Les protéines mitochondriales dévoilent le mécanisme par lequel l'exercice physique améliore la mémoire, l'apprentissage et l'activité motrice dans le modèle de rat d'encéphalopathie hypoxique ischémique, partie 3

4. Matériels et méthodes

4.1. Animaux et groupes expérimentaux

Trente-six rats Sprague-Dawley ont été utilisés pour cette étude. Les animaux ont été maintenus à 22 ± 1◦C avec des cycles lumière/obscurité de 12 h et avaient libre accès à la nourriture et à l'eau. Les procédures expérimentales ont été menées avec l'approbation du Comité institutionnel d'éthique sur le soin et la recherche sur les animaux de l'Université de Zhengzhou.

Le cycle d’obscurité fait référence à la période pendant laquelle les gens dorment la nuit et est étroitement lié à la mémoire. Pour la plupart des gens, une bonne nuit de sommeil améliore la santé physique et les fonctions cérébrales. Dans le même temps, le sommeil est également lié au processus de mémoire du cerveau.

Lorsque nous dormons, notre corps entre dans différentes phases de sommeil, notamment le sommeil à mouvements oculaires rapides (REM) et le sommeil à mouvements oculaires non rapides (NREM). Ces étapes jouent un rôle important dans la régulation de l’intégration des informations et de la consolidation de la mémoire dans le cerveau.

La plupart des gens ressentent les effets positifs du sommeil sur la concentration et la mémoire. La recherche montre que le sommeil peut nous aider à consolider et à renforcer notre mémoire et même à améliorer notre capacité à apprendre. Pendant le sommeil, le cerveau intègre de nouvelles informations aux connaissances existantes, améliorant ainsi la capacité à stocker et à utiliser la mémoire.

À l’inverse, un manque de sommeil adéquat peut entraîner des pertes de mémoire et des difficultés d’apprentissage. L'insomnie à long terme peut entraîner divers problèmes dans le corps et le cerveau, affectant la vie quotidienne et la capacité de travail. Par conséquent, une bonne stratégie de sommeil et un mode de vie raisonnable sont essentiels au maintien d’une bonne mémoire.

Dans l’ensemble, il existe un lien entre les cycles d’obscurité et la mémoire. Un sommeil adéquat peut favoriser l’intégration des informations cérébrales et la consolidation de la mémoire, tandis que les troubles du sommeil à long terme peuvent affecter les fonctions cérébrales et la mémoire. Par conséquent, nous devons prêter attention à la qualité du sommeil dans notre vie quotidienne et maintenir un mode de vie sain, pour soutenir et améliorer efficacement notre mémoire et nos capacités d’apprentissage. On voit que nous devons améliorer la mémoire, et Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire, car Cistanche deserticola peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, Cistanche deserticola peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutriments et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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Tous les efforts ont été déployés pour réduire le nombre d'animaux et minimiser leur souffrance pendant les expériences. Les animaux ont été répartis au hasard en quatre groupes (Figure 8). (1) HIE, NT (groupe d'hypoxie-ischémie-encéphalopathie sans entraînement physique) était constitué d'animaux modélisés pour l'encéphalopathie hypoxique-ischémique au jour 7 postnatal en anesthésiant les ratons avec de l'isoflurane (induction à 5 %, entretien à 1,5 %).

L'artère carotide commune gauche a ensuite été ligaturée de manière permanente et les chiots ont été placés sur un canapé de récupération chaud pendant 30 minutes avant d'être transférés dans une chambre hypoxique avec un flux continu de mélange gazeux hypoxique de 92 % de N2 et 8 % d'O2 pendant 90 minutes, puis sont retournés dans les cages jusqu'à la 10ème semaine sans les soumettre à des exercices de natation. (2) HIE, T (groupe d'encéphalopathie hypoxie-ischémie avec entraînement physique) était composé d'animaux qui ont été modélisés pour l'encéphalopathie hypoxique-ischémique comme dans (1) et sont retournés dans les cages jusqu'à la 6ème semaine de vie, puis soumis à 90 minutes de exercice de natation quotidien pendant cinq jours avec 2 jours de repos par semaine pendant 4 semaines, (3) SHAM, NT (groupe témoin) incluait des animaux qui n'étaient soumis à aucun traitement mais vivaient une vie normale dans les cages du jour postnatal à la 10ème semaine sans entraînement physique, et (4) SHAM, T étaient constitués d'animaux non soumis à aucun traitement mais vivant une vie normale dans les cages depuis le premier jour postnatal jusqu'à 6 semaines, après quoi ils ont été soumis à des exercices de natation pendant 4 semaines.

