se produisant dans des conditions de température modérée, ce qui favorise le maintien de la structure des AGPI [44]. L'utilisation de lipases est préférée aux méthodes chimiques car elles fournissent des glycérides de faible rendement et de faible pureté [46]. Le rôle des lipases dans l'hydrolyse sélective des acides gras saturés (SFA) et des acides gras monoinsaturés (MUFA) à partir des triacylglycérols (TAG) est de produire des glycérides riches en PUFA. Le principe de cette méthode est l'encombrement stérique causé par la configuration moléculaire des doubles liaisons carbone-cis dans les PUFA qui provoquent le repliement des chaînes d'acides gras. Ainsi, les sites actifs enzymatiques n'accèdent pas aux liaisons ester de ces acides gras avec leurs squelettes glycérol [47,48]. De nombreux avantages sont associés à l'insertion d'acides gras dans l'alimentation tels que le développement de l'enfant, la prévention des maladies cardiovasculaires, du cancer et de divers troubles mentaux (dépression, trouble déficitaire de l'attention, hyperactivité), en plus du potentiel anti-inflammatoire et de l'hypertension potentielle. contrôle [49].

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une forte capacité de piégeage des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et a la capacité de piéger les espèces réactives de l'oxygène et d'empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres, et a également un bon effet réparateur sur les dommages anioniques des radicaux libres thymine.

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La production d'extraits enzymatiques à appliquer dans des procédés tels que l'hydrolyse peut être une tâche coûteuse. Ainsi, la recherche de matières premières permettant de réduire les coûts de production peut constituer une alternative intéressante. L'utilisation d'un biocatalyseur solide est souhaitable car ce biocatalyseur solide peut être réutilisé dans des réactions enzymatiques, en plus d'avoir une excellente stabilité au stockage à température ambiante, sans frais de réfrigération, et une facilité de transport [41]. Il n'y a eu aucun rapport sur l'utilisation d'un biocatalyseur solide de Yarrowia lipolytica pour produire des PUFAS par hydrolyse enzymatique d'huile de poisson. Ainsi, l'application de l'extrait enzymatique brut et du biocatalyseur solide produit à l'aide de tourteau d'andiroba et de tourteau de soja (50:50) a été étudiée pour évaluer l'application potentielle d'enzymes dans l'hydrolyse de l'huile de poisson pour produire davantage d'acides gras polyinsaturés dans un processus approprié. (Figure 6). Il est possible d'observer un haut degré d'hydrolyse (DH) dans des temps de réaction plus courts en utilisant un biocatalyseur solide (63, 70,8, 72,5 et 74,7 pour cent) que l'extrait enzymatique (47,5, 61,5, 66,5 et 74,8 pour cent) après 24, 48, 72 heures et 144 heures, respectivement.

Le procédé d'hydrolyse enzymatique est constamment appliqué pour obtenir des acides gras polyinsaturés concentrés. Gao et al. [50] ont utilisé la lipase dans l'hydrolyse de l'huile de morue et les teneurs en EPA et DHA ont été améliorées de 3,24- fois et 1,98- fois, respectivement. Aarthi et al. [20] ont utilisé la lipase concentrée (1000 U/mL) dans l'hydrolyse des huiles de poisson et ont également trouvé un taux d'hydrolyse supérieur à 60 % après 72 h. Dans ce travail, de meilleurs degrés d'hydrolyse ont été obtenus en utilisant un extrait enzymatique brut de lipase (c'est-à-dire sans purification) en comparant le même temps d'hydrolyse. D'autres auteurs ont étudié l'hydrolyse de l'huile de foie de Musteleus mustelus et de l'huile de graisse de phoque rapportant 75 % et 70 % d'hydrolyse après 24 et 9 h de réaction, respectivement [25,26].

Martins et al. [51] ont utilisé une lipase commerciale de Burkholderia cepacia (Amano) pour l'hydrolyse de l'huile de poisson et après 48 h de réaction, ont obtenu 55,6 % de DHA par rapport à la teneur maximale calculée. Dans notre travail, dans une étude préliminaire, nous avons obtenu 70,8 % d'hydrolyse après 48 h de réaction en utilisant le biocatalyseur solide.

