Étude sur les enzymes microbiennes produites lors de la fermentation bactérienne combinée et leurs activités biologiques ⅲ
Oct 28, 2024
Chapitre 3 Étude sur l'activité antioxydante des enzymes
Il a été prouvé que de nombreuses maladies humaines sont liées àoxygène actif et radicaux libres, tel queinflammation, artériosclérose,vieillissement, diabète, cancer, etc.Radicaux libres excessifsDans le corps peut provoquer une dénaturation des protéines, des dommages cellulaires et la mort, et même des changements pathologiques dans le corps. Par conséquent, de nombreuses études au pays et à l'étranger recherchent des aliments riches en ingrédients antioxydants naturels pour prévenir et réguler les maladies causées par les radicaux libres par le biais de l'alimentation. Aujourd'hui, avec l'augmentation du niveau de vie, les gens se concentrent progressivement vers leur propre corps, donc de plus en plus de produits de santé émergent dans un flux sans fin. Cependant, il n'est pas facile d'être vraiment utile. Les enzymes sont une sorte de nourriture qui peut être faite par vous-même dans la vie des gens. Le coût n'est pas très élevé et il y a de nombreux avantages.
Les enzymes microbiennes ont une variété de fonctions de santé telles que l'antibactérien et l'anti-inflammatoire, favorisant le métabolisme, améliorant l'immunité, le blanchiment et l'anti-âge, la détoxification et l'anti-canancer. À l'heure actuelle, il y a relativement peu d'études sur les propriétés antioxydantes des enzymes microbiennes au pays et à l'étranger, nous prévoyons donc de mener des recherches approfondies à leur sujet. Cet article prend l'enzyme de pomme comme objet de recherche et utilise la teneur totale au phénol, réduisant la puissance, DPPH · Radical libre, · Radical libre, radical libre, radical libre superoxyde et Abts la capacité de piégeage des radicaux libres comme indice de détermination à mener une étude complète et systématique de l'enzyme de pomme après la fermentation pendant 3 mois. La composition et la teneur en ingrédients actifs antioxydants ont été étudiés et son activité antioxydante a été comprise.
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3.1 Matériaux et méthodes
3.1.1 Matériaux
(1) Matériaux expérimentaux
Laver les pommes fraîches avec de l'eau stérile dans des conditions stériles, les sécher naturellement dans une table de fonctionnement stérile, les épluchez et les trancher pour une utilisation ultérieure. Ajouter le sucre blanc et les pommes dans un bocal en verre stérilisé à un rapport de masse de 1: 1. Activez les bactéries nécessaires pour l'expérience et inoculez-les dans l'enzyme en fonction du schéma optimal (cette étape de fonctionnement est omise dans le groupe témoin), sceller et la placer dans un endroit frais et sec. Après 3 mois de fermentation à température ambiante, prélevez un échantillon pour obtenir l'ensemble du liquide enzymatique contenant la pulpe et filtrez-le. Prenez le surnageant comme échantillon expérimental et centrifugez l'échantillon à 10000 tr / min pendant 15 minutes dans une centrifugeuse à grande vitesse avant de déterminer les données pertinentes. Il convient de noter que dans le processus de fabrication des enzymes, afin d'éviter une contamination inutile, toutes nos opérations sont effectuées dans des conditions stériles.
(2) Instruments principaux
Spectrophotomètre: v -1100, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory;
Bath d'eau à température constante: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. D'autres instruments sont les mêmes que 2.1.3.
