Avantages neuroprotecteurs de l'exercice et de MitoQ sur la fonction de mémoire, la dynamique mitochondriale, le stress oxydatif et la neuroinflammation chez les rats vieillissants induits par le D-galactose, partie 2

2.6. Préparation des tissus

Après avoir effectué 8 semaines de tests de TE et de comportement de mémoire, tous les rats ont été euthanasiés par inhalation de CO2 et des tissus cérébraux ont été prélevés sur 7 animaux de chaque groupe de traitement.

Le test de comportement de la mémoire est un outil efficace pour évaluer la mémoire. Avec la pression sociale et professionnelle croissante, la mémoire des gens devient de plus en plus importante. Par conséquent, passer un test de comportement de mémoire peut nous aider à comprendre notre niveau de mémoire et à prendre des mesures efficaces pour améliorer et maintenir notre mémoire en fonction des résultats du test.

Plus précisément, les tests de comportement de mémoire peuvent évaluer la capacité des personnes à recevoir, traiter, stocker et récupérer des informations. En testant différents types d'informations telles que la langue, les chiffres, les images, etc., la mémoire des personnes peut être entièrement testée. Les résultats du test fourniront différents scores pour nous aider à comprendre nos faiblesses et nos forces, et comment renforcer notre mémoire.

En pratique, de nombreux tests de comportement en matière de mémoire fournissent également des conseils et des suggestions professionnels. Par exemple, un bon sommeil, une alimentation équilibrée, une activité physique adéquate et des exercices cérébraux réguliers sont tous bénéfiques pour améliorer la mémoire des gens. Grâce à ces méthodes, nous pouvons améliorer notre temps de rétention de la mémoire, notre capacité de reproduction de la mémoire et d'autres aspects, afin de mieux nous adapter aux besoins de la vie quotidienne ou du travail.

Bref, un test de comportement mnésique est très utile pour comprendre, évaluer et améliorer sa mémoire. Nous devons également adopter des méthodes appropriées pour renforcer notre mémoire en fonction de notre situation réelle, afin de jeter les bases solides d'une vie plus épanouissante et plus riche. On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et le Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire car le Cistanche est une matière médicinale traditionnelle chinoise avec de nombreux effets uniques, dont l'un est d'améliorer la mémoire. L'effet du Cistanche provient des différents ingrédients actifs qu'il contient, notamment l'acide tannique, les polysaccharides, les glycosides flavonoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent favoriser la santé cérébrale de diverses manières.

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Après avoir séparé le cortex cérébral et l'hippocampe, le tissu cérébral a été congelé dans de l'azote liquide et conservé à -80 ◦C jusqu'à l'analyse. Les 5 animaux restants ont été utilisés pour l'analyse immunohistochimique (IHC).

Après ouverture de la cavité thoracique, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 50 mM a été passée dans le ventricule gauche pendant 10 min, puis l'animal a été perfusé avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans 100 mM de PBS.

Après fixation par perfusion, le cerveau a été récolté, placé dans du PFA à 4 % et fixé pendant 4 h à 4 °C. Le tissu cérébral fixé a été immergé dans une solution à 30 % de saccharose pendant 2 jours, puis coupé en tranches de 40 µm d'épaisseur à l'aide d'un cryostat ( Leica Microsystems, Nussloch, Allemagne).

2.7. Isolement des mitochondries

Pour isoler les mitochondries, nous avons utilisé un kit d'extraction de mitochondries (IMGENEX Corporation, San Diego, Californie, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Pour chaque 100 mg de tissu hippocampique, 1 ml de tampon homogénéisant a été ajouté.

Après homogénéisation, le tissu a été centrifugé à 900 × g pendant 10 min à 4 ◦C, et le surnageant a été collecté et centrifugé à nouveau à 15,000× g pendant 30 min à 4 ◦C.

En prenant la fraction cytosolique centrifugée, le cytosol a été séparé et le culot restant a été soigneusement mélangé dans 1 ml de tampon de suspension, avant de centrifuger à 15,000× g pendant 10 min à 4 ◦C.

Le surnageant a été retiré et 1 ml supplémentaire de tampon de suspension a été ajouté avant de bien mélanger et de centrifuger à nouveau à 15,000× g pendant 10 min à 4 ◦C.

Le surnageant a été retiré et le culot restant a été dissous dans 1 ml de tampon de lyse mitochondriale complète pendant 30 min à 4 °C. L'extrait mitochondrial a ensuite été centrifugé à 15,000× g pendant 5 min à 4◦C, et le surnageant (fraction mitochondriale) a été collecté.

2.8. Western Blot
La protéine totale obtenue par isolement mitochondrial a été quantifiée selon la méthode de Bradford. Une quantité égale de protéines mitochondriales (30 µg par piste) a été chargée sur une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) (8 % ou 12 %).

Après électrophorèse, les protéines ont été transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA).