Jusqu'à présent, ces découvertes ont suggéré la viabilité de l'utilisation de sous-produits pour produire de la lipase dans la fermentation à l'état solide comme moyen d'atténuer les dommages environnementaux, d'évaluer les sous-produits et la rentabilité. De plus, les résultats montrent l'application potentielle de l'enzyme lipase dans l'hydrolyse de l'huile de poisson pour produire davantage d'acides gras polyinsaturés dans un procédé approprié.

Bien qu'ils soient abondants en sous-produits agro-industriels à faible coût, la détermination et la standardisation de la composition, en plus de l'estimation des coûts pour obtenir l'extrait enzymatique et le biocatalyseur solide à partir de sous-produits agro-industriels à faible coût, restent un défi, mais extrêmement dépendante du type de sous-produit, de la saisonnalité et de la quantité générée ainsi que du procédé utilisé et de l'emplacement géographique, entre autres facteurs. Ainsi, des problèmes tels que la complexité de la chaîne et ses coûts logistiques, l'utilisation de processus complexes et coûteux, la forte consommation d'énergie et les problèmes réglementaires, entre autres, doivent être surmontés. En ce sens, la transformation des sous-produits doit surmonter plusieurs obstacles avant de devenir économiquement viable, notamment la nécessité de traiter de grandes quantités de matières premières, la capacité de traiter des matières premières hétérogènes, la logistique intégrée avec différentes industries de transformation et la possibilité d'intégration processus dans l'unité de transformation pour permettre la génération d'ingrédients de haute valeur, entre autres [52-55].

3. Matériels et méthodes

3.1. Matériel

La farine de soja a été achetée à Caramuru Alimentos (Goiás, Brésil). Le tourteau d'Andiroba produit à partir de l'extraction de l'huile a été fourni par Beraca Ingredientes Naturais (Pará, Brésil). Les deux substrats ont été standardisés sur la granulométrie (<1.18 mm) and properly stored under refrigeration in polypropylene packages until use. The fish oil was purchased from Mundo dos Óleos, and according to the manufacturer, it is extracted by cold pressing and filtration, obtained from raw material with guaranteed origin. All other chemicals used were of analytical grade and used as received without any further purification, being obtained from Tedia (acetone), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA, glucose, azocasein, agar, yeast extract, ethanol, methanol), Vetec (Tween 80), Oxoid (peptone), Isofar (sodium hydroxide, gum Arabic), and Precision Plus Protein Kaleidoscope—Bio-rad (molecular mass markers, kDa).

3.2. Conditions de culture des micro-organismes et des inoculums

Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682, isolée d'un estuaire de la baie de Guanabara, Rio de Janeiro, Brésil [56] a été cultivée à 28 ◦C dans un milieu YPD-agar (p/v : extrait de levure 1 % ; peptone, 2 % ; glucose, 2 % ; gélose, 3 %). Les cellules ont été cultivées dans un milieu liquide contenant de l'extrait de levure à 1 % (p/v), de la peptone à 2 % (p/v) et du glucose à 2 % (p/v) pendant 72 h, 160 tr/min à 28 °C.

3.3. Caractérisation des sous-produits agro-industriels

La composition physico-chimique de la farine de soja et du tourteau d'andiroba a été déterminée en termes d'humidité, de protéines, de glucides, de cendres, d'extrait d'éther, de fibres insolubles et de fibres solubles, selon la méthodologie rapportée par l'Association of Official Analytical Chemists (AOAC ) [57]. De plus, comme la production de lipase par Y. lipolytica est affectée par l'aération [58], la porosité du lit dans SSF a été évaluée selon l'équation (1), où ε est la porosité (exprimée en m3 air·m−3 lit) ; ρdrysolid est la masse volumique apparente de l'échantillon sec (kg·m−3 ) ; et ρwetsolid est la masse volumique de l'échantillon après addition d'eau (kg·m−3 ) [58].

3.4. Production de lipase par SSF

La matrice solide contenant la farine de soja et le tourteau d'andiroba a été préparée avant l'inoculation dans le réacteur de type plateau avec différentes proportions du substrat et autoclavée à 121 ◦C pendant 20 min. Les paramètres de procédé fixes utilisés pour la production de lipase étaient une humidité de 55 % et une concentration d'inoculum de 0,71 mg de biomasse sèche/g de substrat [24]. Les réacteurs ont été incubés dans une chambre de demande biochimique en oxygène (DBO) à 28 °C et des échantillons sacrificiels (c'est-à-dire un réacteur de type plateau pour le temps échantillonné) ont été prélevés tout au long de la fermentation pour analyse.