3.1.2 Méthodes
(1) Détermination de la teneur totale au phénol [53]
① Préparation de la courbe standard:
Peser avec précision {{0}}. 123 g d'acide gallique, le dissoudre dans une petite quantité d'eau distillée et le transférer dans un flacon volumétrique de 5 0 0 ml pour compenser le volume. Take 8 clean 1{{10}} mL volumetric flasks, add 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, and 1.4 mL of gallic acid standard solution, respectively, dilute to the mark with distilled water, add 1 mL of Folin reagent and 2 mL of 20% NaCO3 to each, heat in a boiling water bath for 1 min, refroidir et diluer à 20 ml, et placer à température ambiante pendant 30 min. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l'absorbance A à une longueur d'onde de 650 nm, et dessinez une courbe standard avec l'absorbance A comme axe horizontal et la concentration d'échantillon comme axe vertical. ② Détection
Ajouter de l'eau distillée à 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl et 500 μl de solutions d'échantillonnage à 46 ml, puis ajouter 1 ml de réactif de folin-phénol, se mélanger uniformément, réagir pour 3 minutes, puis ajouter 3 ml de NACO3 à 20%, secouer dans un bain d'eau constant de 25 degrés pour une longueur d'eau distillée avec un contrôle distillé et une mesure de son absorption A spectrophotomètre. La teneur totale au phénol est exprimée en équivalents d'acide gallique, et la teneur totale au phénol est calculée en fonction de l'équation de courbe standard.
(2) test de réduction [54]
Ajouter 1 0 0 μl, 2 0 0 μl, 300 μl, 400μl et 500 μl d'échantillon à 2,5 ml de tampon de phosphate avec une concentration de 0,2 mol / L et une valeur de pH de 6,6, puis de 2,5 ml de ferricyan (w / V) avec une masse et une concentration en potassium (W / V) avec une concentration de masse et une réact de potassium (W / V) avec une concentration de masse et de réact de potassium (W / V) avec une concentration de masse, et de réacturation du ferricyan (W / V) avec une masse et une concentration en potassium (W / V) avec une concentration de masse et une réact de potassium. à 50 degrés pendant 30 minutes. Ajoutez ensuite 2,5 ml d'acide trichloroacétique (p / v) avec une concentration en masse de 10% et une centrifugeuse à 3000 tr / min pendant 10 minutes dans une centrifugeuse à grande vitesse. Immédiatement après avoir retiré, prenez 2,5 ml de surnageant dans un ballon volumétrique, ajoutez 2,5 ml d'eau distillée et 0,5 ml de chlorure ferrique (p / v) avec une concentration en masse de 0,1%. Utilisez de l'eau distillée comme contrôle vide et mesurez l'absorbance A à une longueur d'onde de 700 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. La force de la réduction du pouvoir peut être jugée par la valeur d'absorbance. Plus la valeur d'absorbance est élevée, plus la puissance de réduction est forte.
(3) Détermination de l'effet de piégeage des radicaux libres anion en superoxyde [55]
Prenez 4,5 ml de 0. 0 5 mol / l pH 8.2 TRIS-HCL Buffer et préchauffer dans un bain d'eau de 25 degrés pour 2 0 min. Ajouter 1 ml de solution d'échantillon enzymatique avec des concentrations de 10%, 20%, 30%, 40% et 50% et 0,4 ml de solution de pyrogallol 25 mmol / L respectivement. Bien mélanger et réagir dans un bain d'eau de 25 degrés pendant 5 min. Ajouter 1,0 ml de 8 mol / L de HCl pour terminer la réaction. Utilisez le tampon Tris-HCl comme référence et utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l'absorbance A à une longueur d'onde de 299 nm pour calculer le taux de piégeage. Pour le groupe témoin vide, 1 ml de solvant a été utilisé à la place de l'échantillon. Le taux de piégeage O 2- a été calculé selon la formule 3.1: O 2- Taux de piégeage (%)=(A 1- A2) / A1 × 100 (3.1) Where: A1 est l'absorbance du tube vide; A2 est l'absorbance de l'échantillon.
