La méta‑analyse des résultats de la quantification du NAD(P)(H) montre une variabilité entre les tissus de mammifères Ⅱ

L'effet de la collecte de tissus pré-mortem versus post-mortem sur les niveaux de NAD(P)(H).

Nous avons prédit qu'il pourrait y avoir une différence observable dans l'état redox du NAD(P)(H) qui dépend des procédures de prélèvement de tissus. Pour répondre à cette question, nous avons examiné l'effet des procédures de collecte de tissus pré- et post-mortem sur le statut redox du NAD(P)(H). Pour cette analyse, nous avons comparé les valeurs des tissus de foie de rat étant donné le plus grand nombre d'études définissant leur protocole de sacrifice. Lorsqu'elles ont été divulguées, toutes les études examinées ont indiqué que les échantillons de tissus étaient conservés au froid et immédiatement extraits sur de la glace ou congelés à - 80 degrés avant les mesures de NAD(P)(H). Cette analyse a déterminé qu'il n'y avait pas de différence significative dans les concentrations de NAD plus dans le foie de rat (Fig. 6a) entre les tissus extraits avant ou après l'euthanasie. Cependant, les niveaux de NADH rapportés dans le foie de rat sont significativement plus élevés dans les échantillons post-mortem (Fig. 6b). Aucune différence dans les niveaux totaux de NAD (H) (Fig. 6c) n'a été observée, mais le rapport NAD plus / NADH était plus faible dans les tissus prélevés après l'euthanasie (Fig. 6d), ce qui est cohérent avec la variation observée dans les niveaux de NADH. Le NADP plus, le NADPH et les résultats du rapport NADP plus / NADPH dans le foie de rat regroupés par moment de la récolte de tissu sont présentés dans la Fig. 9 supplémentaire; cependant, le nombre insuffisant d'échantillons post-mortem ne nous permet pas d'interpréter l'effet du moment de la récolte des tissus sur les niveaux de NADP(H). Dans le foie de souris, il n'y avait aucune différence entre les niveaux de NAD plus pré-mortem et post-mortem, cependant, le nombre d'études rapportées était limité (Fig. 6e). NonNADH,PNDA plus, ouNADPHdonnées post-mortem dansfoie de sourisétait disponible pour comparaison.

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Discussion

De nombreuses études récentes ont démontré que la régulation du NAD(P)(H) est essentielle pour l'homéostasie cellulaire et le statut redox. Les données obtenues à partir de rongeurs ont conduit à des études examinant les niveaux de NAD plus dans le sang humain, en tant qu'indicateur moins invasif des niveaux de NAD plus dans le corps entier. Des études cliniques récentes ont démontré que les niveaux de NAD plus étaient réduits dans les états pathologiques23,47 et élevés après les stratégies de rappel NAD plus23,44,48,49. Nous avons effectué une méta-analyse de toutes les études publiées entre 1946 et le 20 juin 2021, qui contenaient des données quantitatives sur les niveaux de NAD(P)(H) chez les espèces de mammifères avec un accent particulier sur les souris, les rats et les humains car ils représentent le plus espèces étudiées dans le domaine biomédical. Cette analyse a été effectuée en partie pour déterminer le niveau standard moyen des concentrations de NAD(P)(H) dans les tissus de mammifères normaux compte tenu de la variance bien connue de ces mesures d'une étude à l'autre. Nous espérons que ces données pourront être utilisées pour stimuler des protocoles standardisés dans le domaine de la recherche sur le NAD plus et pour promouvoir l'utilisation des niveaux de NAD(P)(H) et des rapports redox comme biomarqueurs fiables pour les maladies et les schémas thérapeutiques.

Malgré une variabilité considérable des mesures dans les tissus des rongeurs, cette méta-analyse a montré des niveaux moyens similaires de NAD plus dans les tissus, à quelques exceptions près. Fait intéressant, le muscle squelettique de souris présentait des niveaux médians de NAD plus inférieurs (Fig. 2a) à ceux d'autres tissus hautement métaboliques (c'est-à-dire le foie, les reins, le cœur et le cerveau). Cela peut indiquer différents statuts redox NAD (H) dans le muscle squelettique ou peut indiquer des problèmes plus importants avec l'extraction des métabolites dans les tissus fibreux. Cependant, ces observations n'ont pas pu être vérifiées chez l'homme en raison d'un manque de tissus échantillonnés au-delà du sang et des muscles.

De nombreux facteurs potentiels pourraient affecter la précision des mesures physiologiques du NAD(P)(H) dans les échantillons de tissus. Lorsqu'elles sont rapportées, toutes les études décrivent les tissus comme étant récoltés et directement immergés dans de l'azote liquide, ou conservés sur de la glace avant congélation ou traitement afin de préserver les fractions thermosensibles (NAD plus et NADP plus). L'effet du pH sur les différentes fractions de NAD(P)(H), comme la nature acido-labile des formes réduites de NAD(P)H, a conduit à l'utilisation de solvants d'extraction à pH neutre dans la majorité des études. . Cependant, étant donné l'interconversion rapide des métabolites réduits et oxydés et l'effet de l'anoxie sur le NAD(H)50–53, il est également important d'assurer une extraction rapide des métabolites tissulaires et les procédures appropriées pour l'extinction cellulaire du NAD(P)(H )-enzymes redox/de consommation, par exemple par déprotéinisation. Dans ce sens, notre analyse de la collecte de tissus pré- et post-mortem indique que l'analyse post-mortem favorise la réduction de NAD plus. La réduction du tissu NAD plus a déjà été décrite in vivo dans le cerveau, le cœur et le foie de rats exposés à une atmosphère hypoxique prolongée de 2,5-h54, un environnement qui peut être partiellement récapitulé par de longues périodes de post- sacrifiez la collection de tissus avant la congélation instantanée. Cela peut indiquer que l'extraction de tissus sous anesthésie ou en donnant la priorité à la récolte immédiate de tissus destinés à être utilisés pour l'analyse des métabolites après le sacrifice, devrait se produire pour obtenir des mesures représentatives de NAD(P)(H).

