L'inhibiteur de la kinase LRRK2 rajeunit la sénescence cellulaire induite par le stress oxydatif dans les cellules neuronales Partie 1

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Arrière plan.La kinase répétée riche en leucine 2 (LRRK2) joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson (MP). Le vieillissement est le facteur de risque le plus critique pour la progression de la MP. La corrélation entre le vieillissement et la sénescence cellulaire a été établie. La sénescence cellulaire est corrélée à la dérégulation de la voie protéolytique et au dysfonctionnement mitochondrial, qui sont également associés à l'agrégation de la -synucléine ( -syn).Méthodes. Des cellules humaines de type neurone dopaminergique (cellules SH-SY5Y différenciées) ont été traitées avec de la roténone en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de la kinase LRRK2 GSK2578215A (GSK-KI) pendant 48 h. Les marqueurs de la sénescence cellulaire, y compris p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galactosidase( -gal), la phosphorylation de Rb, l'activité associée à la sénescence (SA) -gal, etlysosomalactivité, ont été examinés. Les cellules du tableau de bord et les neurones corticaux primaires de rat ont été traités avec des fibrilles -syn 30 min avant le traitement avec de la roténone en présence ou en l'absence de GSK-KI pendant 48 h. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de roténone et de MLi-2 (inhibiteur de la kinase LRRK2) une fois tous les deux jours pendant deux semaines. Résultats. La roténone a régulé à la hausse la phosphorylation de LRRK2 et les niveaux -gal par l'activation de l'axe de signalisation p53-p21 et la phosphorylation de Rb régulée à la baisse. De plus, la roténone a régulé à la hausse l'activité SA -gal, les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène et LRRK2phosphorylationet inhibe l'activité des lysosomes. La régulation à la hausse de LRRK2 induite par la roténone a altéré la clairance des fibrilles a-syn. Le traitement avec l'inhibiteur de LRRK2 a atténué la sénescence cellulaire induite par la roténone et l'accumulation de -syn. Conclusions. La régulation à la hausse induite par la roténone de l'activité de la kinase LRRK2 a favorisé la sénescence cellulaire, ce qui a amélioré l'accumulation de -syn. Cependant, l'administration d'un inhibiteur de la kinase LRRK2 a rajeuni la sénescence cellulaire induite par la roténone.

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1. Introduction

La maladie de Parkinson (MP), qui est la maladie neurodégénérative la plus courante, se caractérise par une altération du contrôle moteur [1]. Plusieurs facteurs génétiques et environnementaux contribuent à la pathogenèse de la MP[2-5].LRRK2, un facteur de risque génétique majeur pour la MP, présente à la fois des activités GTPase et kinase [6]. Le mutant LRRK2 G2019S, qui présente une activité kinase accrue, favorise la progression de la MP [7]. Le risque de développer la MP chez les patients porteurs du mutant G2019S augmente avec l'âge [8] car le vieillissement est associé à la progression des maladies neurodégénératives [9]. Auparavant, nous avions rapporté que l'activité de la kinase LRRK2 favorisait la sénescence cellulaire et inhibait la dégradation des agrégats d'alpha-synucléine (-syn) [10]. -Syn est un composant majeur des corps de Lewy (LB) ou des neurites de Lewy, qui sont les marqueurs post-mortem de la MP. Une dégradation altérée de -syn entraîne son agrégation [11].

La sénescence cellulaire altère la machinerie de dégradation des protéines[12-14]. L'exposition à la roténone à faible dose, qui est signalée comme induisant la MP, favorise la sénescence cellulaire dans la lignée cellulaire du trabéculum humain [15]. De plus, la roténone régule à la hausse l'activité de la kinase LRRK2 dans les neurones [16]. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que la roténone favorise la sénescence cellulaire par l'activation de la kinase LRRK2 et améliore par conséquent l'agrégation -syn.