(4) Détermination de l'effet de piégeage sur les radicaux hydroxyles [56]
100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 mmol / L, et chauffé dans un bain d'eau à température constante à 37 degrés pendant 1 h. Ajustez à zéro avec de l'eau distillée et mesurez l'absorbance A à une longueur d'onde de 562 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Effectuer 3 répétitions pour chaque traitement. Calculez le taux de piégeage des radicaux hydroxyle en fonction de la formule 3.2: taux de piégeage des radicaux hydroxyle (%)=[(A 1- A2) / a1] × 100 (3.2) où: A1 est l'absorbance moyenne du blanc; A2 est l'absorbance moyenne de la solution d'échantillon. (5) Détermination de l'effet de piégeage des radicaux libres DPPH [57]
Cistanche de nouvelles herbes avec beaucoup plus de pouvoir anti-oxydation que la fermentation des bactéries
Pipette avec précision 2 ml de solution d'échantillon enzymatique avec des concentrations de 1 0%, 20%, 30%, 40% et 50% dans une fiole volumétrique de 10 ml, puis ajouter 2 ml de solution aqueuse d'éthanol DPPH à 80% au flacon volumétrique. La concentration de masse molaire est de 2 × 10-4 mol / l. Après le mélange, laissez-le se tenir à température ambiante pendant 30 min. En utilisant une solution d'éthanol à 80% comme référence, mesurez l'absorbance de l'échantillon à une longueur d'onde de 517 nm, qui est enregistrée comme A1. Mélanger 2 ml de solution DPPH et 2 ml de solution d'éthanol avec une concentration en masse de 80% et mesurer leur absorbance à la même longueur d'onde, qui est enregistrée sous forme de A0. Mélanger 2 ml de solution enzymatique et 2 ml de solution d'éthanol avec une concentration en masse de 80% et mesurer leur absorbance à la même longueur d'onde, qui est enregistrée comme A2. Calculez le taux de piégeage des radicaux libres DPPH selon la formule 3.3:
Taux de piégeage des radicaux libres DPPH (%) {{0}} [1- (A 1- A2) / A 0] × 100 (3.3) Where: A1 est la solution de 2 ml de 2 ml; L'A2 est l'absorbance d'une solution mixte d'une solution enzymatique de 2 ml et de 2 ml d'éthanol à 80% par concentration en masse; A0 est l'absorbance d'une solution mixte de 2 ml de solution de DPPH et de 2 ml d'éthanol à 80% par concentration en masse.
(6) Abts Capacité de piégeage des radicaux libres [58]
Ajouter une certaine quantité de sulfate de potassium à 7 mmol / L ABTS jusqu'à ce que la concentration finale de la solution mixte soit de 2,45 mmol / L. Placer la solution mixte dans un endroit frais et sec à température ambiante pendant 12 à 16 heures. 1 μl, 3 μl, 5 μl, 7 μl et 9 μl de solution d'échantillon ont été complétés à 10 μl de tampon phosphate de 5 mmol / L pH7,4, puis mélangés uniformément avec 10 ml du sulfate de potassium ci-dessus et abtaient une solution mélangée, et permis de réagir à une température de réaction de 30 degrés et un temps de réaction de 5 minutes. Zéro avec de l'eau distillée et mesurez l'absorbance A à une longueur d'onde de 734 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Calculez le taux de piégeage des radicaux libres ABTS selon la formule 3.4:
ABTS RADIQUE DU RADIQUE FREE (%)=[(A 1- a2) / a1] × 100 (3.4) où: A1 est l'absorbance du groupe témoin vierge; A2 est l'absorbance du groupe expérimental
3.2 Résultats et analyse
3.2.1 Contenu du phénol total
(1) Courbe standard
La courbe standard de la teneur en phénol totale a été dessinée avec la concentration d'acide gallique comme l'axe horizontal et la valeur d'absorbance A comme axe vertical, comme le montre la figure 3.1.
Fig.3.1 La courbe standard du contenu du phénol total
De la Fig.3.1, nous pouvons voir que l'équation de courbe standard est y =11. 375x +0. 2593 (x est la concentration d'échantillon, y est l'absorbance), r 2=0. 9981.