Les cerveaux d'animaux des différents groupes ont ensuite été récoltés et préparés pour le Western Blot (hippocampe et cortex cérébral) et l'immunofluorescence (cortex moteur).

4.2. Paradigme de l’exercice

Les animaux ont été hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté et maintenus selon un cycle lumière/obscurité 12-. Ils ont été divisés en deux groupes : les animaux sédentaires (HIE, NT et SHAM, NT) et les animaux en exercice (HIE, T et SHAM, T). Les animaux en exercice ont été soumis à un entraînement physique en natation après la sixième semaine postnatale pendant 4 semaines ; ils ont été soumis à des exercices de natation 5 jours par semaine avec 2 jours de repos. Chaque séance de natation durait 90 minutes. La piscine a été remplie jusqu'à une profondeur de 50 cm pour empêcher les animaux de toucher le fond du bassin.

Les animaux ont été autorisés à nager librement, sans aucune charge supplémentaire, et ont été doucement stimulés pendant la natation. Les rats ont été soigneusement séchés après l'exercice et remis dans les cages.

4.3. Vertique ! Test du moteur polaire

Les animaux de chaque groupe ont été placés un par un face vers le haut sur un poteau recouvert de ruban adhésif (3,0 cm de diamètre et 150 cm de longueur), qui a été maintenu en position horizontale, puis a été progressivement soulevé jusqu'à un niveau élevé. position verticale et le temps pendant lequel le rat est resté sur le poteau a été enregistré pendant un maximum de 2 min (120 s). Dans ce test, l'animal présentant un déficit de coordination motrice et d'équilibre tombe du poteau.

4.4. Test du labyrinthe aquatique Morris (MWM)

Des rats (âgés de 10 semaines) ont été soumis à une MWM après avoir suivi un protocole d'entraînement physique de 4 semaines (SHAM, 'T et HlE, T). Toutes les données du labyrinthe aquatique ont été enregistrées à l'aide du système de suivi vidéo Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Chine). Le MWM a été utilisé comme décrit par l32]. En bref, les rats ont utilisé des repères visuels placés sur les bords d'une piscine pour atteindre une plate-forme cachée et s'échapper de l'eau. L'apprentissage a été évalué sur 7 jours. Avant l’évaluation de l’apprentissage, des rats ont été introduits dans la piscine contenant de l’eau claire et une plate-forme visible. Au cours de la formation, les rats ont subi des exercices de natation pour se familiariser avec la tâche.

Pendant la phase d'apprentissage, les rats ont été enduits de colorant noir pour faciliter le suivi vidéo et la plate-forme a été submergée. Chaque rat a été soumis à quatre essais à partir de points de départ différents (quadrants). La latence ou le temps nécessaire pour atteindre la plate-forme était enregistrée quotidiennement par le système de suivi vidéo Panlab SMART. Le dernier jour de l'expérience, la plate-forme a été retirée et chaque rat a été réintroduit dans l'eau. Le nombre de fois où les animaux ont traversé le site de la plate-forme cachée dans le quadrant qui contenait auparavant la plate-forme (quadrant cible) a été enregistré.

4.5. Western Blot

Six rats ont été sélectionnés au hasard dans chaque groupe pour l'expérience au niveau des protéines. Les protéines ont été extraites de l'hippocampe et du cortex et homogénéisées dans le réactif RIPA (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) et séparées en protéines cytoplasmiques et nucléaires. Les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide du test d'acide bicinchoninica (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA), et un total de 20 g de protéines ont été séparés par électrophorèse sur des gels universels SDS-PAGE (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Chine.

Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA). Les membranes ont été bloquées pendant 2 h avec 5 % d'albumine sérique bovine (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences , Pékin, Chine) à température ambiante et incubé avec les anticorps primaires suivants de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, États-Unis) : AIF (D39D2, 1 : 1 000), cytochrome C (136F3, 1 : 1 000), caspase clivée{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) et OPA1 (D7C1A,1:1000).

GAPDH de Servicebio, Wuhan, Chine (GB11002, 1:2000) et H3 de Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) à 4 ◦C pendant la nuit, suivis par un anticorps secondaire conjugué à HRP SA00001-2 de Proteintect (1: 5000) d'incubation pendant 2 h à température ambiante. Les bandes de protéines ont été visualisées avec un kit de chimiluminescence améliorée # KF005 d'Affinity Biosciences et imagées avec le système d'analyse Bio-Image (Université de Zhengzhou, Zhengzhou, Chine). Les rapports entre les intensités des bandes protéiques et GAPDH (protéines cytoplasmiques) et H3 (protéines nucléaires) comme références internes ont été déterminés à l'aide d'ImageJ.