Le SSF a été évalué à l'aide de différentes combinaisons de tourteau d'andiroba et de tourteau de soja ({{0}} : 1{{10}}0 ; 25:75 ; 50:50 ; 75 :25 et 100:0) à des moments différents (0, 12, 24, 32 et 48 h). Ensuite, la supplémentation de la matrice solide contenant du tourteau d'andiroba et de la farine de soja (50:50) a été évaluée en ajoutant 1,5 (% p/v) d'huile de soja au fil du temps (0, 12, 14, 20, 24, 28, 48, et 72 h) pour obtenir une augmentation de l'activité lipolytique. De plus, la présence de Tween 80 (0,001 pour cent p/v) dans le milieu de fermentation contenant 1,5 (pour cent p/v) d'huile de soja a été testée. La fermentation a été contrôlée en déterminant l'activité lipase et protéase ainsi que l'humidité et le pH (décrits dans la sous-section "3.6. Déterminations analytiques").

3.5. Extraction d'enzymes et production de biocatalyseur solide

L'extraction enzymatique a été réalisée en ajoutant 50 mL de tampon phosphate de potassium 50 mM pH 7,0 dans les bioréacteurs, suivi d'une incubation à 37 ◦C, 200 tr/min, pendant 20 min. Par la suite, le matériel fermenté en suspension dans le tampon a été pressé à l'aide d'un pilon à gaze et centrifugé à 3000 tr/min pendant 5 min. Le biocatalyseur solide a été obtenu à partir de la lyophilisation de la masse entière obtenue à la fin du processus de fermentation pendant 72 h et conservée à température ambiante pendant 7 mois pour vérifier la stabilité enzymatique.

3.6. Déterminations analytiques

3.6.1. Activité lipasique

L'activité lipase a été réalisée selon la méthode proposée par Freire et al. [59]. Le milieu réactionnel a été émulsifié dans un homogénéisateur Ultra Turrax (IKA) en utilisant 5 % (p/v) d'huile d'olive et 5 % (p/v) de gomme arabique dans un tampon phosphate 100 mM (pH 7.0). L'extrait enzymatique (1 ml) ou 0,5 g du biocatalyseur solide a été ajouté à 19 ml du mélange réactionnel et incubé pendant 20 min, 200 tr/min à 37 °C. La réaction a été interrompue par l'ajout de 20 ml d'une solution d'acétone-éthanol et les acides gras libres ont été titrés dans un titrateur automatique (Metrohm 916 - Ti-Touch) en utilisant une solution de NaOH à 0,04 mol/L. Une unité d'activité lipase (U) a été définie comme la quantité d'enzyme qui produit 1 µmol d'acide gras par minute, dans les conditions du dosage.

3.6.2. Activité protéase

L'activité protéasique a été quantifiée selon la méthodologie de Charney et Tomarelli [60]. L'extrait enzymatique (0 0,5 mL) a été ajouté dans 0 0,5 mL de solution d'azocaséine 0 0,5 % (p/v) préparée avec un tampon acétate 50 mM (pH) et incubée. à 32 ◦C pendant 40 min. La réaction a été stoppée par l'ajout de 0,5 mL d'une solution d'acide trichloroacétique à 15 % (p/v) et les échantillons ont été centrifugés à 3 000 tr/min pendant 15 min. Le surnageant (100 µL) a été ajouté dans une plaque de microtitration 96- contenant 100 µL d'hydroxyde de potassium 5 M, et l'absorbance à 428 nm a été mesurée dans un lecteur de plaque de microtitration (SpectraMax, Molecular Devices). Une unité d'activité a été définie comme la quantité d'enzyme capable de favoriser une augmentation unitaire de l'absorbance par minute.

3.6.3. Teneur en humidité et pH

La teneur en humidité a été contrôlée à l'aide d'une balance dessiccateur (AND MX-50). Le pH a été mesuré sur un pH-mètre (TECNAL, modèle TR-107 PT100, Brésil).