(2) Détermination des échantillons
Les résultats de la détermination totale du contenu du phénol des enzymes Apple dans le groupe témoin et du groupe expérimental à différentes concentrations sont présentés sur la figure3.2.
Fig.3.2 La courbe du contenu phénolique total
Comme le montre la Fig.3.2, les enzymes Apple dans le groupe témoin et le groupe expérimental ont une teneur en phénolique totale élevée, et les deux augmentent avec l'augmentation de la quantité de solution d'échantillon ajoutée. Dans le même gradient de concentration, la teneur en phénolique totale de l'enzyme Apple dans le groupe témoin est passée de 0. 673 mg à 2,8 0 7mg, et la teneur en phénolique totale du groupe expérimental est passée de 0,961 mg à 4,185 mg. Le contenu phénolique total du groupe expérimental est beaucoup plus élevé que celui du groupe témoin, et la tendance à la hausse est plus évidente. Selon le contenu phénolique total, l'activité antioxydante globale du groupe expérimental est supérieure à celle du groupe témoin.
3.2.2 Réduction de la puissance
Les résultats de la réduction de la détermination de la puissance des enzymes de pomme dans le groupe témoin et le groupe expérimental à différentes concentrations sont illustrés à la figure 3.3.
Comme le montre la figure 3.3, la tendance changeante de la réduction de la puissance des enzymes Apple est similaire à la tendance changeante de la teneur totale au phénol. La puissance de réduction du groupe expérimental est plus élevée que celle du groupe témoin, et qu'il s'agisse du groupe expérimental ou du groupe témoin, dans la plage de concentration présentée dans l'expérience, la puissance réductrice montre une tendance croissante avec l'augmentation de la quantité de solution d'échantillon ajoutée. Les données expérimentales ont également confirmé qu'en termes de réduction de la puissance, l'activité antioxydante du groupe expérimental est supérieure à celle du groupe témoin.
3.2.3 Capacité de piégeage des radicaux libres d'anion superoxyde
Les résultats de la capacité de piégeage des radicaux libres d'anion superoxyde des enzymes de pomme dans le groupe témoin et le groupe expérimental à différentes concentrations sont illustrés à la figure 3.4.
Comme le montre la figure 3.4, il y a une grande différence dans la capacité de piégeage des radicaux libres d'anion superoxyde entre le groupe expérimental et le groupe témoin. Dans la plage de concentration présentée dans l'expérience, la capacité de piégeage des radicaux libres d'anion superoxyde du groupe expérimental change le plus significativement lorsque la concentration de l'échantillon est de 10% à 20%, et le changement n'est pas évident après la concentration supérieure à 20%; Lorsque la concentration est de 50%, la capacité de piégeage des radicaux libres d'anion superoxyde est aussi élevée que 85,4%. La capacité de piégeage des radicaux libres superoxyde montrée par le groupe témoin peut être clairement visible à partir du tableau des tendances. À mesure que la concentration enzymatique augmente, cette capacité de piégeage des radicaux libres augmente également, change lentement et tend progressivement vers un état stable. La capacité de récupération atteint un maximum de 42,6%. Le groupe expérimental est presque deux fois plus élevé que le groupe témoin.
3.2.4 Capacité de piégeage des radicaux libres hydroxyles
Les changements dans la capacité de piégeage des radicaux libres hydroxyle des enzymes de pomme dans le groupe témoin et le groupe expérimental à différentes concentrations sont présentés sur la figure 3.5.
Fig.3.5 La courbe des radicaux libres hydroxyles de récupération
On peut voir sur la figure 3.5 que dans la plage de concentration présentée dans l'expérience, la capacité de piégeage des radicaux libres hydroxyle des enzymes dans le groupe expérimental et le groupe témoin ont augmenté avec l'augmentation de la quantité ajoutée. La capacité de piégeage des radicaux libres hydroxyle du groupe expérimental était inférieure à celle du groupe témoin, et elle a très mal performé à de faibles concentrations. À des concentrations élevées, la capacité de piégeage des radicaux libres hydroxyle a considérablement augmenté. La raison peut être que pendant le processus de fermentation, les types et le contenu des micro-organismes dans les enzymes de pomme dans le groupe expérimental et le groupe témoin étaient différents, et le contenu des métabolites secondaires et des composants de chaque produit produit par la fermentation était différent, de sorte que la capacité antioxydante montrée était différente.