Il existe également la possibilité que diverses méthodes de quantification, chacune ayant des limites différentes, contribuent à la variabilité intra-étude globale des mesures de NAD(P)(H). Au cours des deux dernières décennies, les méthodes les plus fréquemment utilisées étaient les tests de cycle enzymatique, LC-MS et HPLC. Chacune de ces méthodes est affectée par les techniques d'extraction des métabolites, les paramètres de quantification et la mise en œuvre de contrôles de qualité appropriés. En utilisant LC-MS, Lu et al. ont montré que l'interconversion entre les formes réduites et oxydées des métabolites NAD(P)(H) se produit à des vitesses différentes dans divers tampons d'extraction ou solvants avec le mélange acétonitrile : méthanol : eau avec 0.1 M d'acide formique donnant le récupération la plus élevée avec le moins d'interconversions31. Cependant, lors de l'utilisation de LC-MS, cette interconversion peut être surveillée entre des échantillons individuels d'une étude en dopant avec des contrôles internes tels que les isotopes NAD (P) (H), ce qui est un avantage de la technique LC-MS par rapport à celle de la HPLC et de l'enzyme. essais de cycle31,33,55. Néanmoins, même avec des techniques LC-MS bien contrôlées, divers facteurs peuvent interférer avec le signal mesuré, notamment les effets de matrice et les variations de l'efficacité d'ionisation. Par exemple, certaines études utilisent des extraits de levure marqués au 13C comme étalons internes dans la métabolomique basée sur LC-MS. Cependant, l'enrichissement de la matrice de métabolites de l'échantillon extrait avec une matrice de métabolites d'extrait de levure marquée au 13C peut avoir diverses conséquences, telles que la suppression d'ions, ce qui réduit le signal des métabolites marqués et/ou non marqués, et peut entraîner des erreurs dans la quantification absolue sinon détecté par une évaluation approfondie de la qualité56. De plus, bien que les techniques LC-MS permettent théoriquement la mesure de plusieurs métabolites NAD(P)(H) dans une seule expérience, il existe encore des limites puisque des dilutions optimales doivent être exécutées si les métabolites d'intérêt ont de grandes différences de concentrations. Ainsi, malgré leurs avantages par rapport aux tests de cycle enzymatique plus simples, la complexité des méthodes LC-MS impose la nécessité d'une optimisation approfondie. Récemment, de nouvelles méthodes analytiques, telles que le NAD plus les biocapteurs et la spectrométrie de masse basée sur l'imagerie, ont été développées, mais les données quantitatives générées par ces techniques sont encore insuffisantes pour être incluses dans une méta-analyse. Cependant, une étude incluse dans notre méta-analyse a utilisé un biocapteur bioluminescent à base de papier pour mesurer les niveaux de NAD plus dans le foie de souris et d'autres types d'échantillons57. Cette étude a été incluse dans le groupe des tests bioluminescents en raison de la méthode de détection similaire (Fig. 1a).

Méthodes

Extraction de données.

Les données numériques pour les métabolites NAD(P)(H) ont été soit obtenues directement à partir des articles, soit extraites des chiffres des articles à l'aide d'un logiciel d'extraction de données semi-automatique (WebPlotDigitizer58). De plus, le cas échéant, les points de temps d'échantillonnage des tissus par rapport aux méthodes de prélèvement de sacrifice et/ou de tissus/sang (c'est-à-dire la méthode d'anesthésie et/ou d'euthanasie, la manipulation des tissus et la température de stockage) ont été enregistrés. Pour les modèles animaux, les espèces, les caractéristiques (par exemple, la souche, le génotype, l'âge et le poids) et les conditions environnementales (par exemple, le cycle de sommeil, le type de régime, la fréquence d'alimentation et l'état d'alimentation par rapport à l'échantillonnage des tissus) ont été enregistrées. De plus, pour toutes les études, les traitements (par exemple, les traitements pharmacologiques, les chirurgies, l'irradiation, l'induction de tumeurs et d'autres procédures appliquées aux sujets de l'étude) et toutes les informations sur les groupes d'étude (par exemple, les groupes de traitement ou de maladie et les témoins correspondants) ont été extraits. Enfin, la méthode de quantification du NAD(P)(H) (par exemple, dosages enzymatiques, basée sur la spectrométrie de masse, HPLC, RMN, bioluminescence) et les spécificités de la publication (par exemple, titre de la publication, code de référence [DOI, Medline UI, PMID] ou lien hypertexte et année de publication) ont été notées (Matériel supplémentaire 2).

L'analyse des données. Avant l'analyse, toutes les concentrations ont été converties en nmol/g de tissu ou en nmol/g de protéines pour les échantillons de tissu ou en nmol/ml pour les fractions sanguines. En raison du faible nombre de résultats normalisés en fonction de la teneur en protéines, nous ne montrons que les résultats normalisés en fonction du poids des tissus et du volume sanguin. L'analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism version 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Californie, États-Unis,Disponibilité des donnéesToutes les données extraites et analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses complémentsfichiers d'information.Reçu : 29 avril 2022 ; Accepté : 7 février 2023

Les références

10. Amour, NR et al. La NAD kinase contrôle la biosynthèse du NADP animal et est modulée par des mécanismes dépendant de la calmoduline divergents au cours de l'évolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386-1391 (2015).

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