Le blocage a été effectué pendant 1 heure à température ambiante en utilisant une solution saline tamponnée 1 × Tris contenant du Tween -20 (TBS-T) avec 5 % de BSA, puis la membrane a réagi avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C.

Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase et -actine (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, dilution : 1 :1000); et TNF- (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni, dilution : 1 : 1000).

Les membranes ont ensuite été lavées avec un tampon de lavage (PBS avec 0,1 % de Tween 20), après quoi elles ont été incubées avec des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pour p22 phox, gp91 phox et TNF. - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, dilution : 1:5000).

Des anticorps secondaires de chèvre anti-souris conjugués à la HRP ont été utilisés pour Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalase et -actine (Santa Cruz Biotechnology, dilution : 1 : 5000).

Les niveaux d'expression des protéines ont été détectés à l'aide du système de détection par transfert Western ECL (Santa Cruz Biotechnology). Les densités des bandes de protéines développées ont été analysées à l'aide du système d'imagerie sur gel ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.9. Immunohistochimie (IHC)
Pour l'analyse IHC, la méthode flottante a été utilisée pour le tissu sélectionné dans chaque groupe de traitement. Après avoir lavé le tissu 3 fois pendant 10 min chacun dans du PBS 0,01 M, le tissu a été incubé à 80 ◦C pendant 60 min dans un bécher contenant du citrate de sodium 0,01 M, suivi d'un blocage dans 10 % sérum d'âne normal (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).

L'échantillon de tissu a ensuite été mis à réagir avec des anticorps primaires anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, dilution : 1 : 500) et une protéine acide fibrillaire anti-Glial (GFAP) (Abcam, dilution : 1 : 500) pendant 12 h à 4 ◦C. Le jour suivant, le tissu a été lavé 3 fois pendant 5 minutes chacune dans du PBS 0,01 M, puis mis à réagir avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à la HRP (Santa Cruz Biotechnology, dilution : 1 : 5000) à température ambiante pendant 2 h.

Enfin, le tissu a été incubé à température ambiante à l'aide d'une solution du kit Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), et les résultats ont été visualisés à l'aide du kit de substrat DABPeroxydase (Vector Laboratories).

Chaque tranche de tissu a été montée sur une lame à l'aide d'un milieu de montage (Vector Laboratories) et inspectée à l'aide d'un microscope optique (Leica Microsystems).

2.10. Analyses statistiques

Les données ont été analysées à l'aide de SPSS pour Windows version 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, États-Unis). Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle. Des tests post hoc de Bonferroni ont été utilisés pour des comparaisons multiples. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à p < 0,05.

3. Résultats

3.1. Effets de l'exercice sur tapis roulant et de MitoQ sur l'expression de protéines liées à la dynamique mitochondriale dans l'hippocampe de rats vieillissants induits par D-Gal

Nous avons vérifié que TE et MitoQ affectaient les facteurs liés à la fusion mitochondriale (Mfn1, Mfn2, Opa1) et aux facteurs liés à la fission (Drp1, Fis1) dans l'hippocampe de rats vieillissants (Figure 1).

Les niveaux d'expression des facteurs liés à la fusion mitochondriale différaient significativement entre les groupes de traitement (Mfn1, F4,34=134,750, p < 0,001 ; Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0,001 ; Opa1, F4, 34=51.456, p=0.001).

Les niveaux d'expression des facteurs liés à la fission mitochondriale différaient également de manière significative entre les groupes de traitement (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001 ; Fis1, F4,34=116 .313, p < 0,001). Les résultats des tests post hoc sont présentés dans la figure 1.

Par rapport au groupe Y-CON, l'expression des facteurs liés à la fusion mitochondriale a diminué dans le groupe D-CON et a montré des tendances à la hausse dans les groupes D-TE, D-MI et D-COMBI.

D'autre part, l'expression du facteur Drp1 lié à la fission mitochondriale a augmenté dans le groupe D-CON par rapport au groupe Y-CON. Bien que les signaux de fission mitochondriale aient été diminués par le traitement combiné avec le TE, le traitement MitoQ seul n'a pas induit de changement significatif.

L'autre facteur lié à la fission mitochondriale, Fis1, a démontré les mêmes tendances à la baisse que Drp1, mais a également été diminué par le traitement MitoQ seul.

Figure 1. Effet de l'exercice sur tapis roulant et de la mitoquinone (MitoQ) sur l'expression de protéines liées à la dynamique mitochondriale dans l'hippocampe de rats vieillissants induits par le D-galactose (D-gal). (A) Western blots représentatifs de protéines liées à la fusion mitochondriale et à la fission. (B – F) Analyse densitométrique des bandes de Western blot normalisées à -Actine. Les données présentées dans le Western blot sont des moyennes provenant de sept cerveaux de rats.