3.2.5 DPPH · Capacité de piégeage des radicaux libres
Par rapport à d'autres méthodes de détection, la capacité de piégeage des radicaux libres DPPH est largement utilisée pour évaluer l'activité antioxydante en peu de temps [59]. La capacité de piégeage des radicaux DPPH · à différentes concentrations a été tracée en fonction des résultats du groupe témoin et des enzymes de pomme du groupe expérimental, comme le montre la figure 3.6.
Comme le montre la figure 3.6, lorsque la concentration de l'enzyme de pomme de groupe témoin était inférieure à 30%, la capacité de piégeage des radicaux DPPH · de DPPH · était inférieure à 50%, mais l'enzyme de pomme du groupe expérimental a également montré une capacité de piégeage de radicaux libres DPPH plus élevée à de faibles concentrations. Les résultats expérimentaux montrent que l'ajout d'Aspergillus oryzae, de levure, de streptococcus thermophile et de lactobacillus bulgare est bénéfique pour la capacité de piégeage des radicaux libres DPPH · de l'enzyme. Lorsque la concentration enzymatique est de 50%, cette capacité est aussi élevée que 91,4%, ce qui est beaucoup plus élevé que les 69,8% du groupe témoin à la même concentration.
3.2.6 Abts Capacité de piégeage radical
Les résultats de la capacité de piégeage des radicaux ABTS des enzymes de pomme dans le groupe témoin et le groupe expérimental à différentes concentrations sont présentés sur la figure 3.7.
Fig.3.7 La courbe de la capacité de piégeage des radicaux abts
On peut voir sur la figure 3.7 que le taux de piégeage des enzymes de pomme dans le groupe expérimental est plus élevé lorsque la quantité d'addition enzymatique est supérieure à 5 μl. L'étude d'Erel et al. ont montré que la capacité de piégeage des radicaux ABTS dépend en grande partie de la concentration plus élevée de substances phénoliques [60]. Les résultats de la détermination totale du contenu du phénol ont montré que la teneur totale au phénol du groupe expérimental était supérieure à celle du groupe témoin. Les résultats expérimentaux de la Fig. 3.7 ont juste vérifié que la capacité de piégeage des radicaux ABTS est supérieure à celle du groupe témoin.
3.3 Résumé de ce chapitre
Ce chapitre étudie la relation entre l'activité antioxydante des enzymes de pommes produites par fermentation avec quatre souches de pommes sélectionnées, la concentration d'échantillons enzymatiques et la comparaison des composants actifs antioxydants et la capacité de piégeage des radicaux libres entre le groupe expérimental et le groupe témoin. Les résultats expérimentaux montrent que la teneur en phénol totale de l'enzyme de pomme dans le groupe témoin est inférieure à celle du groupe expérimental, et sa puissance réductrice, la capacité de piégeage des radicaux libres de superoxyde d'anion, DPPH Free Radical et Abts Free Radical est meilleure que celles du groupe témoin; L'enzyme du groupe témoin a une capacité de piégeage particulièrement bonne pour les radicaux libres hydroxyles.
En général, le groupe expérimental a montré une activité antioxydante plus élevée, ce qui a en outre confirmé la faisabilité de l'ajout artificiellement des souches pour fabriquer des enzymes microbiennes. De cette façon, les aliments enzymatiques microbiens ont plus de substances bénéfiques pour la santé humaine sur la base de la fermentation naturelle d'origine et peuvent mieux se développer dans la direction attendue par les personnes.