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2. Méthodes et matériel

2.1. Culture cellulaire et traitement.

La lignée cellulaire de neuroblastome humain (cellules SH-SY5Y) a été cultivée dans un milieu de croissance (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ;10-013-CV ; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) additionné de 1{{ 48}} % de sérum bovin fœtal (FBS, 35-010-CV, Corning cellgro), 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific) et 1 % de réactif d'élimination des mycoplasmes (KOMA)) à 37 degrés dans un incubateur à 5 % de CO (Thermo Fisher Scientific). Les cellules SH-SY5Y différenciées (cellules dSH) ont été obtenues après traitement avec 10 μM d'acide rétinoïque tout-trans （R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)préparé dans un milieu de croissance une fois tous les deux jours pendant sept jours. Au jour 7 après le traitement à l'acide rétinoïde, les cellules ont été cotraitées avec de la roténone (1 uM) et GSK2572815A (GSK-KI ; Inhibiteur de la kinase LRRK2 ; 1 μM) préparé dans un milieu de croissance pendant 48 h. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été utilisé comme véhicule pour la roténone et le GSK-KI. Les fibrilles -syn ont été purifiées comme décrit précédemment [10]. Les cellules traitées à la roténone et au GSK-KI ont été traitées avec des fibrilles a-syn (70 nM). Les neurones corticaux primaires de rat ont été traités avec de la roténone (1 μM), du GSK-KI (1 μM) et de la fibrille a-syn (70 nM) pendant 48 h. Les conditions de traitement pour les neurones corticaux primaires de rat étaient identiques à celles employées pour le dSH. Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS) et lysées dans un tampon d'échantillon 1x (Tris-HCl 50 mM (pH 6,8), dodécylsulfate de sodium à 2%, glycérol à 10%, mercaptoéthanol à 1% et 0,02 pourcentage de bleu de bromophénol).

2.2.Isolation et culture de neurones corticaux primaires à partir d'embryons de rat E16.

Des rats gravides ont été euthanasiés avec du CO, gaz. L'utérus a été disséqué et les fœtus des sacs embryonnaires ont été placés dans du HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific) glacé. Le crâne a été pelé à l'aide de forceps et les cortex ont été disséqués de l'ensemble du cerveau. Après le retrait des méninges, les cortex ont été incubés avec 0.25 % Trypsine-EDTA(25200-056, Gibco, Thermo Fisher Scientific) à 37 °C pendant 20min dans un bain d'eau. Ensuite, les cortex ont été incubés avec 40 ug/mL de DNase I (DN25, Sigma-Aldrich), vortexés doucement et incubés pendant 5 minutes dans un bain-marie à 37 degrés. La majeure partie du surnageant a été éliminée par aspiration et les échantillons ont été incubés avec un MEM contenant un inhibiteur de sérum (11090-08, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,5 % de DMEM, 5 % de FBS, 2,5 mg/mL d'albumine de sérum bovin (BSA ; A7906, Sigma-Aldrich) et 2,5 mg/mL d'inhibiteur de trypsine (T9253, Sigma-Aldrich). L'inhibiteur de sérum a été éliminé et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 10 fois son volume avec le milieu de croissance. La composition du milieu de croissance était la suivante : milieu neurobasal (21103-049, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific), 2 % de B-27 (17504044, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific) et 1x GlutaMAX{ {34}}(35050-061, Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific). Les cellules de neurones corticaux primaires de rat isolées (3 × 10 degrés / puits) ont été ensemencées dans une plaque à puits 12- (SPL30012, SPL Life Sciences, Pochoen, Corée du Sud) et cultivées dans le milieu de croissance à 37 degrés dans un 5 pourcentage de CO, incuba-tor pendant 24h. Le milieu de culture a été remplacé par un milieu de croissance additionné de 0,2 mg/mL de 5-fluoro-2'-désoxyuridine (F0503, Sigma-Aldrich) et de 96 ug/mL d'uridine (U3750, Sigma-Aldrich) pour inhiber la mitose. Au jour 6, les cellules ont été traitées avec 1 uM de roténone, 1 uM de GSK-KI et 70 nM de fibrilles syn pendant 48 h et récoltées avec 1 x tampon d'échantillon.