-Actin a été étudié en tant que contrôle interne. Le test post hoc de Bonferroni a été utilisé après l'ANOVA. Les valeurs sont des moyennes ± SEM.

a Dénote une différence statistique par rapport au groupe de contrôle des jeunes (Y-CON). b Désigne une différence statistique par rapport au groupe D-galactose (D-CON). c Dénote une différence statistique par rapport au groupe D-galactose plus exercice sur tapis roulant (D-TE).

d Indique une différence statistique par rapport au groupe D-galactose plus MitoQ (D-MI) (p < 0,05). D-COMBI; D-galactose plus groupe TE et MitoQ.

3.2. Effets de l'exercice sur tapis roulant et de MitoQ sur l'expression des sous-unités de NADPH oxydase dans le cortex cérébral et l'hippocampe de rats vieillissants induits par D-Gal

Nous avons observé des différences significatives entre les groupes de traitement dans l'immunoréactivité du phox p22 dans le cortex cérébral et l'hippocampe des rats vieillissants (Figure 2) (CA3, F4,24=18,786, p < 0.{{11 }}01 ; cortex, F4,24=12.662, p < 0,001).

Dans le cortex, le groupe D-CON a montré une immunoréactivité accrue de p22 phox par rapport au groupe Y-CON, qui a diminué de manière significative dans les groupes D-TE, D-MI et D-COMBI.

Dans CA3, l'immunoréactivité accrue de p22 phox a été diminuée dans les groupes D-TE et D-COMBI par rapport à D-CON. Les niveaux d'expression protéique des sous-unités NOX p22 phox, gp91 phox et p47phox différaient significativement entre les groupes (p22 phox, F4,{{10}}.513, p < 0.{{24} }01 ; gp91 phox, F4,34=57,282, p < 0,001 ;

Les résultats du post-hoctest ont montré une augmentation significative des niveaux de sous-unités NOX dans le D-CON par rapport au Y-CON. Cependant, les niveaux de sous-unités NOX étaient inférieurs dans tous les groupes d'intervention par rapport au groupe D-CON.

En particulier, l’expression de p22 phox et gq91 phox était significativement diminuée dans le groupe D-TE par rapport au groupe D-MI. Ces résultats impliquent que l’exercice et MitoQ préviennent individuellement le stress oxydatif induit par le vieillissement dans le cerveau, mais que leur combinaison n’entraîne aucun effet supplémentaire.

Figure 2. Effets de l'exercice sur tapis roulant et de MitoQ sur l'expression des sous-unités de NADPH oxydase dans le cortex cérébral et l'hippocampe de rats vieillissants induits par D-gal. (A1) Photomicrographies montrant l'immunoréactivité NAPDH p22 phox dans le cortex cérébral et l'hippocampe des rats vieillissants induits par D-gal dans chaque groupe. Les rectangles noirs en A1 indiquent la partie des images comme indiqué dans f – i et p – t. (A2, A3) Quantification de la densité optique de la coloration NADPH p22 phox dans le cortex cérébral et l'hippocampe.

Test post hoc de Bonferroni après ANOVA. Les valeurs sont présentées sous forme de moyennes ± SEM. (n=5 animaux). (a–e et k–o) Barre d'échelle=100 µm, (f–j et p–t) Barre d'échelle=50 µm. (B) Images représentatives de transfert Western pour les sous-unités de NADPH oxydase dans l’hippocampe.

(C – E) Quantification des sous-unités de NADPH oxydase dans l’hippocampe. Les données présentées dans le Western blot étaient des moyennes provenant de sept cerveaux de rats. -Actin a été étudié en tant que contrôle interne. Le test post hoc de Bonferroni a été utilisé après ANOVA. Les valeurs sont des moyennes ± SEM.

a Désigne une différence statistique par rapport au groupe Y-CON. b Dénote une différence statistique par rapport au groupe D-CON. c Dénote une différence statistique par rapport au groupe D-TE. (p < 0,05).

3.3. Effet de l'exercice sur tapis roulant et de MitoQ sur l'expression de GFAP dans le cortex cérébral et le gyrus denté de l'hippocampe de rats vieillissants induits par D-Gal

Nous avons observé des différences significatives entre les groupes de traitement en termes d'immunoréactivité GFAP dans le cortex cérébral et le gyrus denté de l'hippocampe (DG) de rats vieillissants (Figure 3)(Cortex, F4,24=13.524, p < 0.001. ;DG, F4,24=30.364).

Les résultats du test post-hoc ont montré que le traitement par D-gal augmentait de manière significative l'immunoréactivité de la GFAP dans le cortex et la DG.

Par rapport au groupe D-CON, les niveaux de GFAP dans le cortex ont diminué dans tous les groupes d'intervention et les niveaux de GFAP dans DG ont diminué dans les groupes D-TE et D-COMBI, tandis que le groupe D-MI a montré des différences dans l'immunoréactivité de GFAP uniquement. dans la région du cortex.

Ainsi, bien que le traitement par TE ou MitoQ ait réduit la neuroinflammation induite par la D-gal dans le cortex, seule l'intervention par TE a produit des effets positifs sur la DG.

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