3.7. FDS-PAGE

L'électrophorèse a été réalisée selon la méthode rapportée par Laemmli [61] dans un gel de polyacrylamide (5 % d'empilement, 15 % de séparation, 0 0,75 mm d'épaisseur). Les échantillons ont été mélangés dans un rapport (1:4) à partir d'une combinaison de tourteau d'andiroba et de soja (50:50) avec un tampon d'échantillon contenant du -mercaptoéthanol, chauffé à 95 ◦C pendant 5 min et appliqué sur le gel. L'électrophorèse a été réalisée à 150 V pendant 30 min (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et le gel a été révélé à l'aide de Coomassie Blue R-250. Un marqueur protéique standard (Bio-rad, Hercules, CA, USA) avec un poids moléculaire allant de 10 à 250 kDa a été utilisé.

3.8. Hydrolyse de l'huile de poisson : une application potentielle

Le degré d'hydrolyse (DH) de l'huile de poisson a été mesuré en pesant 1 g d'huile de poisson et en ajoutant 25 ml de tampon phosphate pH 7.0 pour vérifier l'application potentielle de l'enzyme dans l'hydrolyse de l'huile de poisson. Ensuite, 5 ml de l'extrait enzymatique (37 U) dans des flacons ambrés ont été agités pendant 168 h. La réaction a été stoppée avec 20 mL d'acétone et les acides gras libres ont été titrés dans un titrateur automatique avec du KOH méthanolique 0,1 M. Le blanc de réaction a été obtenu avec l'ajout de l'enzyme uniquement à la fin de la réaction.

Le degré d'hydrolyse (DH) a été calculé selon l'équation (2) :

où As est l'acidité de l'échantillon ; Aa est l'acidité de l'autohydrolyse ; Si est l'indice de saponification.

3.9. Analyses statistiques

Toutes les expériences ont été répétées trois fois. Dans chaque réplication, les analyses ont été réalisées en triple. Les résultats correspondaient à la moyenne ± écart-type. Les données ont été analysées par l'analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) tandis que le test de Tukey (p <0.05) a été utilisé pour tester les différences entre les moyennes à l'aide du Sisvar 5.6.

4. Conclusions

Le milieu de fermentation obtenu après mélange de tourteau d'andiroba et de tourteau de soja s'est avéré très efficace dans la production de lipase. La matrice de fermentation choisie était le mélange de tourteau d'andiroba et de tourteau de soja dans un rapport 50:50, produisant 63,70 U·g -1 d'activité lipolytique. L'activité lipolytique maximale a été obtenue (82,52 U·g −1 ) après avoir utilisé le rapport tourteau d'andiroba et tourteau de soja de 50:50 après supplémentation avec du Tween 80 (0,001 pour cent ) et de l'huile de soja (1,5 pour cent ). Dans l'analyse électrophorétique, des bandes de protéines déjà signalées dans la littérature comme YL Lip2 (37 et 40 kDa) ont été détectées. L'application précédente de lipase dans l'hydrolyse de l'huile a fourni jusqu'à 63 % d'hydrolyse après 24 h. Cette étude a montré qu'il est possible de produire de la lipase en utilisant des sous-produits de la région amazonienne combinés à de la farine de soja et de l'appliquer à l'hydrolyse d'huile de poisson pour produire davantage d'acides gras polyinsaturés dans un processus approprié.

Contributions d'auteur:Conceptualisation, BDR, ACL et MAZC ; Méthodologie, ASSC, JCSS, FVdN, CECdS, BDR, ACL et MAZC ; Analyse formelle, ASSC, JCSS et FVdN ; Enquête, ASSC, JCSS et FVdN ; Ressources, ASSC, JCSS et FVdN ; Conservation des données, ASSC, JCSS et FVdN ; Rédaction—préparation de l'ébauche originale, ASSC, JCSS, FVdN et CECdS ; Rédaction—révision et révision, BDR, CECdS, ACL et MAZC ; Supervision, BDR, CECdSACL et MAZC ; Administration de projets, BDR, ACL et MAZC ; Acquisition de financement, BDR, ACL et MAZC Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Remerciements: Les auteurs reconnaissent la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior—Brasil (CAPES—Finance Code 001); le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq); et la Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).

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