2.3. Western Blot.

Western blot a été réalisé comme décrit précédemment [17]. Les anticorps suivants ont été utilisés pour le western blot : lapin anti-LRRK2 phospho-S935 monoclonal (ab133450, Abcam, Cambridge, UK), lapin anti-LRRK2 phospho-S1292 monoclonal (ab203181, Abcam), souris anti-LRRK2 monoclonal ( N241A/34, Neu-roMab,UC Davis, CA, USA), monoclonal anti-p53 de souris (pour p53 humain :sc-126 ; pour p53 de souris:sc-393031 ;Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), souris anti-p21wafi/-Ccip1(p21) monoclonal(CM5131, ECM Biosciences,Ver-sailles, KY, USA), souris anti-Rb monoclonal(#9309S, Cell Signaling Technology(CST), Danvers,MA , USA), anti-phosphoRb(Ser807/811)(#9308S, CST),souris anti- -galactosidase monoclonale (sc-377257,Santa Cruz Biotech-nology),souris anti-p62 monoclonale(ab56416 ,Abcam), souris anti- -actine monoclonale(sc-47778 ; Santa Cruz Bio-technology), lapin anti-LC3B polyclonale(#2775S ; CST), souris anti- -syn (clone 42) monoclonal (610786 ; BD Bio-sciences, San Jose, Californie, États-Unis),anti-phospho-thréonine-argi-nine(#2351S, CST), anti-p53(SC-99, Santa Cruz Biotechnology),anti-LaminB(SC-6216,Santa Cruz Biotech-nology), AffiniPure conjugué à la peroxydase de chèvre IgG anti-souris (H plus L)(#115-035-003;Jackson Immunoresearch Labo-ratories Inc., West Grove, PA, USA) et chèvreconjugué à la peroxydaseAnticorps AffiniPure anti-lapin IgG(H plus L)(#1l1-035-144 ; Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.). Les signaux immunoréactifs dans la membrane de nitrocellulose ont été développés avec Luminata Crescendo Western HRP (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA), et les images ont été capturées avec une caméra MicroChemi4.2 (Shimadzu, Kyoto, Japon).

2.4.Test de ligature de proximité (PLA) et immunofluorescence (IF).

Le PLA a été réalisé à l'aide de Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn in Situ PLA4Probe Anti-Mouse MINUS anticorps (DUO92002-100RXN, Sigma-Aldrich) , et Anti-Rabbit Plus anticorps (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), en suivant les instructions du fabricant. Les cellules SH-SY5Y ensemencées dans des plaques 96- bien noires (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Autriche) ont été différenciées et les cellules différenciées ont été traitées avec de la roténone et du GSK-KI au jour 7. Les cellules ont été rincés deux fois avec du PBS (DPBS) de Dulbecco glacé, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min à température ambiante (TA) et rincés trois fois avec du DPBS glacé. Ensuite, les cellules ont été perméabilisées à l'aide de 0,1 % de Triton X-100 préparé dans du DPBS. Après trois lavages avec du DPBS froid, les cellules ont été incubées avec une goutte de solution de blocage à 37 °C pendant 1 h. La solution de blocage a été retirée et les cellules ont été incubées avec des anticorps (50 μL) à 37 degrés pendant 3 h. Le mélange d'anticorps était composé d'un diluant d'anticorps du kit (anticorps utilisés pour le PLA : anticorps monoclonal anti-LRRK2 de souris (1:20) et anticorps monoclonal anti-LRRK2 phospho-S1292 de lapin (1:20) ; anticorps utilisé pour le test IF : anticorps polyclonal anti- -gal de poulet (1:400, ab9361, Abcam)). Dans le test IF, l'anticorps a été ajouté tout au long du processus jusqu'à l'étape d'application du PLA. Les échantillons ont ensuite été lavés deux fois avec du tampon de lavage A 1x pendant 5 minutes. Pour le test IF, l'anticorps anti- -gal a également été ajouté (1:400) au mélange. Les cellules ont été incubées avec 50μL de la solution de sonde à 37C pendant 1h. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec 1 x tampon de lavage A pendant 5 minutes. Pour le test IF, la ligase (40 : 1) et l'anticorps anti- - gal (400 : 1) ont été mélangés dans le tampon de ligature. Les cellules ont été incubées avec la solution de ligature (50 μL) à 37 degrés pendant 30 min et lavées deux fois avec 1 x tampon de lavage A pendant 5 min. Pour le test IF,polymérase(1:40) a été incubé avec de l'IgY H anti-poulet de chèvre plus L(Alexa Fluor② 594 ; ab150172)anticorps secondaire (1:500) pendant 100 min à 37 °C. Les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon de lavage B 1x pendant 10 min, puis lavées avec du tampon de lavage B 0,01x pendant 1 min. Pour colorer le noyau, les cellules ont été incubées avec Hoechst 33342 (1: 1000; 62249, Thermo Fisher Scientific) préparé dans du DPBS à température ambiante pendant 10 minutes. Les images des cellules dans les plaques noires à puits 96- ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Allemagne).