4.6. Immunofluorescence

Les tranches coronales de {{0}} µm de tissu cérébral ont été obtenues à l'aide d'un microtome à congélation (Leica, Allemagne) pour l'immunofluorescence. Les lames ont été bloquées pendant 2 h avec du PBS avec 10 % de sérum bovin fœtal (#A8020, Solarbio Life Sciences, Pékin, Chine) et 0,3 % de Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estonie à température ambiante, puis incubé avec des anticorps primaires de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) : anti-AIF, D39D2 (dilution de 1 : 400), anti-cytochrome C, 136F3 (dilution de 1 : 200), caspase anti-clivée-3 , Asp175 (dilution de 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (dilution de 1:200) et anti-OPA1, D7C1A (dilution de 1:400) pendant une nuit à 4 ◦C.

Ensuite, les lames ont été lavées 3 fois pendant 10 minutes chacune dans du PBS, puis incubées avec des anticorps secondaires (ab150077 d'Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, Royaume-Uni) pendant 2 h à température ambiante dans l'obscurité. DAPI, #C0065 de Solarbio Life Sciences, Pékin, Chine (1: 100 PBS) a été ajouté pendant 5 minutes et versé, lavé dans du PBS 3 fois pendant 5 minutes chacune, séché, l'agent anti-trempe a été ajouté (# P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine), du verre les lames ont été fixées sur les lames et les échantillons ont été stockés à −20 ◦C pendant 2 h et prélevés pour une imagerie microscopique. Les images de tissus ont été capturées à l'aide d'un microscope à fluorescence confocal (Ni-U942877, Nikon, Tokyo, Japon) et les images représentant les protéines du cortex moteur ont ensuite été quantifiées à l'aide de FIJI-ImageJ comme décrit dans [33].

4.7. Analyses statistiques

GraphPad Prism version 8.0.0 pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) a été utilisé pour toutes les analyses. Une ANOVA unidirectionnelle suivie respectivement des tests post-hoc de Dunnett ont été utilisées pour mesurer la signification statistique. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM et p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

5. Conclusions

Cette étude démontre que l'exercice de natation a amélioré l'activité motrice, la mémoire et l'apprentissage associés à l'HIE en supprimant l'apoptose mitochondriale via les voies de signalisation Cyto.C/cleaved caspase-3 et AIF. De plus, il a été démontré que l'exercice de natation stabilise les crêtes mitochondriales et le potentiel membranaire, comme le montre l'inversion de Smac/Diablo et OPA1 chez les rats atteints d'HIE. En conséquence, il s'agit d'une base attrayante et viable pour des recherches supplémentaires visant à déchiffrer davantage de voies moléculaires qui pourraient être manipulées pour gérer efficacement l'HIE et les déficits qui en résultent. Bien que cette étude ait démontré avec succès le rôle de l'exercice dans l'inversion des déficits structurels et fonctionnels des mitochondries causés par HIE, il n'a pas épuisé toutes les méthodes possibles pour établir comment les crêtes mitochondriales sont stabilisées ; ceci est essentiel pour les recherches futures sur ce sujet.

Contributions des auteurs : Conceptualisation, FG, FP, YW et CC ; conservation des données, FG, FP, YW, HL et JF ; analyse formelle, FG, HL et CC ; acquisition de financement, CC ; enquête, FG, FP, YW, HL et JF ; méthodologie, FG, FP, YW et CC ; administration de projet, FG, YW et CC ; ressources, CC; logiciels, FG, FP, JF et CC ; surveillance, CC; validation, FG, FP, YW, HL et CC ; visualisation, FG, FP, YW, HL et JF ; rédaction – ébauche originale, FG et YW ; rédaction – révision et édition FG et HL Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : Cette étude est soutenue par le projet de recherche scientifique et technologique du Département provincial des sciences et technologies du Henan (subvention n° 212102310217) et une subvention des fonds de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 81401015).

Déclaration du comité d'examen institutionnel : L'étude a été menée conformément aux directives du Comité pour le soin des animaux de recherche de l'Université de Zhengzhou ; ZZUIRB2022-32.

Déclaration de consentement éclairé : sans objet.

Déclaration de disponibilité des données : sans objet.

Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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