2.5.Immunoprécipitation.

Les lysats de cellules entières de cellules dSH traitées avec de la roténone （1 μM） et GSK-KI （1 uM） ont été préparés à l'aide d'une solution de lyse (PBS, 1% de Triton X -100, 1x cocktail d'inhibiteurs de protéase et lx phosphatase cocktail inhibiteur). Les lysats ont été centrifugés à 4,000g et 4 degrés pendant 5min, et le surnageant a été incubé avec l'anticorps anti-p53(554293, BD Biosciences) et PierceProtein G Aga-rose(20398, Thermo Fisher Scientific) remis en suspension dans la solution de lyse pendant 12h. Les billes ont été lavées deux fois avec la solution de lyse, et le complexe bille-protéine a été dénaturé avec 1 x tampon d'échantillon.

2.6. Fractionnement nucléaire.

La fraction nucléaire a été isolée à l'aide des réactifs d'extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PERr (78833, Thermo Fisher Scientific), en suivant les instructions du fabricant.

2.7. Préparation d'ARNm et réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR).

L'ARNm a été isolé à partir de cellules dSH traitées à la roténone / GSK-KI à l'aide du kit RNeasy Plus Mini (74134, QIAGEN, Hilden, Allemagne). Ensuite, l'ARNm a été transcrit en ADN complémentaire (ADNc) à l'aide du kit de synthèse d'ADNc TOPscript (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, République de Corée). ROX, UDG plus (RT500M, Enzynomics). Les amorces suivantes ont été utilisées pour la qRT-PCR : p21,5'-ATG humaine AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(avant)) et 5'-CCC TAG GCT GTG CTC ACT TC-3'(inverse) ; humain p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(avant) et 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(inverse). La qRT-PCR a été réalisée sur le cycleur Mic qPCR (MIC-4, BioMolecular Systems, Upper Coomera, Australie).

2.8. Mesure de l'activité de la galactosidase (-Gal) associée à la sénescence (SA), des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'activité des lysosomes.

30 minutes après le traitement, les cellules dSH vivantes ont été colorées avec 2 μM de GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japon), 5 uM de diacétate de 2', 7'-dichlorofluorescéine (DCFDA; 287810, Calbio-chem, San Diego, CA, USA）, 2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et 1 μM Hoechst 33342 pour examiner l'activité SA-gal, les ROS, les lysosomes actifs et le noyau, respectivement. Les cellules colorées ont été monté avec ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) et imagé à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. Des images de contraste d'interférence différentielle ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser. 2.9.SA -Gal Activity Assay. L'activité SA -gal a été examinée à l'aide d'un { {21}}well cellular senescence assay kit (CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), en suivant les instructions du fabricant.

2.10.Manipulation de souris et administration de médicaments.

Les souris ont été manipulées comme décrit précédemment [18] conformément aux directives du comité d'éthique animale de Dankook (Dankook IACUC,18-026). Des souris mâles C57BL/6] âgées de 16 semaines ont reçu une injection intrapéritonéale de roténone (0 0,75 mg/kg de poids corporel) et MLi-2 (un inhibiteur de la kinase LRRK2 ; 1 mg/kg de poids corporel) une fois tous les deux jours pendant deux semaines.

2.11.Test Rotarod et préparation des tissus cérébraux.

Au jour 14 post-traitement, les souris ont été placées sur une tige rotative en forme de cylindre. Le temps nécessaire pour tomber au sol a été enregistré. Les détails du test rotarod sont décrits ailleurs [18]. Ensuite, les souris ont été euthanasiées et perfusées par voie transcardiaque avec du HBSS glacé contenant du Ca2 et du Mg. Le mésencéphale a été disséqué avec des micro-ciseaux et des pincettes. Les tissus ont été lysés dans du PBS contenant 1 % de Triton X -100, 1xXpert Protease Inhibitor Cocktail Solution (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA) et lx Xpert Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (P3200, GenDEPOT). Les échantillons ont été homogénéisés à l'aide d'un moteur sans fil Pellet Pestle (Sigma-Aldrich). Le surnageant a été soumis à un transfert Western, à un test d'activité SA-gal et à un test immuno-enzymatique (ELISA).

2.12.ELISA pour Oligomère -Syn.

Auparavant, nous avions établi un ELISA sandwich pour l'analyse des oligomères fibrillaires -syn en utilisant un anticorps reconnaissant la conformation filamenteuse des agrégats -syn [17]. Les lysats bruts du mésencéphale ont été soumis à ELISA et les agrégats -syn ont été quantifiés à l'aide de normes de fibrilles -syn.

2.13. Analyses d'images et de données.

Les intensités de PLA et de coloration des cellules vivantes ont été mesurées à l'aide de Zen 2012 (Carl Zeiss). La densitométrie des protéines cibles a été réalisée à l'aide de

Figure 1 : L'activation de la kinase LRRK2 induite par la roténone favorise la sénescence cellulaire dans la lignée cellulaire différenciée du neuroblastome humain. Analyse Western blot de cellules dSH traitées avec 1 uM de roténone ou 1 uM de GSK2578215A (GSK-K), un inhibiteur de la kinase LRRK2, pendant 48 h en utilisant des anticorps contre les protéines cibles (a). Les densités des protéines ont été normalisées à celles de -actine (bg).n =3.(h) Les cellules dSH traitées avec 1 uM de roténone ou 1 uM de GSK-KI pendant 48 h ont été soumises à un test de ligature de proximité (PLA) de phospho-S1292 LRRK2 et IRRK2 total (PIA-pS1292) et analyse par immunofluorescence (TF) de la -galactosidase, les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33342. Les contrôles utilisés dans la coloration PLA et IF ont révélé la validité des résultats (deux panneaux de droite). Les intensités de PLA-pS1292(i) et -galactosidase (j) ont été normalisées à celles de 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4 ; nombre de cellules= 12-17.

Multi Gauge (Fujilm, Tokyo, Japon). Tous les ensembles de données ont été analysés et représentés graphiquement à l'aide de Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Les données des expériences réalisées à l'aide de cellules dSH et de neurones corticaux primaires de rat ont été analysées à l'aide d'une analyse bidirectionnelle de variance (ANOVA), suivi du test post hoc de Bonferroni (n=3). Entre-temps,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3). Toutes les données sont représentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. *p<><><><0.0001,and n.s.="not">

FIGURE 2 : L'inhibiteur de kinase LRRK inhibe l'activation de p53 dans la lignée cellulaire différenciée de neuroblastome humain. (a) Des lysats de cellules entières (20 %), qui ont été utilisés comme entrée d'immunoprécipitation (IP), et une fraction nucléaire ont été collectés. L'analyse a révélé que 20 % d'entrée présentaient des résultats similaires à ceux observés sur la figure 1. (b, c) Les échantillons IP ont été dénaturés et soumis à un transfert Western. Les niveaux de phosphorylation du site TXR dans p53 ont été normalisés aux niveaux totaux de p53. n=3.(de)Les niveaux totaux de p53 dans le noyau ont été examinés à l'aide d'un transfert Western. LaminB a été utilisé pour la normalisation des niveaux de p53 nucléaire. n=3.(f) Les niveaux d'ARNm de p21 et pl6 dans le groupe de traitement ont été normalisés par rapport à ceux du groupe traité avec le véhicule (diméthylsulfoxyde),n =3.

Cet article est extrait de Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, Article ID 9969842, 16 pages https://doi.org/10.1155/2021/9969842